Retroorbitale Blutentnahme: Eine Methode zur Isolierung mononukleärer Zellen aus dem retroorbitalen Sinus einer Maus
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:18 Min. • April 30th, 2023
- Halten Sie zuerst eine betäubte Maus am Hals und strecken Sie das Auge hervor. Führen Sie ein feines Kapillarrohr in den medialen Canthus des Auges ein. Lassen Sie das Blut durch Kapillarwirkung in einen Schlauch fließen. Füllen Sie das Blut in ein EDTA-beschichtetes Röhrchen und halten Sie es auf Eis. EDTA bindet die Kalziumionen und verhindert so die Blutgerinnung. Eine niedrigere Temperatur reduziert die glykolytische Aktivität der Zellen und die Wahrscheinlichkeit einer mikrobiellen Kontamination.
Als nächstes verdünnen Sie das Blut mit einem EDTA-haltigen Puffer und mischen Sie es gut. Geben Sie vorsichtig eine Schicht einer geeigneten Trennlösung auf den Boden, ohne das Blut zu stören. Die Suspension zentrifugieren. Das Polymer in der Trennlösung aggregiert die roten Blutkörperchen und sedimentiert am Boden. Mononukleäre Zellen und Blutplättchen, die leichter als das Polymer sind, lagern sich oberhalb des polymeren Gradienten ab.
Entfernen Sie die oberste Schicht mit Plasma und sammeln Sie den undurchsichtigen weißen Ring mit den mononukleären Zellen. Verdünnen Sie die Zellen mit PBS und zentrifugieren Sie, um restliches Plasma und Blutplättchen zu entfernen. Verwenden Sie die isolierten mononukleären Zellen für die weitere Analyse. Das folgende Protokoll demonstriert die Isolierung mononukleärer Zellen aus einer kongenen Maus, der eine leukämische Zelllinie C1498 injiziert wurde.
- Führen Sie einen Kapillarschlauch in den medialen Canthus des Auges des anästhesierten leukämischen Tieres ein. 100 bis 200 Mikroliter Blut werden aus der Orbitalhöhle in den Kapillarschlauch gesaugt. Entfernen Sie den Schlauch und kontrollieren Sie die Blutung durch das sanfte Auftragen eines sterilen Mullschwamms auf das Auge. Übertragen Sie dann das Blut in ein EDTA-Röhrchen und lagern Sie das Röhrchen auf Eis, bis die mononukleäre Zellisolierung erreicht ist.
Um die mononukleären Zellen des Blutes zu isolieren, fügen Sie zunächst PBS hinzu, das mit 1 Millimolar EDTA bis zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern ergänzt ist. Übertragen Sie dann die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie anschließend eine 1-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um vorsichtig 500 Mikroliter Trennlösung unter das Blut zu schichten, wobei Sie darauf achten, die Schichten nicht zu vermischen.
Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und übertragen Sie mit einer Pipette die undurchsichtige weiße mononukleäre Zellschicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie dann Immunzellen in 1 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie sie und suspendieren Sie das Pellet in 600 Mikrolitern FACS-Puffer für die Färbung und Analyse mittels Durchflusszytometrie
.Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung mononukleärer Zellen aus dem Blut anästhesierter Mäuse beschrieben, insbesondere solcher, die mit einer leukämischen Zelllinie injiziert wurden. Die Methode betont die Bedeutung der Aufrechterhaltung der Probenechtheit durch Temperaturkontrolle und die Verwendung von EDTA zur Verhinderung der Gerinnung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Hämatologie
- Onkologie
Hintergrund
- Mononukleäre Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort.
- Die Isolierung dieser Zellen ist für verschiedene Analysen unerlässlich.
- EDTA wird häufig verwendet, um die Blutgerinnung zu verhindern.
- Die Temperaturkontrolle ist entscheidend, um mikrobielle Kontaminationen zu reduzieren.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Isolierung mononukleärer Zellen bereitstellen.
- Die Durchführung des Verfahrens an einem leukämischen Mausmodell demonstrieren.
- Die weitere Analyse von Immunzellen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Blutentnahme aus dem Orbitalsinus unter Verwendung eines Kapillarrohrs.
- Verwendung von EDTA zur Verhinderung der Gerinnung und Aufrechterhaltung der Probenechtheit.
- Zentrifugation zur Trennung mononukleärer Zellen von Plasma und Thrombozyten.
