JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:45 Min. • April 30th, 2023
- Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die DNA-Bindungsdomänen enthalten. Sie binden an spezifische DNA-Sequenzen und helfen, die Genexpression in Zellen zu regulieren. Um die Expression von Transkriptionsfaktoren in schuppenassoziierten Melanozyten nachzuweisen, werden zunächst dunkel pigmentierte Rückenschuppen von einem anästhesierten Zebrafisch entnommen. Fixieren Sie die Schuppen und behandeln Sie sie mit einer Permeabilisierungslösung, um die einzelnen Melanozyten durchlässig zu machen.
Mit einer Bleichlösung behandeln, um das dunkle Melaninpigmentgranulat aus den Zellen zu entfernen. Durch diesen Bleichprozess wird die Wahrscheinlichkeit von pigmentassoziierten Hintergrundsignalen während der nachfolgenden Färbeschritte eliminiert. Inkubieren Sie mit einer Blockierungslösung, die Proteine enthält, um unspezifische Proteinbindungsstellen auf der Zelloberfläche zu blockieren.
Behandeln Sie nun die Probe mit den gewünschten Primärantikörpern. Diese Antikörper binden an ihre Zieltranskriptionsfaktoren in den Zellen. Markieren Sie anschließend die Probe mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern, die für die Primärantikörper spezifisch sind. Behandeln Sie die Probe zusätzlich mit einem geeigneten fluoreszierenden DNA-Bindungsfarbstoff, um die Zellkerne zu färben. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um helle Fluoreszenzemissionen von den Transkriptionsfaktor-Antikörper-Komplexen und Zellkernen zu detektieren.
Im folgenden Protokoll zeigen wir die Immunfärbung von dorsalen schuppenassoziierten Melanozyten, die Melanozyten-induzierenden Transkriptionsfaktor-A, oder mitfa, in einem transgenen Zebrafisch exprimieren.
- Um eine Immunfärbung durchzuführen, betäuben Sie den Fisch in 0,17 Milligramm pro Milliliter Tricain. Verwenden Sie bei einfallendem Licht unter einem Präpariermikroskop eine scharfe Pinzette mit feiner Spitze, um die Rückenschuppen zu zupfen, und achten Sie darauf, die melanozytenhaltige Hälfte der Schuppe nicht zu beschädigen. Legen Sie die Waage direkt von der Pinzette in 1 Milliliter Fixiermittel und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur unter Drehen für mindestens 2 Stunden. Setzen Sie den Fisch in Fischwasser um und überwachen Sie den Fisch, um die erfolgreiche Genesung zu bestätigen.
Um pigmentierte Melanozyten zu bleichen, waschen Sie zunächst feste Schuppen in PBST zweimal für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie als nächstes 1 Milliliter frisch hergestellte Bleichlösung hinzu und bedecken Sie sie mit Parafilm oder Kappenverschlüssen, um zu verhindern, dass das Gas die Röhrchen aufplatzt. Bleiche weiter, bis das Pigment verschwunden ist. Dann viermal 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBST waschen.
Mindestens 30 Minuten in Blocklösung inkubieren. Dann über Nacht mit etwa 400 Mikrolitern Primärantikörper in Blocklösung bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Waage am nächsten Tag dreimal für 30 Minuten in PBST bei Raumtemperatur. Mit dem Sekundärantikörper 2 Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
Tragen Sie nach dem Färben mit DAPI einen Tropfen Vectashield auf einen Objektträger auf und montieren Sie die Schuppen so, dass die konkave Seite der Schuppen nach unten gegen den Objektträger zeigt. Legen Sie einen Glasdeckglas über die Proben. Verwenden Sie Klarlack, um die Ränder zu versiegeln und die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop zu betrachten.