Markierung von Darmkrebs-Organoiden: Eine Methode zur Erzeugung von GFP-Lentivirus-transduzierten Darmkrebs-Organoidzellen

- Organoide sind dreidimensionale in-vitro-zelluläre Konstrukte, die sich selbst organisieren, um wichtige Gewebeeigenschaften ihres Ursprungsorgans nachzuahmen. Um mit der Markierung zu beginnen, behandeln Sie die geernteten Organoide mit einem proteolytischen und einem kollagenolytischen Enzymcocktail, um die Zellen in Suspension zu dissoziieren. Zentrifuge, um die Zellen vom enzymhaltigen Überstand zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand. Lösen Sie das Zellpellet mit einem Medium auf, das lentivirale Vektoren enthält. Diese rekombinanten Viren tragen die kodierende Sequenz für ein grün fluoreszierendes Protein oder GFP.

Die Viren verschmelzen mit den Zellen und geben ihr Erbgut und bestimmte virale Enzyme an das Zytoplasma ab. Die virale reverse Transkriptase synthetisiert die komplementäre virale DNA, die in den Zellkern des Wirts gelangt. Die virale Integrase hilft dabei, die GFP-Sequenz enthaltende virale DNA in das Wirtsgenom einzubauen. Züchten Sie diese transduzierten Zellen in einer extrazellulären Matrix oder einer EZM-beschichteten Kulturplatte. Aspirieren Sie das Medium und zentrifugieren Sie, um alle nicht gebundenen Zellen zu sammeln. Resuspendieren Sie die Zellen in