Name: Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Zellaggregationsmethode zur 3D-Sphäroid-Produktion mit Methylcellulose-Matrix. Dieses flexible Protokoll ermöglicht schnelle Isolation für Zellwanderungs- und Invasionsassays.

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Die Autoren danken M. Gordon vom Queen's University Biomedical Imaging Centre für die Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse der Cancer Research Society of Canada (19439) und der Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM) sowie durch Ontario Graduate Scholarships und Stipendien des Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL) sowie durch ein Craig Jury Summer Scholarship (SMM) unterstützt.

<ol><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27chemoinvasion%27+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
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<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li>
<li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Face+Med%22%5BJournal%5D)">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4(2007).</li>
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<li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells%3A+How+to+go+three-dimensional%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und flexible Methode zur 3D - Zell Sphäroiden Herstellung der Architektur von in - vivo - Gewebe unter Verwendung von kostengünstigen und weithin verfügbare Reagenzien zu modellieren. Unser Protokoll nutzt die nicht-zytotoxischen und haftungsverbessernde Eigenschaften von MC 8, 9 Zellaggregation zu vermitteln und Zellschicht Bildung zu minimieren. Anders als Proteinbasis Matrices aus tierischen Quellen isoli...

Biologisch relevante Beurteilung der Tumorzellverhalten ist eine Herausforderung mit herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkulturmethoden, zum Teil , weil diese nicht in angemessener Weise die Zelle Mikroumgebung in vivo gefunden reflektieren. Alternative Ansätze enthält extrazellulären Matrixkomponenten in die Kultur (zB Boyden - Kammer - Assays) sind physiologisch repräsentativ für die in vivo Gewebeumgebung. Jedoch können sie für die Beurteilung der einzelnen Zellverhaltens begrenzt, und nicht den Komplex in vivo Kombinationen von Zell-Matrix- und Zell-Zell - Wechselwirkungen rekapitulieren, die Gewebe- oder Tumorwachstum 1, 2, 3 tragen. Die Verwendung von mehrzelligen Sphäroiden ist ein neuer Ansatz, der genauer die kompakte Architektur von in vivo Zellwachstum 1 wiedergibt ,4. Sphäroide können verwendet werden , Zell-Matrix - Wechselwirkungen von normalen Zellen zu untersuchen, sondern kann auch als Tumor - Analoga wirken Charakteristika der Tumorprogression, wie metastatische Wachstum oder drug resistance 4 zu modellieren. Sphäroide können in einer Matrix 5 oder schneller eingebettet durch Vermehrung von Einzelzellen gebildet werden, durch die Aggregation von mehreren Zellen fördern 7 eine Einzelzellcluster (zB hängenden Tropfen, Zentrifugationsverfahren) 6, zu bilden. Bestehende Zellaggregation Techniken können teure Materialien oder spezielle Ausrüstung erfordern. Darüber hinaus haben diese Sphäroide eine Vielzahl von Größen und Morphologien und schwierig sein kann, in großen Mengen, so dass Vergleiche zwischen den Wachstumsbedingungen oder Behandlungen schwer herzustellen. Schließlich wird durch diese Verfahren erzeugten Sphäroide kann schwierig sein, von dem proteinischen extracel zu isolierenin anderen Anwendungen zellulären Matrix, in der sie für den Einsatz eingebettet. Hier beschreiben wir eine robuste und einfach modifizierbar Zellaggregation Methode für die schnelle Bildung von einheitlich bemessen Zelle Sphäroide mit handelsüblichen U-bottom zellabweisenden Platten und ein inertes haftungsvermittelnden Matrix, Methylcellulose. Einmal gebildet, werden diese mehrzellige Sphäroide für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gut isoliert. Das Protokoll ist auch leicht zu erzeugen Sphäroide durch Zellproliferation geeignet, die verwendet werden können, andere Zellprozesse zu beurteilen. Hier zeigen wir Zellinvasionsassays, durch Immunfluoreszenzfärbung quantifiziert, und ein anoikis Assay, wie beispielsweise Anwendungen dieser zwei unterschiedlichen Sphäroidbildung Protokolle.

