Traktionszytometrie-Assay: Eine Methode zur Quantifizierung der Zugkraft, die von Krebszellen auf die EZM ausgeübt wird

- Zellen erzeugen mechanische Kräfte, die auf eine extrazelluläre Matrix wirken. Diese Kraft wird als Zugkraft bezeichnet. Zellen üben Zugkräfte aus, um verschiedene Aufgaben wie Migration und Proliferation zu erfüllen.

Metastasierende Krebszellen üben größere Zugkräfte aus als gesunde Zellen, daher führen wir einen Traktionszytometrie-Assay durch, um die Zugkräfte zu messen, die von Zellen auf elastische Substrate ausgeübt werden. Beginnen Sie damit, die gewünschte Menge an Darmkrebszellen auf ein Polyacrylamid-Hydrogel zu säen, ein Gel, das ECM in vitro nachahmt. Das Gel besteht aus Fibronektin-Proteinen, die den Zellen helfen, an der Oberfläche zu haften, und fluoreszierenden Kügelchen, die als Marker für Positionsänderungen dienen.

Inkubieren Sie die Zellen für den gewünschten Zeitraum. Die Zellen haften an dem Gel und üben die Zugkraft aus, die eine Verschiebung der fluoreszierenden Kügelchen bewirkt. Legen Sie nun die Platte unter ein Fluoreszenzmikroskop und machen Sie ein Bild der verschobenen fluoreszierenden Kügelchen. Geben Sie anschließend die gewünschte Menge Trypsin in die Platte, um die Zellen zu lösen, und analysieren Sie die von den Zellen ausgeübte Zugkraft mit einer geeigneten Software. Im folgenden Protokoll werden wir einen Zugkraftmikroskopie-Assay durchführen, um die zelluläre Traktion von menschlichen Darmkrebszellen zu analysieren.

- Um den Zugkraftmikroskopie-Assay durchzuführen, erwärmen Sie zunächst 0,25 % Trypsin-EDTA 10 % SDS-Lösung 10 Minuten lang in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius, bevor das Traktionsexperiment beginnt. Nehmen Sie jeweils ein Gel aus dem Zellkultur-Inkubator und legen Sie es auf den Mikroskoptisch. Nachdem Sie eine einzelne Zelle im Sichtfeld gefunden haben, entfernen Sie den Deckel der Petrischale und machen Sie ein Phasenkontrastbild der Zelle.

Schalten Sie anschließend den Bildgebungsmodus auf Fluoreszenz um und wählen Sie den entsprechenden Filter aus. Bewegen Sie während dieser Zeit weder den Mikroskoptisch noch die Probe. Nehmen Sie dann ein Bild der fluoreszierenden Kügelchen auf, die durch zelluläre Traktion verdrängt werden. Geben Sie nun 1 Milliliter Trypsin-SDS-Lösung in die Petrischale, um die Zelle vom Gel zu lösen. Machen Sie ein Referenzbild der Kügelchen, nachdem die Zelle entfernt wurde.