JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 3:24 Min. • April 30th, 2023
- Bromodeoxyuridin oder BrdU ist ein synthetisches Thymidin-Nukleosid-Analogon. Während der Synthesephase des Zellzyklus substituiert BrdU Thymidin und integriert sich in die neu synthetisierte DNA. Das eingebaute BrdU ermöglicht die Verfolgung des Zellzyklusverlaufs. Um das eingebaute BrdU zu erkennen, fixieren und permeabilisieren Sie zunächst die Zellen, um sie durchlässig zu machen.
Als nächstes behandeln Sie die Zellen mit dem DNAse-Enzym, um die DNA-Stränge zu spalten und das eingebaute BrdU freizulegen. Anschließend fügen Sie einen geeigneten fluoreszenzmarkierten Anti-BrdU-Antikörper hinzu. Der Antikörper dringt in den Zellkern ein und bindet leicht an das exponierte BrdU, das in der DNA vorhanden ist.
Behandeln Sie die Zellen zusätzlich mit einem geeigneten fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff. Der Farbstoff bindet an die DNA und ermöglicht so die Quantifizierung des gesamten DNA-Gehalts. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Fluoreszenz sowohl von markiertem BrdU als auch von DNA zu detektieren.
Die Fluoreszenzintensitäten der markierten DNA unterscheiden Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen basierend auf der Variation des Gesamt-DNA-Gehalts. Das Fluoresz
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