Hanging Drop Method: Eine Technik zur Erzeugung von 3D-Melanom-Sphäroiden

- Sphäroide sind dreidimensionale In-vitro-Zellkulturmodelle, die die In-vivo-Tumorarchitektur nachahmen und bei der Untersuchung intratumoraler Interaktionen helfen. Um die Kultur einzurichten, bereiten Sie zunächst eine einzellige Suspension von Melanomzellen in dem entsprechenden Medium vor. Als nächstes werden kleine Volumina dieser Zellsuspension in ausreichendem Abstand auf die Innenfläche des Deckels einer sterilen, nicht adhäsiven Kulturschale aufgetappt. Drehen Sie den Deckel vorsichtig um und setzen Sie ihn auf den Boden der Kulturschale mit PBS, um eine Hydratationskammer zu schaffen. Inkubieren Sie die Platte unter geeigneten Bedingungen.

Die Feuchtigkeit von PBS verhindert die Verdunstung von Medien aus den hängenden Tropfen. Frischen Sie die Tropfen auf, indem Sie einige Mikroliter des Mediums austauschen. Aufgrund der Oberflächenspannung behalten die Tröpfchen ihre kugelförmige Form bei und bleiben an der Innenfläche der Platte hängen. Gravitationskräfte ermöglichen es den Zellen, in der Schwebe zu bleiben, ohne sich auszubreiten, sondern sich in den Tröpfchen zu dreidimensionalen Sphäroiden zu aggregieren. Spülen Sie abschließend die Tröpfchen mit PBS, um die Sphäroide zu ernten. Sammeln Sie sie in einer nicht klebenden Kulturschale.

Im folgenden Protokoll werden wir die Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden aus 451-LU-Melanomzellen mittels der Hanging Drop-Methode demonstrieren.

- Zu Beginn werden Melanomzellen 451-LU mit RPMI-Medium mit einem FCS-Gehalt von 10 % gemäß den allgemeinen Zellkulturprotokollen kultiviert. Um Melanom-Sphäroide zu erzeugen, waschen Sie die kultivierten Melanomzellen in PBS. Fügen Sie dann 5 Milliliter 1x Trypsin-EDTA in PBS hinzu. 3 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 5 Milliliter RPMI mit 10% FCS hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 Minuten, um die Zellen zu ernten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in RPMI mit 10 % FCS.

Zählen Sie anschließend die Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10.000 Zellen pro Milliliter. Verwenden Sie eine elektronische Multipipette, um 40 x 25 Mikroliter große Flecken Zellsuspension auf der Innenfläche des Deckels einer sterilen, nicht klebenden 10-Zentimeter-Zellkulturschale herzustellen.

Drehen Sie dann den Deckel mit einer schnellen, sanften Bewegung um und legen Sie ihn auf die Zellkulturschale mit 5 Millilitern PBS. Kultivieren Sie die hängenden Tropfschalen bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid für 10 bis 14 Tage.

Fünf Tage nach der ersten Tropfenfleckenbildung verwenden Sie einen elektronischen Spender, um 10 Mikroliter RPMI mit 10 % FCS zu jedem Tropfen hinzuzufügen. Nach 10 bis 15 Tagen ernten Sie die Sphäroide, indem Sie sie vorsichtig mit PBS vom Deckel abspülen. Sammeln Sie die Sphäroide in einer frischen, nicht klebenden Zellkulturschale.