HCR-DNA FISH: Eine Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnik zum Nachweis viraler DNA in infizierten Zellen

- HCR-FISH oder Hybridisierungskettenreaktion-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung weist virale Nukleinsäuresequenzen im Genom virusinfizierter Zellen nach. Befestigen Sie zunächst eine adhärente Kultur von virusinfizierten Zellen und permeablizieren Sie deren Zellmembran. Inkubieren Sie die Zellen mit einem Hybridisierungspuffer, um Hintergrundsignale zu reduzieren. Behandeln Sie die Zellen mit Initiatorsonden, die eine HCR-Initiatorsequenz und eine komplementäre Sequenz enthalten, die auf die virale DNA abzielt. Erhitzen Sie die Probe, um die doppelsträngige DNA des Wirts zu einer einzelsträngigen DNA zu denaturieren. Inkubieren Sie die Probe, damit die Sonde an ihre komplementäre virale Ziel-DNA-Sequenz binden kann.

Als nächstes wird die Behandlung mit einem Amplifikationspuffer durchgeführt, der zwei Sätze fluoreszenzmarkierter Oligonukleotid-Hairpin-Sonden, H1 und H2, enthält. Inkubieren, um die Hybridisierungskettenreaktion zu erleichtern. Die ungepaarte Initiatorsequenz bindet an ihren komplementären H1-Schwanz, wodurch die Haarnadelstruktur linearisiert wird. Die exponierte H1-Sequenz bindet in ähnlicher Weise an ihren komplementären H2-Schwanz. Das nachfolgende H2 bindet weiterhin an ein H1-Schweif. Auf diese Weise verstärken sich die fluoreszenzmarkierten Sonden um die Zielstelle herum und senden ein starkes Signal aus. Behandeln Sie die Probe mit DAPI, um die Zellkerne zu färben.

Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die helle Fluoreszenz aus den Replikationsherden in den Zellkernen infizierter Zellen zu detektieren. Im folgenden Protokoll werden wir in situ HCR-DNA FISH zum Nachweis des Merkel-Zell-Polyomavirus-Genoms in infizierten primären menschlichen Hautzellen zeigen.

- Befestigen Sie zunächst die Zellen 10 Minuten lang mit 4 % PFA in PBS auf Deckgläsern. Waschen Sie dann die Deckgläser zweimal mit PBS und behandeln Sie sie über Nacht mit 70% Ethanol bei 4 Grad Celsius, um die Zellen zu permeablieren. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Ethanol durch einen Sondenhydratationspuffer und inkubieren Sie es 60 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Proben vorzu hybridisieren. 30 Minuten vor Ende der Inkubation vor der Hybridisierung die Sonden in einer Verdünnung von 1:500 in Sondenhybridisierungslösung verdünnen und bei 45 Grad Celsius inkubieren.

Wenn die Inkubationen abgeschlossen sind, pipettieren Sie für jeden Deckglas etwa 10 Mikroliter der verdünnten Sondenmischung auf einen Objektträger. Legen Sie jedes Deckglas mit der Zellseite nach unten auf das jeweilige Tröpfchen der Hybridisierungsmischung. Versiegeln Sie mit einer großzügigen Menge Gummizement die Ränder und die Rückseite jedes Deckglases mit seinem Gleitverschluss. Legen Sie die Folien auf die flache Seite eines Heizblocks und erhitzen Sie sie 3 Minuten lang auf 94 Grad Celsius. Danach werden die Objektträger in eine befeuchtete Kammer überführt und über Nacht bei 45 Grad Celsius inkubiert.

Am nächsten Tag ziehst du den Gummizement vorsichtig mit einer Pinzette ab. Legen Sie die Deckfolien mit der Zellseite nach oben in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal bei Raumtemperatur mit Sondenwaschpuffer. Geben Sie 200 Mikroliter Amplifikationspuffer in jede Vertiefung mit einem Deckglas und inkubieren Sie 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit glühen Sie jede der beiden markierten Oligonukleotid-Haarnadeln und erkennen die Sonden in separaten PCR-Röhrchen, indem Sie sie 90 Sekunden lang auf 95 Grad Celsius erhitzen und dann 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen. Mischen Sie die Haarnadeln in einem Amplifikationspuffer in einer Verdünnung von 1:50

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Spannen Sie anschließend Paraffinfolie über die offene Oberfläche eines 12-Well-Plattendeckels, um eine Oberfläche für die Amplifikationsreaktion zu schaffen. Pipettieren Sie für jedes Deckglas 50 bis 100 Mikroliter Tröpfchen der Haarnadelmischung auf die Paraffinfolie. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig jeden Deckglas aus der Vorverstärkerlösung und berühren Sie den Rand zum Trocknen mit einem porösen Einwegtuch. Legen Sie jedes getrocknete Deckglas mit der Zellseite nach unten auf ein Amplifikationströpfchen. Den Tellerdeckel in eine befeuchtete Kammer geben und über Nacht bei Raumtemperatur und im Dunkeln inkubieren.

Bringen Sie die Deckgläser am nächsten Tag wieder in die Vertiefungen der 24-Well-Platte zurück. 5x SSCT-haltiges DAPI in einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter in jede Vertiefung geben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Proben danach zweimal mit 5x SSCT bei Raumtemperatur. Montieren Sie die gewaschenen Deckgläser auf Objektträger und verwenden Sie ein inverses Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen zu analysieren und die Proben abzubilden.