Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, effizient große Mengen robuster Zellsphäroide durch Zellaggregation für deren Verwendung in einer Vielzahl von zellbasierten Assays zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine nicht-proteinhaltige wasserlösliche Matrix für die Zellaggregation und Sphäroidbildung verwendet, die eine einfache und schnelle Isolierung der Sphäroide ermöglicht. Diese Methode kann dazu beitragen, neue Erkenntnisse in der Zellbiologie über die Auswirkungen von Zell-Zell- und Zell/Matrix-Wechselwirkungen auf das Gewebewachstum in einer dreidimensionalen Mikroumgebung zu gewinnen.

Bevor Sie die Zuschlagstoffe vorbereiten, erhitzen Sie 50 Milliliter Reinstwasser auf 80 Grad Celsius und fügen Sie 10 Gramm Methylcellulosepulver hinzu. Rühren Sie die Suspension, bis die Partikel gleichmäßig verteilt sind. Fügen Sie dann kaltes Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 100 Millilitern hinzu und lagern Sie die Partikel über Nacht bei 4 Grad Celsius, bis die Lösung klar und strohfarben ohne sichtbare Feststoffe wird.

Die Lösung wird durch einen 0,45-Mikrometer-Filter geleitet, um alle ungelösten Fragmente zu entfernen, und 1:5 Milligramm pro Milliliter der gefilterten Lösung im entsprechenden Nährmedium verdünnt. Filtrieren Sie dann das mit Methylcellulose angereicherte Medium durch ein 0,22-Mikrometer-Sieb. Waschen Sie anschließend in einer Biosicherheitswerkbank eine 70%ige konfluente Subkultur mit PBS und befestigen Sie die Zellen mit drei Millilitern Trypsin-EDTA-Assoziationspuffer in einem Zellkultur-Inkubator.

Untersuchen Sie die Zellen nach einigen Minuten unter einem Lichtmikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Wenn sich die Zellen von der Platte abgehoben haben, neutralisieren Sie die Reaktion mit sieben Millilitern Serum-supplementiertem Kulturmedium. Übertragen Sie die Zelllösung in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie dann die freigesetzten Zellen durch Zentrifugation.

Die häufigste Ursache für eine erfolglose Sphäroidbildung ist neben der Kontamination von Partikeln die Verwendung suboptimaler Konzentrationen von Methylcellulose oder Serum für die Aggregation und das Wachstum Ihrer spezifischen Zelllinie. Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette mit einer Filterspitze, reiben Sie die Palette drei- bis fünfmal mit einem Milliliter des Sphäroidbildungsmediums und drücken Sie die Pipettenspitze in einem leichten Winkel gegen den Boden des Röhrchens, während Sie langsam pipettieren, ohne den gesamten Spitzeninhalt auszustoßen, um das Pellet zu scheren. Verdünnen Sie die Zellsuspension nach der Zählung auf eine Konzentration von eins mal 10 bis zur vierten Zellen pro Milliliter und spülen Sie ein steriles Mehrkanal-Pipettenreservoir mit gefiltertem Reinstwasser, um Staub und Fasern zu entfernen.

Geben Sie die Zellen in das Reservoir und verwenden Sie Filterspitzen, um 100 Mikroliter der Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-U-Boden-Zellabweisungsplatte zu überführen, wobei Sie die Zellsuspension regelmäßig mischen, um zu verhindern, dass sich die Zellen auf dem Boden des Reservoirs absetzen. Wenn alle Zellen eingesetzt wurden, legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator und untersuchen Sie die Vertiefungen täglich auf Sphäroidbildung. Die Zellen sollten sich innerhalb von sechs Stunden am Boden jeder Vertiefung absetzen und sich in der Regel innerhalb von 24 bis 48 Stunden zu einem Sphäroid zusammenschließen.

Um die Bildung eines erfolgreichen Sphäroids zu bestätigen, verwenden Sie eine P10-Spitze unter einem Lichtmikroskop, um das Medium vorsichtig über das Sphäroid zu pipettieren. Richtig geformte Sphäroide lösen sich von der Platte und walzen und bestätigen ihre 3-D-Struktur. Um die Sphäroide in Kollagen einzubetten, verwenden Sie das umgekehrte Pipettieren, um den Boden jeder Vertiefung eines Acht-Well-Gewebekulturkammer-Objektträgers gleichmäßig mit mindestens 50 Mikrolitern neutralisiertem Kollagen pro Vertiefung zu beschichten.