<table><tbody><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>zur Verwendung von PBS+ Waschpuffer; PBS+ Waschpuffer nach Zugabe von Calciumchlorid nicht autoklavieren</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Wird für PBS+ Waschpuffer verwendet; PBS+ Waschpuffer nach Zugabe von Magnesiumchlorid nicht autoklavieren</td></tr><tr><td>Name<</td><td>>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Für die Sphäroidbildung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-U-Boden-Zellabweisungsplatte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>Für die Kultivierung von SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 Zelllinien</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>Für die Kultivierung von TT-Zelllinien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filter vor der Verwendung zur Entfernung von partikulären Verunreinigungen</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Aufbereitung in Wasser bis 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Für die Kultivierung von HCT-116, BxPC-3 Zelllinien</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Dissoziationspuffer</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Invasion Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated 354231</td><td></td><td>Stock 3,1 mg/ml; Bei Gebrauch auf Eis halten</td></tr><tr><td>DMEM Phenolrot frei mit niedrigem Glukosespiegel&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Weniger Hintergrundfluoreszenz im Vergleich zu Phenolrot supplementiertem Medium</td></tr><tr><td>Neurotropher Faktor aus der Gliazelllinie</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemoattractant</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td>strong<td><>Katalognummer><</td><td>strongKommentare</td></tr><tr><td>Für die Immunfluoreszenzmikroskopie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Deckglas</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72225-01</td><td>Zum Einbetten von exzidierten Sphäroiden</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Wird verwendet, um Aktin im Verhältnis 1:200 zu färben</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Wird in BSA-Blockierungspuffer verwendet</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>Antifade</td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Wird in MOWIOL-Eindeckmedium</td></tr><tr><td>verwendet ImageJ Software</td><td>Freeware, NIH-Wird</td><td></td> <td>für die Bildanalyse verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>Zum Einbetten von exzidierten Sphäroiden</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Verwendet im MOWIOL-Einbettmedium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Wird in Fixierungspuffer</td></tr><tr><td>verwendet Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Wird in Permeabilisierungspuffer verwendet</td></tr></tbody></table>

eine effiziente und flexible zellaggregationsmethode für 3d-sphäroid-produktion

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer - Zellkultur - Modell nicht ausreichend das in vivo Verhalten von Geweben, die Wechselwirkungen komplexen Zell-Zell- und Zell-Matrix beinhaltet. Dreidimensionale (3D) Zellkulturtechniken sind eine neue Innovation entwickelt, um die Mängel der adhärenten Zellkultur zu adressieren. Während verschiedene Techniken zur Gewebe Analoga in vitro Erzeugung entwickelt wurden , sind diese Verfahren häufig komplex, teuer herzustellen, erfordern spezielle Ausrüstung und durch Kompatibilität mit nur bestimmte Zelltypen beschränkt. Hier beschreiben wir eine schnelle und flexible Protokoll für Zellen in vielzelligen 3D Sphäroide konsistenter Größe aggregieren, die mit Wachstum einer Vielfalt von Tumor- und normalen Zelllinien kompatibel ist. Wir verwenden verschiedene Konzentrationen von Serum und Methylcellulose (MC) verankerungsunabhängigen Sphäroid Erzeugung und verhindern die Bildung von Zell-Monoschichten in einer hoch reproduzierbaren Weise zu fördern. Optimale Bedingungen für indivIdual Zelllinien kann durch Einstellen MC oder Serumkonzentrationen in der Sphäroidbildung Medium erreicht werden. Die 3D-Sphäroiden erzeugt wird, kann für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gesammelt werden, einschließlich Zellsignalisierung oder Genexpressionsstudien, Kandidat Wirkstoff-Screening oder bei der Untersuchung von zellulären Prozessen wie Tumorzellinvasion und Migration. Das Protokoll wird auch klonale Sphäroide aus einzelnen Zellen zu erzeugen, ohne weiteres angepasst und angepasst werden kann, verankerungsunabhängiges Wachstum und anoikis Beständigkeit zu bewerten. Insgesamt bietet unser Protokoll eine leicht modifizierbare Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von 3D - Zell Sphäroide, um die 3D - Mikroumgebung von Geweben und modellieren das in vivo Wachstum von normalen und Tumorzellen zu rekapitulieren.

