JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 5:19 Min. • April 30th, 2023
- Beginnen Sie mit der Entnahme einer anästhesierten bedingt mutierten Maus mit einem modifizierten Genom, das spezifische Cre-Rekombinase-Enzymerkennungssequenzen, sogenannte LoxP-Inserts, trägt, die das gewünschte Tumorsuppressorgen flankieren, das mutiert werden soll. Legen Sie die Bauchhöhle chirurgisch frei. Lokalisieren Sie den distalen Dickdarm und klemmen Sie seinen oberen Teil ein. Führen Sie transanal einen medizinischen Schlauch ein und schieben Sie ihn in den distalen Dickdarm vor. Spülen Sie den Dickdarm mit Kochsalzlösung, um alle Fäkalien zu entfernen. Setze den Schlauch wieder ein. Klemmen Sie den unteren Bereich des Doppelpunkts für die Segmentierung ein. Blasen Sie das Segment mit einer geeigneten Zelldissoziationslösung auf. Dadurch wird die Schleimhautbarriere perforiert und die Zugänglichkeit der Darmkryptenzellen erhöht. Spülen Sie die Dissoziationslösung aus.
Als nächstes injizieren Sie eine adenovirale Suspension in das Dickdarmsegment. Diese manipulierten viralen Vektoren kodieren für Cre-Rekombinase-Enzyme. Das Virus dringt in die Zelle ein, gibt seine DNA in den Zellkern ab und exprimiert die Enzyme. Die Proteine erkennen die LoxP-Insertionen im Wirtsgenom und katalysieren die ortsspezifische Rekombination, wodurch das Tumorsuppressorgen inaktiviert wird. Diese Funktionsverlust-Mutation fördert das Fortschreiten der Krebserkrankung. Nähen Sie den Schnitt und lassen Sie die Maus sich erholen. Überwachen Sie, um das Wachstum von isolierten kolorektalen Tumoren zu beobachten. Das folgende Protokoll zeigt die Generierung eines Darmkrebs-Mausmodells durch segmentale Adeno-Cre-Infektion.
- Beginnen Sie damit, eine betäubte Maus in Rückenlage zu bringen und Salbe auf die Augen des Tieres aufzutragen. Kleben Sie die Maus in eine sichere Position und bestätigen Sie dann den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zusammenkneifen der Zehen. Machen Sie einen etwa 15 Millimeter großen Schnitt in der Mittellinie in der Haut des Unterbauchs. Fassen Sie dann mit einer Pinzette die Bauchwandmuskulatur und schneiden Sie den Muskel vorsichtig mit einer Schere ein, um die Bauchhöhle zu öffnen. Nach der Identifizierung des distalen Dickdarms wird das Gewebe vorsichtig mit einer feinen Klemme etwa 15 Millimeter proximal zum Anus umklammert.
Führen Sie als Nächstes einen flexiblen Teflonschlauch transanal ein, schieben Sie den Schlauch vorsichtig vor, bis er den luminalen Verschluss erreicht, und kanülieren Sie den Schlauch mit einer 30-Gauge-Kanüle. Schließen Sie eine handelsübliche 1-Liter-Spritze an die Kanüle an und spülen Sie den Dickdarm mit mehreren Millilitern normaler Kochsalzlösung, bis alle Fäkalien evakuiert sind. Sobald der distale Dickdarm leer ist, ersetzen Sie den Kochsalzschlauch durch einen neuen Teflonschlauch und verwenden Sie eine zweite Klemme, um den Dickdarm etwa 3 Millimeter distal der ersten Klemme zu verschließen.
Injizieren Sie mit einer zweiten 1-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Kanüle ausgestattet ist, vorsichtig 50 bis 80 Mikroliter 0,25 % Trypsin-EDTA in das geklemmte Dickdarmsegment. Der Dickdarm sollte sich so weit aufblähen, dass die Schleimhautbarriere aufgebrochen wird, ohne das eingeklemmte Gewebesegment zu perforieren. Entfernen Sie nach 10 Minuten die distale Klemme. Entfernen Sie dann das Trypsin-Röhrchen und spülen Sie den distalen Dickdarm mit 500 Mikrolitern normaler Kochsalzlösung.
Nach dem Einsetzen eines neuen Teflonschlauchs klemmen Sie den Dickdarm wieder ein und blasen das Gewebe mit 50 bis 80 Mikrolitern der adenoviralen Lösung auf. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Klemmen und den Schlauch und verschließen Sie die Bauchdecke mit 6-0 schnell resorbierbaren Laufnähten. Verschließen Sie die Haut mit chirurgischen Wundklammern und überwachen Sie das Tier auf einem Heizkissen, bis es sich vollständig erholt hat.
Um das Tumorwachstum mittels Koloskopie zu überwachen, wird das anästhesierte tumortragende Tier in Rückenlage auf ein Heizkissen gelegt und das Endoskop transanal in den Darmtrakt eingeführt. Insufflieren Sie die Luft sanft unter visueller Kontrolle, um den Dickdarm zu dehnen. Schieben Sie dann das Oszilloskop vorsichtig nach vorne, bis die Schleimhautläsion im distalen Dickdarm identifiziert werden kann, und speichern Sie jedes endoskopische Bild, sobald es aufgenommen wird, für eine spätere Auswertung. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, entfernen Sie das Endoskop langsam und legen Sie die Maus auf ein 38 Grad Celsius heißes Heizkissen, bis sie vollständig wiederhergestellt ist.