Extrazellulärer Flux-Assay: Eine Methode zur Messung des metabolischen Profils von Zellen

- Der extrazelluläre Fluss-Assay hilft bei der Untersuchung des Zellstoffwechsels, indem er die beiden Hauptenergiewege misst - Glykolyse und mitochondriale Atmung. Während der Glykolyse verstoffwechseln die Zellen Glukose und sezernieren Laktat zusammen mit Protonen in den extrazellulären Raum, bestimmt durch Messung der extrazellulären Ansäuerungsrate oder ECAR. Während der mitochondrialen Atmung verwenden Zellen Sauerstoff für die ATP-Produktion, gemessen durch Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR.

Krebszellen weisen eine hohe Glukoseaufnahme auf, da sie ihre Stoffwechselrate ändern, um sich anzupassen und eine unregulierte Zellproliferation aufrechtzuerhalten. Um den Stoffwechsel in Krebszellen zu analysieren, bauen Sie zunächst eine Mikroplatte für die Flussanalyse zusammen, die eine adhärente Monoschicht der Krebszellen und eine hydratisierte Sensorkartusche enthält. Übertragen Sie die Plattenbaugruppe in einen Flussmittelanalysator. Innerhalb des Analysators senken sich die Sensorsonden ab, um eine transiente Mikrokammer zu erzeugen. Um den extrazellulären Fluss zu messen, führt der Injektionsanschluss Testverbindungen zu voreingestellten Zeitpunkten in die Mikroplatte ein.

Basierend auf dem Zellstoffwechsel schwanken die Konzentrationen des verfügbaren Sauerstoffs und der in der Mikrokammer freigesetzten Protonen. Zwei Fluorophore, die an der Basis der Kartusche eingebettet sind, erfassen und messen gleichzeitig den Sauerstoff- und Protonengehalt, was auf die mitochondriale Atmung bzw. die Glykolyse hinweist. Im folgenden Protokoll werden wir einen extrazellulären Flux-Assay zur Messung der metabolischen Aktivität von primären leukämischen Zellen demonstrieren.

- Um die Platten für die extrazelluläre Flussanalyse vorzubereiten, geben Sie in der Zwischenzeit 12,5 Mikroliter Zelladhäsionslösung in jede Vertiefung von zwei 8-Well-Platten für extrazelluläre Flussanalysatorplatten. Nach 20 Minuten den Zellkleber absaugen und jede Vertiefung zweimal mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser pro Waschgang waschen.

Lassen Sie die Platten nach dem zweiten Waschen in der Haube, bis die Vertiefungen trocken sind, und legen Sie die Sensorkartusche kopfüber auf den Labortisch. Trennen Sie die Versorgungsplatte und die Sensorpatrone des Flussmittelanalysators und füllen Sie jede Vertiefung der Versorgungsplatte mit 200 Mikrolitern Kalibrant und jeden Graben an der Außenseite der Vertiefungen mit 400 Mikrolitern Kalibrant.

Setzen Sie die Sensorkartusche wieder in die Utility-Platte ein, die jetzt das Kalibrant enthält, und stellen Sie die Kartuschenbaugruppe über Nacht ohne CO2 in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie dann den extrazellulären Flussanalysator ein und lassen Sie ihn über Nacht auf 37 Grad Celsius erwärmen.

Am nächsten Morgen werden die Zellen aus dem Kolben zur Zentrifugation in konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt und die Pellets in 1 Milliliter des entsprechenden Versuchsmediums zur Zählung resuspendiert. Resuspendieren Sie die Zellen bei 4 mal 10 zu den 6 Zellen in 400 Mikrolitern experimenteller Mediumkonzentration und fügen Sie 50 Mikroliter Zellen in die Vertiefungen B bis G der Flussanalysatorplatte und 180 Mikroliter des Versuchsmediums in die Vertiefungen A und H als Hintergrundkontrollvertiefungen hinzu.

Geben Sie nach der Zentrifugation langsam und vorsichtig 130 Mikroliter des Versuchsmediums in die Vertiefungen B bis G und bestätigen Sie visuell die stabile Haftung der Zellen am Boden jeder Vertiefung unter dem Mikroskop. Anschließend stellen Sie die Flussmittelanalyseplatte ohne CO2 für 30 Minuten wieder in den befeuchteten, 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

20 Minuten vor Ende der Inkubation sind die Verbindungen gemäß dem Versuchsprotokoll in die entsprechenden Injektoröffnungen der Patrone zu laden, wie in der Tabelle angegeben. Richten Sie dann das entsprechende Programm zur Analyse des extrazellulären Flusses ein. Starten Sie das Programm und ersetzen Sie die Kalibrantplatte durch die Assay-Platte, wenn Sie dazu aufgefordert werden.