Name: Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Zellaggregationsmethode zur 3D-Sphäroid-Produktion mit Methylcellulose-Matrix. Dieses flexible Protokoll ermöglicht schnelle Isolation für Zellwanderungs- und Invasionsassays.

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Die Autoren danken M. Gordon vom Queen's University Biomedical Imaging Centre für die Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse der Cancer Research Society of Canada (19439) und der Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM) sowie durch Ontario Graduate Scholarships und Stipendien des Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL) sowie durch ein Craig Jury Summer Scholarship (SMM) unterstützt.

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<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und flexible Methode zur 3D - Zell Sphäroiden Herstellung der Architektur von in - vivo - Gewebe unter Verwendung von kostengünstigen und weithin verfügbare Reagenzien zu modellieren. Unser Protokoll nutzt die nicht-zytotoxischen und haftungsverbessernde Eigenschaften von MC 8, 9 Zellaggregation zu vermitteln und Zellschicht Bildung zu minimieren. Anders als Proteinbasis Matrices aus tierischen Quellen isoli...

Biologisch relevante Beurteilung der Tumorzellverhalten ist eine Herausforderung mit herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkulturmethoden, zum Teil , weil diese nicht in angemessener Weise die Zelle Mikroumgebung in vivo gefunden reflektieren. Alternative Ansätze enthält extrazellulären Matrixkomponenten in die Kultur (zB Boyden - Kammer - Assays) sind physiologisch repräsentativ für die in vivo Gewebeumgebung. Jedoch können sie für die Beurteilung der einzelnen Zellverhaltens begrenzt, und nicht den Komplex in vivo Kombinationen von Zell-Matrix- und Zell-Zell - Wechselwirkungen rekapitulieren, die Gewebe- oder Tumorwachstum 1, 2, 3 tragen. Die Verwendung von mehrzelligen Sphäroiden ist ein neuer Ansatz, der genauer die kompakte Architektur von in vivo Zellwachstum 1 wiedergibt ,4. Sphäroide können verwendet werden , Zell-Matrix - Wechselwirkungen von normalen Zellen zu untersuchen, sondern kann auch als Tumor - Analoga wirken Charakteristika der Tumorprogression, wie metastatische Wachstum oder drug resistance 4 zu modellieren. Sphäroide können in einer Matrix 5 oder schneller eingebettet durch Vermehrung von Einzelzellen gebildet werden, durch die Aggregation von mehreren Zellen fördern 7 eine Einzelzellcluster (zB hängenden Tropfen, Zentrifugationsverfahren) 6, zu bilden. Bestehende Zellaggregation Techniken können teure Materialien oder spezielle Ausrüstung erfordern. Darüber hinaus haben diese Sphäroide eine Vielzahl von Größen und Morphologien und schwierig sein kann, in großen Mengen, so dass Vergleiche zwischen den Wachstumsbedingungen oder Behandlungen schwer herzustellen. Schließlich wird durch diese Verfahren erzeugten Sphäroide kann schwierig sein, von dem proteinischen extracel zu isolierenin anderen Anwendungen zellulären Matrix, in der sie für den Einsatz eingebettet. Hier beschreiben wir eine robuste und einfach modifizierbar Zellaggregation Methode für die schnelle Bildung von einheitlich bemessen Zelle Sphäroide mit handelsüblichen U-bottom zellabweisenden Platten und ein inertes haftungsvermittelnden Matrix, Methylcellulose. Einmal gebildet, werden diese mehrzellige Sphäroide für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gut isoliert. Das Protokoll ist auch leicht zu erzeugen Sphäroide durch Zellproliferation geeignet, die verwendet werden können, andere Zellprozesse zu beurteilen. Hier zeigen wir Zellinvasionsassays, durch Immunfluoreszenzfärbung quantifiziert, und ein anoikis Assay, wie beispielsweise Anwendungen dieser zwei unterschiedlichen Sphäroidbildung Protokolle.