Wenn alle Vertiefungen abgedeckt sind, legen Sie den Kammerobjektträger in eine 35 Millimeter große, mit Reinstwasser gefüllte Gewebekulturschale in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale und inkubieren Sie die 10 Zentimeter große Gewebekulturschale bei 37 Grad Celsius für etwa eine Stunde. Wenn das Kollagen polymerisiert ist, verwenden Sie eine P1000-Filterspitze, um die vorgeformten Sphäroide vorsichtig in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Es ist wichtig, dass die Kollagen-Basisschichten inkubiert werden, bis sie vollständig polymerisiert sind, um zu vermeiden, dass das Kollagen beim Hinzufügen der Sphäroide oder des Mediums gestört wird.

Erzähler Sammeln Sie die geernteten Sphäroide in einer Tisch-Mikrozentrifuge und verwenden Sie eine P200-Pipette, um die Überstände zu entfernen, und leiten Sie den überschüssigen Überstand bei Bedarf durch Invertieren der Röhre auf einem sauberen Papiertuch ab. Mit einer P200-Pipettenspitze mit breitem Durchgang werden die Sphäroide sofort in 50 Mikrolitern neutralisiertem Kollagen resuspendiert und die Sphäroid-Kollagenmischungen vorsichtig in jede Vertiefung des Objektträgers der Gewebekulturkammer mit acht Vertiefungen übertragen. Bringen Sie den Objektträger wieder in den Inkubator zurück, bis das Kollagen polymerisiert ist.

Nach etwa einer Stunde werden langsam mindestens 100 Mikroliter erwärmtes Kulturmedium mit der entsprechenden Behandlung in jede Vertiefung gegeben, um eine weitere Inkubation durchzuführen. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop, um optische Bildgebungsschnitte durch die eindringenden Sphäroide zu erfassen. Mit diesem Protokoll können Sphäroide aus einer Vielzahl von Zelllinien erzeugt werden.

Unter den entsprechenden Methylcellulose- und Serumbehandlungsbedingungen siedeln sich die einzelnen Zellen in der Mitte der Vertiefung an und kleben aneinander, um Sphäroide mit minimaler Haftung am Bohrlochboden zu bilden. Einige Zelllinien sind in der Lage, in Abwesenheit oder in geringen Konzentrationen von Methylcellulose an zellabweisenden Platten zu haften, was zur Bildung eines von einer Zellmonoschicht umgebenen Sphäroidea führt. Generell verhindern höhere Konzentrationen von Methylcellulose, dass die Zellen an der Vertiefung haften.

Eine zu hohe Konzentration an Methylcellulose verringert jedoch die Adhäsion von Zelle zu Zelle und verhindert, dass sich die Zellen am Boden der Vertiefung absetzen, was zur Bildung von losen Aggregaten und zahlreichen Satellitensphäroiden führt. Kollageneingebettete Sphäroide können mit einem Chemolockstoff behandelt werden, um die Invasion einzelner Zellen vom Sphäroid nach außen in die umgebende Matrix zu induzieren. In Kollagen eingebettete Sphäroide können durch Hellfeldmikroskopie abgebildet werden, um den Abstand und die Anzahl der eindringenden Zellen zu quantifizieren, oder durch Immunfluoreszenzmikroskopie, um die invasiven Strukturen zu visualisieren, die von den wandernden Zellen gebildet werden.

Es ist wichtig, den Zellen genügend Zeit zu lassen, um sich zu strukturell gesunden Sphäroiden zu sammeln, die robust genug sind, um sie ohne Fragmentierung zu manipulieren, und die leicht für ihre Verwendung in nachfolgenden Assays gesammelt werden können. Unser Zellwachstumsprotokoll kann für mehrere zellbiologische Assays weiter angepasst werden. Zum Beispiel kann das Einsetzen der Zellen in Medien, die mit hohen Konzentrationen von Methylcellulose angereichert sind, verwendet werden, um die Zellanoidresistenz zu beurteilen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dreidimensionale Zellsphäroide durch Aggregation erzeugt, was ein wertvolles Werkzeug für viele zellbiologische Anwendungen sein wird.