- Durchflusszytometrie zur Analyse der isolierten Zellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung mononukleärer Zellen aus Mausblut.
- Deutliche Trennung der Zellschichten während der Zentrifugation.
- Erhaltung der Zellviabilität für nachfolgende Analysen.
- Das Protokoll kann auf andere experimentelle Modelle angewendet werden.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ist wirksam zur Isolierung mononukleärer Zellen.
- Die Einhaltung geeigneter Bedingungen ist entscheidend für die Probenqualität.
- Dieses Protokoll kann zur Untersuchung von Immunantworten in leukämischen Modellen beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die zuverlässige Isolierung mononukleärer Zellen aus murinem Blut ist die Grundlage für Immunphänotypisierung, mechanistische Studien und die Validierung präklinischer Modelle in hämatologischen und onkologischen Arbeitsabläufen. Dieses Protokoll ermöglicht eine standardisierte Probengewinnung und -vorbereitung und unterstützt so die reproduzierbare Analyse von Immunzellen sowie die Kontinuität translationsmedizinischer Forschung. Seine Integration stärkt das Vorhersagevertrauen in krankheitsrelevante Systeme und leitet entscheidungsrelevante Maßnahmen in frühen Entwicklungsphasen ein.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Immunzellpopulationen in Krankheitsmodellen zur mechanistischen Entwicklungsrisikominimierung.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung, indem lebensfähige mononukleäre Zellen für nachgeschaltete Assays bereitgestellt werden.
- Erleichtert eine vorhersagekräftige Beurteilung der Charakterisierung der Immunantwort in präklinischen Studien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht standardisierte Aufbereitungen mononuklearer Zellen für die Entwicklung und Optimierung von Assays.
- Gewährleistet Reproduzierbarkeit und quantitative Konsistenz in immunzellbasierten Screening-Workflows.
- Ermöglicht die zuverlässige Bewertung von Substanzeffekten auf primäre Immunzellen in vitro.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Übereinstimmung mit krankheitsrelevanten murinen Modellen für translationsmedizinische Biomarker-Studien.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung über das präklinische Immunprofiling bis hin zur Validierung.
- Unterstützt eine risikoadjustierte Weiterentwicklung durch robustes immunologisches Monitoring in vivo.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode verbindet die Experimentation an In-vivo-Modellen mit der Analyse von Immunzellen ex vivo und schließt so die Lücke zwischen früher Entdeckung und präklinischer Validierung.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem sie die Isolierung von Immunzellen aus Krankheitsmodellen ermöglicht.
- Screening: Liefert assaysbereite mononukleäre Zellen mit reproduzierbaren Ausbeuten für nachgeschaltete Anwendungen.
- Analytik: Stellt quantitative Zellpopulationen für die Durchflusszytometrie und andere analytische Plattformen bereit.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Biomarker-Korrelierung und Immunüberwachung in präklinischen Modellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein wiederverwendbares Protokoll für eine konsistente Isolierung von Immunzellen über verschiedene Studien und Teams hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in Studien zu Immunzellen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Probenhandhabung und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zwischen Experimenten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen, indem robuste Daten zu Immunzellen frühzeitig in der Pipeline bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Assets in der Immunologie und Onkologie.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert technische Fachkenntnisse im Umgang mit Nagern und in Techniken der Blutentnahme.
- Benötigt Zugang zu Zentrifugier- und Durchflusszytometrie-Ausrüstung für die Zellisolierung und -analyse.
- Setzt eine standardisierte Probenverarbeitung über Teamgrenzen hinweg voraus, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Kann je nach Mausstamm oder Krankheitsmodell Anpassungen erfordern.
- Die begrenzte Probenmenge sowie Aspekte des Tierschutzes müssen gemäß Protokoll berücksichtigt werden.
Biopharma FAQs
Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Modifizierte Blutentnahme aus Tail Venen nicht narkotisierten Mäuse mit einem Vakuum Blut Sammelsystem und Brillen Lupe
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Blutentnahme durch Subclavian-Vein-Punktion in Mäusen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Ein neonatales Nagetiermodell der retroorbitalen Veneninjektion
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Neuronale Fernaktivierung in Verbindung mit automatisierter Blutentnahme zur Induktion und Messung des zirkulierenden luteinisierenden Hormons bei Mäusen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026