<table><tbody><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>zur Verwendung von PBS+ Waschpuffer; PBS+ Waschpuffer nach Zugabe von Calciumchlorid nicht autoklavieren</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Wird für PBS+ Waschpuffer verwendet; PBS+ Waschpuffer nach Zugabe von Magnesiumchlorid nicht autoklavieren</td></tr><tr><td>Name<</td><td>>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Für die Sphäroidbildung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-U-Boden-Zellabweisungsplatte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>Für die Kultivierung von SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 Zelllinien</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>Für die Kultivierung von TT-Zelllinien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filter vor der Verwendung zur Entfernung von partikulären Verunreinigungen</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Aufbereitung in Wasser bis 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Für die Kultivierung von HCT-116, BxPC-3 Zelllinien</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Dissoziationspuffer</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Invasion Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated 354231</td><td></td><td>Stock 3,1 mg/ml; Bei Gebrauch auf Eis halten</td></tr><tr><td>DMEM Phenolrot frei mit niedrigem Glukosespiegel&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Weniger Hintergrundfluoreszenz im Vergleich zu Phenolrot supplementiertem Medium</td></tr><tr><td>Neurotropher Faktor aus der Gliazelllinie</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemoattractant</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td>strong<td><>Katalognummer><</td><td>strongKommentare</td></tr><tr><td>Für die Immunfluoreszenzmikroskopie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Deckglas</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72225-01</td><td>Zum Einbetten von exzidierten Sphäroiden</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Wird verwendet, um Aktin im Verhältnis 1:200 zu färben</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Wird in BSA-Blockierungspuffer verwendet</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>Antifade</td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Wird in MOWIOL-Eindeckmedium</td></tr><tr><td>verwendet ImageJ Software</td><td>Freeware, NIH-Wird</td><td></td> <td>für die Bildanalyse verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>Zum Einbetten von exzidierten Sphäroiden</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Verwendet im MOWIOL-Einbettmedium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Wird in Fixierungspuffer</td></tr><tr><td>verwendet Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Wird in Permeabilisierungspuffer verwendet</td></tr></tbody></table>

eine effiziente und flexible zellaggregationsmethode für 3d-sphäroid-produktion

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer - Zellkultur - Modell nicht ausreichend das in vivo Verhalten von Geweben, die Wechselwirkungen komplexen Zell-Zell- und Zell-Matrix beinhaltet. Dreidimensionale (3D) Zellkulturtechniken sind eine neue Innovation entwickelt, um die Mängel der adhärenten Zellkultur zu adressieren. Während verschiedene Techniken zur Gewebe Analoga in vitro Erzeugung entwickelt wurden , sind diese Verfahren häufig komplex, teuer herzustellen, erfordern spezielle Ausrüstung und durch Kompatibilität mit nur bestimmte Zelltypen beschränkt. Hier beschreiben wir eine schnelle und flexible Protokoll für Zellen in vielzelligen 3D Sphäroide konsistenter Größe aggregieren, die mit Wachstum einer Vielfalt von Tumor- und normalen Zelllinien kompatibel ist. Wir verwenden verschiedene Konzentrationen von Serum und Methylcellulose (MC) verankerungsunabhängigen Sphäroid Erzeugung und verhindern die Bildung von Zell-Monoschichten in einer hoch reproduzierbaren Weise zu fördern. Optimale Bedingungen für indivIdual Zelllinien kann durch Einstellen MC oder Serumkonzentrationen in der Sphäroidbildung Medium erreicht werden. Die 3D-Sphäroiden erzeugt wird, kann für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gesammelt werden, einschließlich Zellsignalisierung oder Genexpressionsstudien, Kandidat Wirkstoff-Screening oder bei der Untersuchung von zellulären Prozessen wie Tumorzellinvasion und Migration. Das Protokoll wird auch klonale Sphäroide aus einzelnen Zellen zu erzeugen, ohne weiteres angepasst und angepasst werden kann, verankerungsunabhängiges Wachstum und anoikis Beständigkeit zu bewerten. Insgesamt bietet unser Protokoll eine leicht modifizierbare Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von 3D - Zell Sphäroide, um die 3D - Mikroumgebung von Geweben und modellieren das in vivo Wachstum von normalen und Tumorzellen zu rekapitulieren.

Wir beschreiben eine flexible und effiziente Methode diskreten Sphäroiden zu erzeugen, unter Verwendung von zellabstoßenden Platten und Sphäroidbildung Medien mit MC ergänzt. Unter den geeigneten Bedingungen von MC und Serum, siedeln einzelnen Zellen und halten uns zusammen in der Mitte des Brunnens Sphäroiden zu bilden, mit minimaler Einhaltung des Näpfchenboden. Unter Verwendung dieses Protokolls, Sphäroide wurden aus einer Vielzahl von Zelllinien (2B) erzeugt wird . T...

