Retroorbitale Blutentnahme: Eine Methode zur Isolierung mononukleärer Zellen aus dem retroorbitalen Sinus einer Maus

0 Ansichten3:18 Min. • April 30th, 2023

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- Halten Sie zuerst eine betäubte Maus am Hals und strecken Sie das Auge hervor. Führen Sie ein feines Kapillarrohr in den medialen Canthus des Auges ein. Lassen Sie das Blut durch Kapillarwirkung in einen Schlauch fließen. Füllen Sie das Blut in ein EDTA-beschichtetes Röhrchen und halten Sie es auf Eis. EDTA bindet die Kalziumionen und verhindert so die Blutgerinnung. Eine niedrigere Temperatur reduziert die glykolytische Aktivität der Zellen und die Wahrscheinlichkeit einer mikrobiellen Kontamination.

Als nächstes verdünnen Sie das Blut mit einem EDTA-haltigen Puffer und mischen Sie es gut. Geben Sie vorsichtig eine Schicht einer geeigneten Trennlösung auf den Boden, ohne das Blut zu stören. Die Suspension zentrifugieren. Das Polymer in der Trennlösung aggregiert die roten Blutkörperchen und sedimentiert am Boden. Mononukleäre Zellen und Blutplättchen, die leichter als das Polymer sind, lagern sich oberhalb des polymeren Gradienten ab.

Entfernen Sie die oberste Schicht mit Plasma und sammeln Sie den undurchsichtigen weißen Ring mit den mononukleären Zellen. Verdünnen Sie die Zellen mit PBS und zentrifugieren Sie, um restliches Plasma und Blutplättchen zu entfernen. Verwenden Sie die isolierten mononukleären Zellen für die weitere Analyse. Das folgende Protokoll demonstriert die Isolierung mononukleärer Zellen aus einer kongenen Maus, der eine leukämische Zelllinie C1498 injiziert wurde.

- Führen Sie einen Kapillarschlauch in den medialen Canthus des Auges des anästhesierten leukämischen Tieres ein. 100 bis 200 Mikroliter Blut werden aus der Orbitalhöhle in den Kapillarschlauch gesaugt. Entfernen Sie den Schlauch und kontrollieren Sie die Blutung durch das sanfte Auftragen eines sterilen Mullschwamms auf das Auge. Übertragen Sie dann das Blut in ein EDTA-Röhrchen und lagern Sie das Röhrchen auf Eis, bis die mononukleäre Zellisolierung erreicht ist.

Um die mononukleären Zellen des Blutes zu isolieren, fügen Sie zunächst PBS hinzu, das mit 1 Millimolar EDTA bis zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern ergänzt ist. Übertragen Sie dann die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie anschließend eine 1-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um vorsichtig 500 Mikroliter Trennlösung unter das Blut zu schichten, wobei Sie darauf achten, die Schichten nicht zu vermischen.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und übertragen Sie mit einer Pipette die undurchsichtige weiße mononukleäre Zellschicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie dann Immunzellen in 1 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie sie und suspendieren Sie das Pellet in 600 Mikrolitern FACS-Puffer für die Färbung und Analyse mittels Durchflusszytometrie

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Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026