Mikrotubuli-Bindungsassay in Darmkrebszellen: Eine Methode zur Untersuchung des Mikrotubuli-bindenden Tau-Proteins in Darmkrebszellen

- Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das an der Stabilisierung und dem Zusammenbau der Mikrotubuli beteiligt ist. Viele Krebszellen exprimieren hyperphosphoryliertes Tau-Protein, das keine gut organisierte Mikrotubuli-Bindung aufrechterhält. Um die Wechselwirkung zwischen Tau-Protein und Mikrotubuli zu untersuchen, geben Sie Krebszelllysat, das Tau-Protein enthält, und eine Mikrotubuli-Arbeitslösung in ein Mikrofuge-Röhrchen.

Die im Zelllysat vorhandenen nicht-phosphorylierten Tau-Proteine binden an die Mikrotubuli. Geben Sie nun die gewünschte Menge PEM-Puffer in das Röhrchen, um die Aktivität von Tubulin zu stabilisieren, einem Protein, das zu Filamenten polymerisiert und Mikrotubuli bildet. Inkubieren Sie die Mischung für die gewünschte Dauer.

Zentrifugieren Sie die Mischung, um das an Mikrotubuli gebundene Protein zu pelletieren. Das ungebundene Protein verbleibt im Überstand. Den Überstand in ein frisches Rohr umfüllen und das Pellet in einem geeigneten Puffer wieder suspendieren. Fügen Sie der resuspendierten Pelletsuspension einen Gelladepuffer hinzu und lassen Sie die Proben auf einem Polyacrylamidgel laufen, um das mikrotubuligebundene Protein und den Elektroblot auf einer geeigneten Membran zu trennen.

Fügen Sie geeignete Antikörper hinzu und entwickeln Sie den Blot unter Verwendung von Chemilumineszenzsubstrat, um die gebundenen Tau-Proteine zu identifizieren. Im folgenden Protokoll werden wir den Mikrotubuli-Bindungsassay durchführen, um Mikrotubuli-gebundene Proteine zu identifizieren.

- Nach der Vorbereitung frischer Proben werden diese 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Ultrazentrifugieren Sie die Proben bei 100.000 x g und 25 Grad Celsius für 60 Minuten. Als nächstes werden 120 Mikroliter jedes Überstands, der ungebundenes Tau enthält, in getrennte saubere und markierte Röhrchen überführt. Geben Sie 120 Mikroliter 5X Probenpuffer zu dem Pellet, das gebundenes Tau enthält.

Nachdem Sie die Mischung durch Vortexen und Pipettieren gründlich gemischt haben, füllen Sie sie in saubere, etikettierte Röhrchen um. Nach der Vorbereitung von Proben mit äquivalenter Proteinkonzentration wird frischer 4X SDS-Gel-Loading-Puffer mit 400 millimolaren DTT hinzugefügt. Verwenden Sie einen Wärmeblock, um die Proben fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius zu inkubieren.

Wirbeln Sie die Proben und lassen Sie sie dann 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen. Laden Sie 13 Mikroliter Probe pro Vertiefung und die Molekulargewichtsleiter auf ein 10%iges Polyacrylamid-Gel. Schließen Sie die positiven und negativen Elektroden des Elektrophoresesystems an eine Stromquelle an und stellen Sie dann die Spannung für 20 Minuten auf 70 Volt ein.

Erhöhen Sie danach die Temperatur auf 125 Volt und lassen Sie das Gel etwa 70 bis 120 Minuten lang laufen, bis die Proben und die Proteinleiter das Ende des Gels erreichen. Verwenden Sie das Nass-Elektroblotting-System, um das Gel etwa 100 Minuten lang bei 100 Volt auf eine Polyvinylidenfluoridmembran zu übertragen. Inkubieren Sie die Membran und tupfen Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Rinderserumalbumin ab. Inkubieren Sie dann über Nacht in einer primären Antikörperlösung bei 4 Grad Celsius.

Waschen Sie den Blot am nächsten Tag viermal mit PBST, wobei jede Wäsche sieben Minuten dauert. Inkubieren Sie den gewaschenen Blot 90 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer entsprechenden Sekundärantikörperlösung. Waschen Sie dann sieben Minuten lang mit PBST und wiederholen Sie die Wäsche insgesamt viermal. Entwickeln Sie den Blot mit einem Chemilumineszenz-Kit. Decken Sie es mit transparenter Plastikfolie ab und nehmen Sie Bilder mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem auf.