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

NARRATOR Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, große Mengen stabiler zellulärer Sphäroide durch Zellaggregation effizient herzustellen, um sie für eine Vielzahl zellbasierter Assays zu verwenden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine nicht-proteinhaltige, wasserlösliche Matrix für die Zellaggregation und die Bildung von Sphäroiden nutzt, wodurch eine einfache und schnelle Isolierung der Sphäroide ermöglicht wird. Diese Methode kann dazu beitragen, neue Erkenntnisse in der Zellbiologie über die Auswirkungen von Zell-Zell- und Zell/Matrix-Interaktionen auf das Gewebewachstum in einem dreidimensionalen Mikromilieu zu gewinnen.NARRATOR Bevor Sie die Aggregate herstellen, erhitzen Sie 50 Milliliter ultrareines Wasser auf 80 Grad Celsius und geben Sie 10 Gramm Methylcellulosepulver hinzu. Rühren Sie die Suspension so lange, bis die Partikel gleichmäßig verteilt sind. Geben Sie dann kaltes ultrareines Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 Millilitern hinzu und lagern Sie die Partikel über Nacht bei 4 Grad Celsius, bis die Lösung klar und strohfarben ist und keine sichtbaren Feststoffe mehr enthält.Lassen Sie die Lösung durch einen 0,45-Mikrometer-Filter laufen, um ungelöste Bestandteile zu entfernen, und verdünnen Sie diese im Verhältnis 1:5 auf Milligramm pro Milliliter der filtrierten Lösung im geeigneten Kulturmedium. Anschließend filtrieren Sie das mit Methylcellulose angereicherte Medium durch einen 0,22-Mikrometer-Filter. Danach waschen Sie im Biosicherheitswerkbank eine 70 % konfluente Subkultur mit PBS und lösen die Zellen durch Zugabe von drei Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung im Zellkulturinkubator ab. Nach einigen Minuten die Zellen unter einem Lichtmikroskop bei 10x-Vergrößerung überprüfen. Sobald die Zellen sich von der Platte gelöst haben, die Reaktion mit sieben Milliliter an Serum ergänztem Kulturmedium neutralisieren. Die Zelllösung in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen übertragen und die freigesetzten Zellen anschließend durch Zentrifugation sammeln.Die häufigste Ursache für eine erfolglose Sphäroidbildung, abgesehen von kontaminierenden Partikeln, ist die Verwendung suboptimaler Konzentrationen von Methylcellulose oder Serum für die Aggregation und das Wachstum Ihrer spezifischen Zelllinie. NARRATOR: Mit einer P1000-Mikropipette und einer Filterpitze den Pellet dreimal bis fünfmal mit einem Milliliter des Sphäroidbildungsmediums umpipettieren, wobei die Pipettenspitze unter leichtem Winkel gegen den Boden des Reaktionsgefäßes gedrückt wird und langsam pipettiert wird, ohne den gesamten Inhalt der Spitze auszupressen, um den Pellet abzuscheren. Nach der Zellzählung die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 × 10⁴ Zellen pro Milliliter verdünnen und ein steriles Mehrkanalpipettierreservoir mit filtriertem, hochreinem Wasser ausspülen, um Staub und Fasern zu entfernen.Geben Sie die Zellen in das Reservoir und übertragen Sie mithilfe von Filterpipettenspitzen jeweils 100 Mikroliter der Zellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-U-Boden-Platte mit zellenabstoßender Oberfläche. Mischen Sie die Zellsuspension regelmäßig, um ein Absinken der Zellen auf den Boden des Reservoirs zu verhindern. Sobald sich alle Zellen abgesetzt haben, stellen Sie die Platte in einen Zellkulturinkubator und überprüfen Sie die Vertiefungen täglich auf die Bildung von Sphäroiden. Die Zellen sollten innerhalb von sechs Stunden auf den Boden jeder Vertiefung absinken und sich in der Regel innerhalb von 24 bis 48 Stunden zu einem Sphäroid aggregieren.Um die erfolgreiche Bildung eines Sphäroiden zu bestätigen, verwenden Sie eine P10-Pipettenspitze, um unter dem Lichtmikroskop vorsichtig Medium über den Sphäroiden zu pipettieren. Korrekt gebildete Sphäroide lösen sich von der Platte und rollen, wodurch ihre dreidimensionale Struktur bestätigt wird. Um die Sphäroide in Kollagen einzubetten, verwenden Sie die Umkehrpipettiermethode, um den Boden jedes Wells einer achtlochigen Gewebekulturkammerplatte gleichmäßig mit mindestens 50 µL neutralisiertem Kollagen pro Well zu beschichten.Wenn alle Vertiefungen abgedeckt wurden, stellen Sie die Kammerplatte in eine 35 Millimeter große Zellkulturschale, die mit ultrareinem Wasser gefüllt ist, und geben Sie diese in eine 10 