Markierung von Darmkrebs-Organoiden: Eine Methode zur Erzeugung von GFP-Lentivirus-transduzierten Darmkrebs-Organoidzellen

- Organoide sind dreidimensionale in-vitro-zelluläre Konstrukte, die sich selbst organisieren, um wichtige Gewebeeigenschaften ihres Ursprungsorgans nachzuahmen. Um mit der Markierung zu beginnen, behandeln Sie die geernteten Organoide mit einem proteolytischen und einem kollagenolytischen Enzymcocktail, um die Zellen in Suspension zu dissoziieren. Zentrifuge, um die Zellen vom enzymhaltigen Überstand zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand. Lösen Sie das Zellpellet mit einem Medium auf, das lentivirale Vektoren enthält. Diese rekombinanten Viren tragen die kodierende Sequenz für ein grün fluoreszierendes Protein oder GFP.

Die Viren verschmelzen mit den Zellen und geben ihr Erbgut und bestimmte virale Enzyme an das Zytoplasma ab. Die virale reverse Transkriptase synthetisiert die komplementäre virale DNA, die in den Zellkern des Wirts gelangt. Die virale Integrase hilft dabei, die GFP-Sequenz enthaltende virale DNA in das Wirtsgenom einzubauen. Züchten Sie diese transduzierten Zellen in einer extrazellulären Matrix oder einer EZM-beschichteten Kulturplatte. Aspirieren Sie das Medium und zentrifugieren Sie, um alle nicht gebundenen Zellen zu sammeln. Resuspendieren Sie die Zellen in zusätzlicher EZM.

Überlagern Sie die Suspension mit der adhärenten Kultur, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu fördern. Sobald sich die Matrix verfestigt hat, Kulturmedium hinzufügen und inkubieren, um die Organoidbildung zu erleichtern. Beobachten Sie die Kultur unter einem Fluoreszenzmikroskop. Transduzierte Zellen synthetisieren grün fluoreszierende Proteine. Organoide, die aus diesen Zellen gebildet werden, weisen eine GFP-Positivität auf. Das folgende Protokoll zeigt die lentivirale GFP-Transduktion in patienteneigene Darmkrebs-Organoidzellen.

- Nach 7 bis 10 Tagen Kultur lösen Sie die Organoide mechanisch mit einem sterilen Zellschaber ab und überführen die Organoide zur Zentrifugation in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend werden die Pellets in 500 Mikrolitern PBS durch leichtes Klopfen für eine weitere Zentrifugation resuspendiert. Um die Darmkrebs-Organoide zu dissoziieren, geben Sie 500 Mikroliter proteolytische und kollagenolytische Enzymlösung in die Röhrchen und mischen Sie sie mit leichtem Klopfen.

Geben Sie nach 10 Minuten bei Raumtemperatur 500 Mikroliter Medium, das mit 1 % FBS ergänzt ist, zu den Zellen und pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals sehr vorsichtig, um die Organoide aufzubrechen.

- Das schonende Pipettieren von humanen CRC-Organoiden während der Passage ist entscheidend für die Aufrechterhaltung einer intakten Sphäroidbildung in Kultur.

- Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern 5x GFP-Lentivirus-Stamm und 400 Mikrolitern frischem Darmkrebs-Organoid-Kulturmedium.

- Es ist wichtig, die humanen Darmkrebs-Organoide mit einem hohen Titer von GFP-Lentiviren zu infizieren, insbesondere um eine nahezu 100%ige Infektionseffizienz zu erreichen.

- Passen Sie das Volumen in jedem Röhrchen an, um eine 5 mal 10 bis fünfte dissoziierte Tumorzelle pro 500 Mikroliter mittlerer Konzentration zu erreichen, und plattieren Sie 500 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer mit künstlicher extrazellulärer Matrix beschichteten 12-Well-Platte, wie gezeigt. Nach 18 Stunden im Zellkultur-Inkubator werden die schwimmenden zellhaltigen Überstände zur Zentrifugation in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, gefolgt von der Resuspension der Pellets in 70 Mikrolitern künstlicher extrazellulärer Matrix pro Röhrchen auf Eis.

Um die Lebensfähigkeit der Darmkrebszellen zu verbessern, überlagern Sie die tumorzellhaltige künstliche extrazelluläre Matrix mit den Tumororganoiden in der 12-Well-Platte und legen Sie die Platte für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator. Wenn sich die künstliche extrazelluläre Matrixbeschichtung verfestigt hat, füttern Sie die Kulturen mit 1 Milliliter frischem CRC-Organoid-Kulturmedium, das mit 1 % FCS ergänzt ist, und stellen Sie die Zellen für drei Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück. Beobachten Sie dann die infizierten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie, um eine nahezu 100%ige GFP-Positivität zu bestätigen, und bringen Sie die Zellen für weitere 4 bis 6 Tage in den Inkubator zurück.