Wir beschreiben eine flexible und effiziente Methode diskreten Sphäroiden zu erzeugen, unter Verwendung von zellabstoßenden Platten und Sphäroidbildung Medien mit MC ergänzt. Unter den geeigneten Bedingungen von MC und Serum, siedeln einzelnen Zellen und halten uns zusammen in der Mitte des Brunnens Sphäroiden zu bilden, mit minimaler Einhaltung des Näpfchenboden. Unter Verwendung dieses Protokolls, Sphäroide wurden aus einer Vielzahl von Zelllinien (2B) erzeugt wird . T...

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

NARRATOR Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, große Mengen stabiler zellulärer Sphäroide durch Zellaggregation effizient herzustellen, um sie für eine Vielzahl zellbasierter Assays zu verwenden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine nicht-proteinhaltige, wasserlösliche Matrix für die Zellaggregation und die Bildung von Sphäroiden nutzt, wodurch eine einfache und schnelle Isolierung der Sphäroide ermöglicht wird. Diese Methode kann dazu beitragen, neue Erkenntnisse in der Zellbiologie über die Auswirkungen von Zell-Zell- und Zell/Matrix-Interaktionen auf das Gewebewachstum in einem dreidimensionalen Mikromilieu zu gewinnen.NARRATOR Bevor Sie die Aggregate herstellen, erhitzen Sie 50 Milliliter ultrareines Wasser auf 80 Grad Celsius und geben Sie 10 Gramm Methylcellulosepulver hinzu. Rühren Sie die Suspension so lange, bis die Partikel gleichmäßig verteilt sind. Geben Sie dann kaltes ultrareines Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 Millilitern hinzu und lagern Sie die Partikel über Nacht bei 4 Grad Celsius, bis die Lösung klar und strohfarben ist und keine sichtbaren Feststoffe mehr enthält.Lassen Sie die Lösung durch einen 0,45-Mikrometer-Filte

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine einfache, schnelle Methode zur Erzeugung von 3D-Gewebe-like Sphäroide und ihre mögliche Anwendung auf Unterschiede in der Zell-Zell-Interaktionen zu quantifizieren.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

Hier beschreiben wir die großtechnische Produktion von aus Fett gewonnenen Stroma-/Stammzell-Sphäroiden (ASC) unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems zur Aussaat der Zellsuspension, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Diese ASC-Sphäroide können als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze verwendet werden.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur kostengünstigen Herstellung von Gewebesphäroiden in großem Maßstab unter Verwendung eines 3D-gedruckten stempelähnlichen Geräts.

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Wir stellen ein Protokoll für die Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide und deren phänotypische Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik vor.

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsphäroiden mit anschließender Hydrogelverkapselung ermöglicht. Es ist weit verbreitet, da es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Es wäre besonders nützlich für die Erforschung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen und die Erstellung von In-vitro-Gewebephysiologie - oder Pathologiemodellen.

Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen

Zellsphäroide gelten als ein potenzielles Modell im Bereich biologischer Anwendungen. Dieser Artikel beschreibt Protokolle zur skalierbaren Erzeugung von Zellsphäroiden unter Verwendung eines 3D-Akustik-Assemblierungsgeräts, das eine effiziente Methode für die robuste und schnelle Herstellung einheitlicher Zellsphäroide bietet.

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Erfahren Sie eine effiziente Zellaggregationsmethode zur 3D-Sphäroid-Produktion mit Methylcellulose-Matrix. Dieses flexible Protokoll ermöglicht schnelle Isolation für Zellwanderungs- und Invasionsassays.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

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