CFU-Assay auf Methylcellulose-Basis: Eine Methode zur Bestimmung der Wirkung von Anti-Krebs-Wirkstoffen auf die Koloniebildung in leukämischen Zellen

- Manchmal durchläuft eine Stamm- oder Vorläuferzelle Mutationen, aus denen eine leukämische Stammzelle entsteht. In diesen Zellen werden bestimmte Proteine hochreguliert, und die Verwendung von Antikrebsmitteln gegen solche Proteine kann helfen, das Zellwachstum zu kontrollieren. Die Wirkung dieser krebshemmenden Verbindungen kann mit Hilfe eines CFU-Assays analysiert werden, indem die Anzahl und Größe der gebildeten Kolonien überwacht wird.

Beginnen Sie damit, Vorläuferzellen einer leukämischen Maus zu entnehmen und sie in einem geeigneten Nährmedium zu verdünnen. Geben Sie diese Zellsuspension zusammen mit der entsprechenden krebshemmenden Verbindung zu Methylcellulose, die mausspezifische Zytokine enthält, und gießen Sie sie in eine Petrischale. Inkubiere diese Mischung, bis die Kolonien erscheinen. Methylcellulose ist eine chemisch inerte, halbfeste Matrix, die die Zellmigration verhindert, während Zytokine die Vorläuferzellen dazu anregen, sich zu differenzieren und Kolonien mit erkennbaren Nachkommen zu bilden.

Als nächstes färben Sie die Bienenvölker mit Jodnitrotetrazoliumchlorid oder INT und inkubieren über Nacht, bis die Bienenvölker dunkelrotbraun werden. Mitochondriale Enzyme reduzieren gelb gefärbten INT zu rötlich-braun gefärbtem Formazan-Farbstoff. Identifizieren und zählen Sie abschließend die auf dem Teller vorhandenen Kolonien. Im folgenden Protokoll werden wir einen CFU-Assay durchführen, um die Wirkung von Antikrebsverbindungen auf YFP-positive Zellen zu testen.

- Tauen Sie zunächst die Methylcellulose mit Zytokinen für Mäuse bei Raumtemperatur auf. Aliquotieren Sie dann 3 Milliliter Methylcellulose in einem FACS-Röhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension mit den entsprechenden Inhibitoren zu 3 Millilitern Methylcellulose. Wirbeln Sie dann die Suspension 10 bis 30 Sekunden lang auf hoher Stufe.

Nachdem der größte Teil der Luftblasen entwichen ist, verwenden Sie eine 1-Milliliter-Spritze, um 1 Milliliter des Mediums in drei Replikplatten zu füllen. Legen Sie die Platten zusammen mit einer offenen Schale mit sterilem Wasser in eine große Petrischale. Decken Sie dann die große Petrischale ab und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius.

Bereiten Sie den Jodnitrotetrazoliumchlorid-Farbstoff vor, indem Sie 10 Milligramm des Jodnitrotetrazoliumchlorids in 10 Millilitern Wasser auflösen. Filter: Sterilisieren Sie die Färbelösung mit einer Luer-Lok-Spritze, die mit einem 0,2-Mikrometer-Filter ausgestattet ist.

Geben Sie in der Gewebekulturhaube 100 Mikroliter der Färbelösung tropfenweise um die CFU-Platte herum. Anschließend werden die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator inkubiert. Nachdem die Kolonien eine dunkle rotbraune Farbe angenommen haben, verwenden Sie schließlich einen weißen Hintergrund in der sterilen Gewebekulturhaube, um Fotos von der gefärbten KBE-Platte zu machen.