Zentimeter große Zellkulturschale. Inkubieren Sie die 10 Zentimeter große Zellkulturschale etwa eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Sobald das Kollagen polymerisiert ist, überführen Sie die vorformierten Sphäroide vorsichtig mit einer P1000-Filterpipettenspitze in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Es ist entscheidend, dass die Kollagen-Basisschichten so lange inkubiert werden, bis sie vollständig polymerisiert sind, um zu verhindern, dass das Kollagen beim Hinzufügen der Sphäroide oder des Mediums gestört wird.Sprecher: Sammeln Sie die geernteten Sphäroide in einer Tischzentrifuge und entfernen Sie mittels einer P200-Pipette die Überstände, wobei überschüssiger Überstand durch Umkippen des Gefäßes auf ein sauberes Papiertuch abgezogen wird, falls erforderlich. Lösen Sie die Sphäroide mit einer breitgebohrten P200-Pipettenspitze unverzüglich in 50 Mikroliter neutralisiertem Kollagen auf und überführen Sie vorsichtig die Sphäroid-Kollagen-Gemische in jede Vertiefung der achtlochigen Gewebekulturkammerplatte. Stellen Sie die Platte anschließend in den Inkubator, bis das Kollagen polymerisiert ist.Nach ungefähr einer Stunde mindestens 100 µL vorgewärmtes Kulturmedium, das die jeweils gewünschte Behandlung enthält, langsam zu jedem Gut hinzufügen und weitere inkubieren. Anschließend mit einem Fluoreszenzmikroskop optische Bildschnitte durch die eindringenden Sphäroide aufnehmen. Mit diesem Protokoll können Sphäroide aus einer Vielzahl von Zelllinien erzeugt werden.Unter geeigneten Methylcellulose- und Serumbedingungen lagern sich die einzelnen Zellen ab und verbinden sich im Zentrum der Vertiefung zu Sphäroiden, wobei eine minimale Anheftung an den Boden der Vertiefung erfolgt. Einige Zelllinien können sich in Abwesenheit oder bei niedrigen Konzentrationen von Methylcellulose an zellenabstoßende Platten anheften, wodurch sich ein Sphäroid bildet, das von einer zellulären Monoschicht umgeben ist. Im Allgemeinen verhindern höhere Konzentrationen von Methylcellulose die Anheftung der Zellen an die Vertiefung.Jedoch verringert eine zu hohe Konzentration an Methylcellulose die Zell-Zell-Adhäsion und verhindert, dass die Zellen sich am Boden der Vertiefung absetzen, was zur Bildung lockerer Aggregate und zahlreicher Satelliten-Sphäroide führt. In Kollagen eingebettete Sphäroide können mit einem Chemoattraktans behandelt werden, um die Invasion einzelner Zellen von dem Sphäroid ausgehend in die umgebende Matrix zu induzieren. Fixierte, in Kollagen eingebettete Sphäroide können mittels Hellfeldmikroskopie abgebildet werden, um Abstand und Anzahl der eindringenden Zellen zu quantifizieren, oder mittels Immunfluoreszenzmikroskopie, um die invasiven Strukturen der wandernden Zellen sichtbar zu machen.Es ist wichtig, ausreichend Zeit für die Aggregation der Zellen zu gewähren, damit strukturell stabile Sphäroide entstehen, die robust genug sind, um sie ohne Zerfall zu handhaben, und die leicht für den Einsatz in nachfolgenden Assays gesammelt werden können. Unser Zellkulturprotokoll kann für verschiedene zellbiologische Assays weiter angepasst werden. Beispielsweise kann die Ansiedlung der Zellen in mit hohen Konzentrationen an Methylcellulose angereicherten Medien zur Beurteilung der zellulären Resistenz verwendet werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dreidimensionale Zellsphäroide durch Aggregation erzeugt, was ein wertvolles Hilfsmittel für viele Anwendungen der Zellbiologie darstellen wird.

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Forschung

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Biology

Biologie

Wir beschreiben eine einfache, schnelle Methode zur Erzeugung von 3D-Gewebe-like Sphäroide und ihre mögliche Anwendung auf Unterschiede in der Zell-Zell-Interaktionen zu quantifizieren.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

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Hier beschreiben wir die großtechnische Produktion von aus Fett gewonnenen Stroma-/Stammzell-Sphäroiden (ASC) unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems zur Aussaat der Zellsuspension, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Diese ASC-Sphäroide können als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze verwendet werden.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

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