Kultivierung und Ernte von HSPC-Klonen: Eine Methode zur Gewinnung der einzeln sortierten HSPC-Klone

- Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen oder HSPC, können sich selbst erneuern und in verschiedene Arten von Blutzellen differenzieren. HSPCs häufen im Laufe des Lebens nach und nach DNA-Mutationen an, die zu Leukämie beitragen können. Um solche Mutationen zu analysieren, werden HSPCs in der Regel aus dem Knochenmark erzeugt.

Beginnen Sie damit, mononukleäre Zellen - adulte Stammzellen, die aus dem Knochenmark isoliert wurden - mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern zu versorgen und sie für die gewünschte Dauer zu inkubieren. Die Antikörper binden an spezifische Zelloberflächenmarker wie CD34. Laden Sie nun die Mischung in das fluoreszenzaktivierte Zellzytometrie- oder FACS-Gerät.

Die Fluorophor-konjugierten Antikörper fluoreszieren, wenn sie vom Laser getroffen werden. Einzelne Zelltröpfchen passieren den Detektor, der die Fluoreszenzintensität misst, auf deren Grundlage der Tropfen eine elektrische Ladung besitzt. In Gegenwart von elektromagnetischen Feldern wandern positiv geladene Zellen in den negativen Behälter und umgekehrt.

Züchten Sie nun die FACS-sortierten CD34-positiven HSPCs in einem geeigneten Medium für die gewünschte Dauer, bis Klone sichtbar sind. Als nächstes lösen Sie die Klone durch kräftiges Pipettieren und zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren. Lagern Sie das Pellet mit klonalen HSPCs bei minus 20 Grad Celsius für die weitere Analyse. Im folgenden Protokoll werden wir HSPC-Klone aus den mononukleären Zellen erzeugen.

- Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung des Probenmaterials und der Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie dann 25 Milliliter hämatopoetisches Stamm- und Vorläuferzell-Kulturmedium (HSPC) vor. Füllen Sie eine 384-Well-Zellkulturplatte mit 75 Mikrolitern HSPC-Kulturmedium in jede Well. Um eine Verdunstung des Mediums in den äußeren Vertiefungen zu verhindern, füllen Sie die äußeren Vertiefungen mit 75 Mikrolitern sterilem Wasser oder PBS und verwenden Sie diese Vertiefungen nicht zur Zellsortierung.

Die korrekte Sortierung von HSPCs mit funktionsfähigen Signalen ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll. Legen Sie die Gates für die HSPC-Sortierung auf der Grundlage einer ungefärbten Kontrolle in 10.000 Zellen aus der Färbeprobe fest. Gate für einzelne Zellen, indem Sie ein Gate um die lineare Vorwärts-Streuungshöhe im Vergleich zum Vorwärts-Streuflächenanteil zeichnen.

Verwenden Sie den ungefärbten Kontrollanteil, um ein Tor für den Ableitungsanteil zu zeichnen. Zeichnen Sie Gates für CD34-positive Zellen und charakterisieren Sie diese Untergruppe weiter, indem Sie ein spezifisches Gate für CD38-negative, CD45RA-negative Zellen setzen. Legen Sie die 384-Well-Platte in die FACS-Maschine ein und sortieren Sie die einzelnen Zellen. Wenn dies auf den FACS-Computer zutrifft, aktivieren Sie die Option zum Beibehalten der Indexsortierungsdaten, um die Nachverfolgung der sortierten Zellen zu ermöglichen.

Um sortenreine HSCs zu kultivieren, wickeln Sie die 384-Well-Kulturplatte mit Deckel in eine transparente Polyethylenfolie ein. Übertragen Sie die 384-Well-Platte in einen befeuchteten 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und bewahren Sie sie drei bis vier Wochen lang im Inkubator auf, bis sichtbare Klone erscheinen. Bestimmen Sie nach vierwöchiger Kultivierung, welche Vertiefungen einen Zusammenfluss von 30 % oder mehr aufweisen.

Für jeden Klon füllen Sie 1,5 Millimeter Mikroröhrchen mit 1 Milliliter 1% BSA in PBS vor und beschriften das Röhrchen entsprechend der entsprechenden Vertiefung. Befeuchten Sie eine Pipettenspitze mit 1 % BSA in PBS, um die Anzahl der Zellen zu minimieren, die an der Pipettenspitze haften. Pipettieren Sie das Medium mindestens fünfmal heftig auf und ab, während Sie den Boden der Vertiefung mit einer 200-Mikroliter-Pipette abkratzen, die auf 75 Mikroliter eingestellt ist.

Sammeln Sie die Zellsuspension in dem markierten Mikroröhrchen, das der Vertiefung entspricht. Wiederholen Sie das Pipettieren in der Vertiefung mit bis zu 75 Mikrolitern frischem 1 % BSA und PBS, um eine maximale Aufnahme der Zellen zu gewährleisten. Klonal kultivierte Zellen können am Boden einer Vertiefung haften. Inspizieren Sie die Vertiefungen mit einem Standard-Inverslichtmikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen entnommen wurden.

Wenn alle Vertiefungen mit einer Konfluenz von mehr als 30 % geerntet wurden, setzen Sie die 384-Well-Platte wieder in den Inkubator ein. Klonale Kulturen können sich bis zu fünf Wochen lang vermehren. Schleudern Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 350 mal g herunter. Ein kleines Kügelchen sollte sichtbar sein. Entfernen Sie vorsichtig alle bis auf etwa fünf Mikroliter des Überstands. Zellpellets können bei minus 20 Grad Celsius eingefroren und mehrere Monate gelagert werden, bevor sie in die DNA isoliert werden.