Schnelle Kultivierung primärer melanischer Melanozyten und Fibroblasten: Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus einer ganzen Maushautprobe

- Die Haut besteht aus verschiedenen Zellen, die ihre verschiedenen Schichten bevölkern. Melanozyten, die Melanin-produzierenden Zellen, lokalisieren sich an der epidermal-dermalen Verbindung, während sich die Fibroblasten, die bindegewebsbildenden Zellen, in der Dermis befinden.

Um Melanozyten und Fibroblasten schnell zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme des Rüssels eines euthanasierten Mausjungen. Schneiden Sie die Haut ventral durch die Länge des Rumpfes. Schälen Sie die Haut, die die epidermale und dermale Schicht enthält, und zerkleinern Sie das Gewebe in kleine Stücke.

Behandeln Sie nun mit einem Verdauungspuffer, der Trypsin- und Kollagenase-Enzyme enthält, die die extrazelluläre Matrix abbauen und die Zellen in Suspension bringen. Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren, und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in Melanozytenmedien und überführen Sie die Suspension in eine Multiwell-Platte.

Während der Kultur haften die meisten Fibroblasten am Vertiefungsboden, während die Melanozyten und andere Epidermiszellen in Suspension bleiben. Aspirieren Sie die suspendierten Zellen und fügen Sie der Fibroblastenkultur fibroblastenspezifische Medien hinzu, um ihr Wachstum zu fördern. Übertragen Sie die aspirierte Suspension in eine frische, mit Kollagen beschichtete Vertiefung, um die Bildung einer adhärenten Kultur zu unterstützen.

Ergänzen Sie mit Geneticin, einem Antibiotikum, und fügen Sie frische Melanozyten-Wachstumsmedien hinzu. Geneticin eliminiert selektiv alle verbleibenden Fibroblasten, während das Medium das Wachstum der Melanozyten gegenüber anderen epidermalen Zelltypen fördert. Im folgenden Protokoll werden Melanozyten und Fibroblasten aus der Haut von murinen Welpen isoliert.

- Rollen Sie in einem Laminar-Flow-Schrank den Rüssel jeder euthanasierten Maus kurz in eine sterile Petrischale, die 70 % Ethanol enthält. Nehmen Sie die Maus aus dem Ethanol und legen Sie sie in eine leere sterile Petrischale. Als nächstes sterilisieren Sie die chirurgische Schere in 70 % Ethanol. Verwenden Sie diese Schere, um einen Schnitt in die Haut auf der Bauchseite des Rumpfes zu machen, beginnend am Hals und weiter bis zum Schwanz. Mit einer sterilen Pinzette die Haut vom Rüssel der Maus abziehen und überschüssiges Fettgewebe von der dermalen Seite der Haut entfernen.

Legen Sie die Haut mit der Dermisseite nach unten in eine 6-Well-Schüssel mit 3 Millilitern 1x Antibiotikum/Antimykotikum. 2 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Schalten Sie dann den Taschentuch-Zerkleinerer ein und passen Sie die Einstellungen an die hier gezeigten an.

- Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Messer des Gewebehackers installieren und die Maschine bedienen.

- Übertragen Sie die Haut mit der Dermisseite nach unten in eine sterile Gewebezerkleinererschale und führen Sie die Haut dreimal vollständig durch den Gewebezerkleinerer. Danach wird die homogenisierte Haut in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 3 Millilitern Hautverdauungspuffer überführt.

Mischen Sie die resultierende Suspension mit einer P1000-Mikropipette, indem Sie sie zehn- bis fünfzehnmal kräftig auf und ab pipettieren. Verschließen Sie das konische Röhrchen und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius, wobei Sie darauf achten, das Röhrchen alle 3 bis 5 Minuten umzudrehen.

Anschließend zentrifugieren Sie das Röhrchen in einem schwingenden Schaufelrotor bei 750 x g bei Raumtemperatur für 5 Minuten, um die Zellen im Hauthomogenat zu pelletieren. Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um den Hautverdauungspuffer langsam und vollständig zu entfernen, und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

- Achten Sie darauf, den gesamten Verdauungspuffer der Haut abzusaugen. Wenn Sie Probleme haben, waschen Sie das Zellpellet mit 2 bis 3 Millilitern Melanozytenmedium und wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie überschüssigen Hautverdauungspuffer

- Resuspendieren Sie dann das Zellpellet gründlich in 1 Milliliter Melanozytenmedium, indem Sie mit einer P1000-Pipette fünfzehn bis zwanzig Mal auf und ab pipettieren. Die resultierende Zelllösung wird tropfenweise in eine unbeschichtete Vertiefung in einer 6-Well-Schale überführt, die 1 Milliliter Melanozytenmedium enthält. Inkubieren Sie das plattierte Hauthomogenat in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 40 Minuten.

Übertragen Sie danach den Kulturüberstand aus der unbeschichteten Schale in eine Vertiefung einer vorgewaschenen, mit Kollagen beschichteten 6-Well-Schale. Geben Sie G418 so in das Medium, dass die Endkonzentration 100 Nanogramm pro Milliliter beträgt. Geben Sie 2 Milliliter Fibroblastenmedium in eine Vertiefung der unbeschichteten Schale, die nun adhärente Fibroblasten enthält. Inkubieren Sie beide Kulturen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Nach 16 bis 24 Stunden Inkubation aspirieren Sie das Medium und alle Rückstände aus jeder Kultur separat. Waschen Sie jedes Geschirr zweimal und verwenden Sie 1 Milliliter PBS für jede Wäsche. Geben Sie dann 2 Milliliter frisches Melanozytenmedium in die Melanozytenkultur und fügen Sie 2 Milliliter frisches Fibroblastenmedium in die Fibroblastenkultur hinzu.