BrdU-Immunfluoreszenzfärbung: Eine Technik zur Identifizierung von Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus

- Bromodeoxyuridin oder BrdU ist ein synthetisches Thymidin-Nukleosid-Analogon. Während der Synthesephase des Zellzyklus substituiert BrdU Thymidin und integriert sich in die neu synthetisierte DNA. Das eingebaute BrdU ermöglicht die Verfolgung des Zellzyklusverlaufs. Um das eingebaute BrdU zu erkennen, fixieren und permeabilisieren Sie zunächst die Zellen, um sie durchlässig zu machen.

Als nächstes behandeln Sie die Zellen mit dem DNAse-Enzym, um die DNA-Stränge zu spalten und das eingebaute BrdU freizulegen. Anschließend fügen Sie einen geeigneten fluoreszenzmarkierten Anti-BrdU-Antikörper hinzu. Der Antikörper dringt in den Zellkern ein und bindet leicht an das exponierte BrdU, das in der DNA vorhanden ist.

Behandeln Sie die Zellen zusätzlich mit einem geeigneten fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff. Der Farbstoff bindet an die DNA und ermöglicht so die Quantifizierung des gesamten DNA-Gehalts. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Fluoreszenz sowohl von markiertem BrdU als auch von DNA zu detektieren.

Die Fluoreszenzintensitäten der markierten DNA unterscheiden Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen basierend auf der Variation des Gesamt-DNA-Gehalts. Das Fluoreszenzsignal von BrdU identifiziert die aktuelle Zellzyklusposition von BrdU-inkorporierten Zellen.

In diesem Beispiel führen wir die BrdU-Immunfluoreszenzfärbung von NALM-6-- akuten lymphatischen Leukämiezellen durch.

- Behandeln Sie die Zellen vor der Antikörperfärbung mit DNAse. Die Zellen werden in 100 Mikrolitern DNAse-Lösung resuspendiert und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer hinzu, zentrifugieren Sie die Zellen und verwerfen Sie den Überstand. Die Antikörperfärbung für andere intrazelluläre Marker als BrdU kann gleichzeitig mit der BrdU-Färbung durchgeführt werden.

- Es ist wichtig, Kompensationskontrollen vorzubereiten, die aus ungefärbten Zellen und Zellen bestehen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom markiert sind. Im Idealfall verwenden Sie für die Kompensationskontrolle die gleichen Antikörper wie in den Versuchsröhrchen.

- Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern Waschpuffer mit einem Mikroliter pro 10 an die 6 Zellen des BrdU-Antikörpers. Wenn Antikörper gegen andere spezifische intrazelluläre Antigene verwendet werden, sollten diese an dieser Stelle hinzugefügt werden. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen nach 20 Minuten mit einem Milliliter Waschpuffer, wie zuvor gezeigt. Zum Schluss färben Sie die DNA für die Zellzyklusanalyse. Lösen Sie das Pellet, indem Sie das Röhrchen schnippen und fügen Sie 20 Mikroliter der 7-AAD-Lösung hinzu. Es ist wichtig, eine konstante Menge an 7-AAD pro Zelle zu verwenden. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Färbepuffer. Führen Sie anschließend eine durchflusszytometrische Analyse durch.