Chromatin-Immunpräzipitationsassay: Eine Technik zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Zellen

- Die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine Technik zur Bestimmung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Zellen. Proteine binden an bestimmte Stellen auf der DNA und regulieren die Genexpression. Zuerst wird der DNA-Protein-Komplex mit Formaldehyd stabilisiert. Formaldehyd vernetzt Proteine mit der zugehörigen DNA-Sequenz, indem es kovalente Bindungen bildet.

Als nächstes wird ein geeigneter Lysepuffer verwendet, um die Zellen so zu lysieren, dass Chromatin freigesetzt wird, das die vernetzten DNA-Protein-Komplexe enthält. Die Suspension wird zentrifugiert und der Überstand wird beschallt, um Chromatinfragmente zu erhalten. Anschließend markieren Sie die Probe mit einem geeigneten Antikörper, der spezifisch an das DNA-gebundene Protein bindet.

Fügen Sie der Probe spezielle magnetische Kügelchen hinzu. Das Kügelchen erkennt den Antikörper und bindet an ihn. Verwenden Sie einen Magneten, um die magnetischen Kügelchen mit dem Antikörper-Protein-DNA-Komplex zu sammeln. Waschen Sie die Probe, um ungebundenes Chromatin oder Antikörper zu entfernen. Fügen Sie dem Komplex einen Puffer mit hoher Salzkonzentration hinzu und inkubieren Sie ihn bei höheren Temperaturen, um die DNA-Proteinvernetzungen umzukehren.

Sammeln Sie mit einem Magneten den Überstand ein, der die DNA und die Proteine enthält. Fügen Sie das Proteinase-K-Enzym hinzu, um die Proteine in der Probe abzubauen. Fügen Sie einen geeigneten Puffer hinzu, um die DNA auszufällen, und verwenden Sie ihn für die weitere Analyse. Das folgende Protokoll wird die Chromatin-Immunpräzipitation in chronischen lymphatischen Leukämiezellen zur Identifizierung von NFAT2-Zielgenen demonstrieren.

- Bereiten Sie zunächst 20 Mikroliter Protein-A-beschichtete Kügelchen für jede Fällung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vor. Lassen Sie die Kügelchen eine Minute lang auf einem Magnetgestell ruhen und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie dann die Kügelchen mit 40 Mikrolitern 1x ChIP-Puffer 1 pro 20 Mikroliter Protein A-beschichteter Kügelchen durch Auf- und Abpipettieren.

Lassen Sie die Kügelchen eine Minute lang auf einem Magnetgestell ruhen und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch dreimal, bevor Sie die Kügelchen wieder in ihr ursprüngliches Volumen von 1x ChIP-Puffer 1 suspendieren. Füge BSA, Proteaseinhibitor, 5x ChIP-Puffer und Wasser in ChIP-seq-Qualität zu den Kügelchen hinzu. Fügen Sie als nächstes das gescherte Chromatin hinzu.

Verwenden Sie 10 Mikrogramm Anti-NFAT2-Antikörper, um NFAT2 zu erfassen, und 2,5 Mikrogramm IgG-Antikörper als Kontrolle. Inkubieren Sie die Mischungen über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Rad, das sich mit sechs Umdrehungen pro Minute dreht. Am nächsten Tag drehen Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang bei 7.000 g und inkubieren sie eine Minute lang auf dem Magnetgestell.

Saugen Sie dann den Überstand an und waschen Sie die Kügelchen einmal nacheinander mit den Waschpuffern 1, 2, 3 und 4. Drehen Sie die Röhrchen fünf Sekunden lang mit 7.000 g G, bevor Sie die Röhrchen eine Minute lang auf dem Magnetgestell inkubieren. Entfernen Sie danach den Überstand und fügen Sie den nächsten Waschpuffer hinzu.

Nach dem letzten Waschen die Röhrchen fünf Sekunden lang mit 7.000 g drehen. Inkubieren Sie die Röhrchen eine Minute lang auf dem Magnetgestell. Entfernen Sie den Überstand und nehmen Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Elutionspuffer 1 auf. Inkubieren Sie dann die Röhrchen 30 Minuten lang auf dem rotierenden Rad.

Drehen Sie anschließend die Röhrchen kurz und legen Sie sie für eine Minute auf ein Magnetgestell. Den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen und 4 Mikroliter Elutionspuffer 2 hinzufügen. Um die Eingangssteuerung zu erstellen, mischen Sie 1 Mikroliter des gescherten Chromatins mit 99 Mikrolitern Elutionspuffer eins und 4 Mikrolitern Elutionspuffer zwei. Anschließend werden die Proben vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius unter Schütteln inkubiert.

Geben Sie danach 100 Mikroliter 100% Isopropanol in die Röhrchen. Wirbeln Sie die Proben fünf Sekunden lang mit dem 7.000-fachen g. Geben Sie dann 10 Mikroliter magnetische Kügelchen zu jeder Probe. Vortex und inkubieren Sie die Proben auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur für eine Stunde.

Als nächstes drehst du die Röhrchen kurz und legst sie für eine Minute auf ein Magnetgestell. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Waschpuffer eins. Drehen Sie die Röhrchen um, um sie zu mischen, und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur. Anschließend die Röhrchen kurz zentrifugieren. Legen Sie sie für eine Minute in ein Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzu. Drehen Sie die Röhrchen zum Mischen um und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur. Danach zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz und legen sie für eine Minute in ein Magnetgestell. Entfernen Sie den zweiten Waschpuffer durch Aspiration und resuspendieren Sie die Kügelchen in 55 Mikrolitern Elutionspuffer.

Um die ausgefällte DNA zu eluieren, inkubieren Sie die Proben in einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Danach drehst du die Röhrchen kurz und legst sie für eine Minute in ein Magnetgestell. Zum Schluss den Überstand in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen.