2D-Co-Kultur von leukämischen Zellen mit BMSCs: Eine Methode zur Gewinnung von Subpopulationen leukämischer Zellen

- In einem 2D-Co-Kultursystem werden mehrere Zelltypen in flachen Kulturplatten zusammen gezüchtet. Dieses Kultursystem ermöglicht die Untersuchung von Zellinteraktionen und -verhalten in vitro. Um eine leukämische Zell-Co-Kultur mit Knochenmark-Stromazellen (BMSCs) zu etablieren, fügen Sie einer adhärenten Monolayer-Kultur von BMSCs eine leukämische Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie die Platte unter geeigneten Kulturbedingungen. Behalten Sie die Co-Kultur bei, indem Sie jeden vierten Tag 90 % des Nährmediums austauschen.

Während dieser 2D-Co-Kultur interagieren die leukämischen Zellen mit den BMSCs und lokalisieren sich in unterschiedlichen Regionen der Kultur, wodurch drei Subpopulationen gebildet werden. Die Phasenkontrastmikroskopie ermöglicht die visuelle Unterscheidung der drei Subpopulationen. Die erste Gruppe von Leukämiezellen, die frei im Medium zu schweben scheint, wird als suspendierte Zellen kategorisiert. Die zweite Gruppe von Leukämiezellen, die an der Oberfläche der BMSC-Monoschicht haften, erscheint hell und wird als phasenhelle Zellen kategorisiert.

Die dritte Gruppe von Leukämiezellen, die unter die Monoschicht gewandert sind, erscheint dunkel und wird als phasenschwache Zellen kategorisiert. Im folgenden Protokoll führen wir die Co-Kultur von akuter lymphatischer Leukämie oder ALL-Zellen mit menschlichen Knochenmarkstromazellen durch.

- Beginnen Sie mit der Aussaat von 5 bis 20 mal 10 bis zum sechsten Leukämiezellen in 10 Millilitern tumorspezifischem Kulturmedium auf eine 100-Millimeter-Platte mit 80 % bis 90 % konfluenten Knochenmarkstromazellen oder Osteoblasten. Kippen Sie die Platte jeden vierten Tag zur Seite und saugen Sie alle bis auf 1 Milliliter des Mediums ab, wobei Sie darauf achten, die anhaftende Zellschicht nicht zu stören. Geben Sie dann vorsichtig 9 Milliliter frisches leukämisches Zellkulturmedium tropfenweise in die Ecke der Platte an der Seite, um eine minimale Störung der adhärenten Zellen zu gewährleisten.

Nach dem 12. Tag der Co-Kultur pipettieren Sie das Kulturmedium etwa 5 bis 10 Mal vorsichtig auf und ab über die Platte, um die schwebenden leukämischen Zellen zu sammeln, und übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Dann säen Sie die Zellen auf eine neue Platte aus 80 % bis 90 % konfluenten Knochenmarkstromazellen oder Osteoblasten, wie gerade gezeigt. Bis zum 4. Tag werden sich drei Subpopulationen von Leukämiezellen gebildet haben, wobei die suspendierten Leukämiezellen frei im Medium schweben, die phasenhellen Leukämiezellen an der Oberfläche der adhärenten Zellmonoschicht haften und die phasenschwachen Leukämiezellen unter die Monoschicht wandern.