Retrovirale vermittelte Transduktion: Eine Methode, um ein Zielgen in Krebszellen einzuführen

- Retroviren sind RNA-Viren, die sich mithilfe der reversen Transkriptase vermehren, um ihr RNA-Genom in doppelsträngige DNA umzuwandeln und sich dauerhaft in das Wirtsgenom zu integrieren. Neue Viruspartikel verlassen die Zelle und können andere Zellen infizieren. Bei der Krebsgentherapie werden retrovirale Vektoren eingesetzt, um therapeutische Gene über eine Technik namens Transduktion in Zielzellen einzuführen, um das mutierte Gen herunterzuregulieren oder Zellen zu eliminieren.

Um retrovirale Vektoren mit hohem Titer zu erhalten, transfizieren Sie die HEK 293-Zellen mit einem Transfektionsgemisch, das das gewünschte retrovirale Plasmid, das Verpackungsplasmid und ein geeignetes Transfizierungsmittel enthält. Inkubieren Sie die Zellen. Das Transfiktionsmittel erleichtert die Abgabe beider Plasmide in die Zellen.

Das retrovirale Plasmid kodiert das virale Genom mit dem Zielgen, während das Verpackungsplasmid für die viralen Hüllproteine kodiert. Die zelluläre Maschinerie der Verpackungszellen bildet retrovirale Partikel und gibt sie an das Medium ab. Sammeln Sie den Virusüberstand und zentrifugieren Sie, um Zellen zu entfernen.

Übertragen Sie die gewünschte Konzentration von Viruspartikeln und Krebszellen auf eine mit Fibronektin beschichtete Kulturplatte, um die Bindung viraler Hüllproteine an Zellen zu erleichtern. Inkubieren Sie die Zellen. Sammeln Sie die Zellen und führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Transduktionseffizienz zu analysieren. Dieses Protokoll führt eine retrovirale vermittelte Transduktion von c-Kit-positiven Knochenmarkzellen der Maus durch.

- Kombinieren Sie zunächst die retrovirale Plasmid-DNA mit dem Verpackungsplasmid, Calciumchlorid und Wasser in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann 500 Mikroliter HBS in ein weiteres 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie die Transfektionsmischung tropfenweise in das Röhrchen mit HBS, während Sie gleichzeitig mit dem Vortexer auf die niedrigste Stufe mischen.

Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie während der Inkubationszeit Chloroquin zu den HEK-Zellen und bewahren Sie sie im Inkubator auf. Nach der Zugabe der Transfektionsmischung inkubieren Sie die Zellen 8 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2 und wechseln Sie das Zellmedium, indem Sie sehr langsam 14 Milliliter frisches DMEM 10-Medium hinzufügen. Langsames Pipettieren an der Wand der Schale hilft, ein Abstreifen von HEK-Zellen zu verhindern.

Anschließend werden die Zellen über Nacht im 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, um den Virusüberstand aufzufangen. Befestigen Sie dann einen 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter an der Spritze. Tauchen Sie den Virusüberstand in ein neues Sammelröhrchen. Sammeln Sie den Virusüberstand etwa 16 Stunden später.

Geben Sie danach 2 Milliliter rekombinantes humanes Fibronektinfragment in PBS in unbehandelte 6-Well-Kulturplatten. Verwenden Sie am nächsten Tag eine Pipette, um das Fibronektin von den Platten zu entfernen. Blockieren Sie die Platten mit 2% BSA in PBS und inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie ein Vakuum, um BSA zu entfernen, und waschen Sie die Platten mit PBS, bevor Sie sie mit dem Vakuum entfernen. Danach sofort den gefilterten Virusüberstand hinzufügen und die Platte zwei Stunden lang zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einem Vakuum und drehen Sie die Platte erneut.

Entfernen Sie anschließend den Überstand mit einem Vakuum und waschen Sie die mit Viren überzogenen Vertiefungen mit PBS. Entfernen Sie das PBS mit dem Staubsauger. Geben Sie die zuvor kultivierten c-Kit+-Mauszellen in die viral beschichteten Wells. Nach der Zentrifugation inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. 48 Stunden nach der Transduktion werden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und in FACS-Puffer Nummer 1 resuspendiert.