Chromatinscherung: Eine Methode zur Erzeugung von Chromatinfragmenten mittels enzymatischem Verdau

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Krebsforschung

0 Ansichten • 4:57 Min. • April 30th, 2023

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- Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an eine bestimmte Stelle auf der DNA binden, um die Genexpression zu regulieren. Fehler in den Transkriptionsfaktoren verändern diese Aktivität und führen zu einer Überexpression von Genen, die Krebs verursacht. Um die Rolle von Transkriptionsfaktoren und der Genregulation zu verstehen, können wir einen Chromatin-Immunpräzipitationsassay oder CHIP durchführen, und die Chromatinscherung ist ein wichtiger Schritt im CHIP-Arbeitsablauf.

Für die Chromatinscherung stabilisieren Sie den DNA-Protein-Komplex durch Zugabe von Formaldehyd. Formaldehyd vernetzt Proteine mit der zugehörigen DNA-Sequenz, indem es kovalente Bindungen bildet. Als nächstes wird ein geeigneter Lysepuffer verwendet, um die Zellen zu lysieren, um Chromatin freizusetzen, das die vernetzten DNA-Protein-Komplexe enthält, und Zentrifuge. Scheren Sie das Chromatin mit einem Mikrokokken-Nuklease-Enzym. Dieses Enzym spaltet das Chromatin zwischen den Nukleosomen und verdaut die losen DNA-Enden. Die Mischung zentrifugieren und den Überstand auffangen.

Laden Sie den Überstand auf FSME-Agarosegel, um die geeignete Größe der DNA-Fragmente zu analysieren. Legt ein elektrisches Feld über das Gel an, das bewirkt, dass sich die negativ geladene Chromatin-DNA in Richtung Anode bewegt. Kleinere Fragmente wandern weiter nach unten im Gel. Das gescherte Chromatin erscheint als Abstrich im Gel. Im folgenden Protokoll werden wir das Chromatin von Zelllinien der chronischen myeloischen Leukämie mittels Ultraschall scheren.

- Füllen Sie zunächst ein 1,5-Millimeter-Röhrchen mit 1 Milliliter 37% Formaldehyd. Füllen Sie dann ein weiteres 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 1 Milliliter 1,25 molares Glycin und ein 5-Milliliter-Röhrchen mit 4 Millilitern PBS. Nach der Stimulation der Zellen drehen Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll, suspendieren die Zellen erneut in 500 Mikrolitern PBS und legen das Röhrchen in eine mit Eis gefüllte Box. Geben Sie 13,5 % Mikroliter 37 % Formaldehyd in die Zellen und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren.

Inkubieren Sie dann die Suspension bei Raumtemperatur. Danach fügen Sie 57 Mikroliter 1,25 molare Glycine hinzu, um die Fixierung zu stoppen, und lassen Sie diese Suspension fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Unmittelbar nach der Inkubationszeit legen Sie die Zellen auf Eis und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 500 mal g. Aspirieren Sie dann den Überstand. Anschließend waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 Milliliter eiskaltem PBS bei 200 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius und entfernen den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 Millilitern Lysepuffer-1 durch Auf- und Abpipettieren.

Legen Sie dann die Proben auf Eis und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang unter Schütteln. Danach zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie dann mit der Pipette vorsichtig den Überstand. Homogenisieren Sie die Zellen in 5 Millilitern Lysepuffer-2 und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Dann inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang unter Schütteln auf Eis. Nach der Inkubationszeit zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 500 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius und entfernen vorsichtig den Überstand.

Als nächstes suspendieren Sie das Zellpellet wieder in Scherpuffer-1 mit 1X Proteaseinhibitor. Inkubieren Sie dann die Zellsuspension 10 Minuten lang auf Eis. Übertragen Sie 140 Mikroliter der Zellsuspension in Ultraschallröhrchen und achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden. Legen Sie die Röhren bei 7 Grad Celsius in einen fokussierten Ultraschallreaktor und scheren Sie sie zehn bis siebeneinhalb Minuten lang. Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.700 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Röhrchen.

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Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026