Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Bei erwachsenen Patienten, die mit HIV infiziert sind, stört eine Neuroinflammation die normale synaptische Signalübertragung, was zu neurokognitiven Defiziten führt, darunter Schwierigkeiten bei Abstraktion, verbaler Flüssigkeit, Aufmerksamkeit, Lernen, Erfassung neuer Informationen und Gedächtnis. HIV-1 Tat induziert die Sekretion entzündlicher Moleküle, die die synaptische Dysfunktion nachahmen können, wie sie hier bei HIV-Patienten beobachtet wird. Erwachsene Mäuse, die GFP in mononukleären Zellen, einschließlich Mikroglia, exprimieren, werden verwendet, um die durch HIV-1 Tat induzierte Neuroinflammation mittels Zweiphotonen-Mikroskopie an einem dünnen Schädel zu untersuchen.

Die Reaktionen von Mikroglia nach Injektion von Tat können in vivo abgebildet werden. Die resultierenden Bilder zeigen eine Verkürzung und Verdickung mikroglialer Fortsätze sowie die Bildung phagozytischer, becherartiger Strukturen und den Verkehr peripherer Monozyten in zerebralen Mikrogefäßen. Hallo, ich bin Dan Marker aus dem Labor von Harris Galbard und dem Zentrum für neuronale Entwicklung und Erkrankungen an der Universität von Rochester.

Hallo, ich bin EF Trombley aus dem Esca-Labor der Abteilung für Neurobiologie und Anatomie an der Universität von Rochester. Hallo, ich bin Shain Luu, ebenfalls aus dem Albas-Labor. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Zweiphotonen-Bildgebung unter Verwendung einer dünnen Schädelpräparation zeigen.

Wir verwenden dieses Verfahren, um eine chronische Neuroinflammation zu untersuchen. Beginnen wir also mit dem hier gezeigten Experiment. OT, die GFP in mononukleären Zelllinien, einschließlich Mikroglia, exprimieren, werden verwendet.

Unterschiedliche Mausstämme können verwendet werden, um die Anforderungen eines bestimmten Projekts zu erfüllen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer mit Fentanyl, Midazolam meine anesthetisierten Maus auf eine Operation. Stellen Sie zunächst sicher, dass das Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize wie einen Schwanzkneif reagiert.

Stellen Sie das Tier auf eine Heizplatte, um eine Hypothermie nach der Anästhesie zu verhindern. Anschließend bedecken Sie die Augen des Tieres mit einem schützenden Augensalbe, um die Augen feucht zu halten. Alle chirurgischen Instrumente sollten zuvor im Autoklaven oder mit einem Glasperlen-Sterilisator sterilisiert worden sein; desinfizieren Sie die Instrumente zusätzlich, indem Sie sie in 70 %igem Ethanol einweichen.

Entfernen Sie mit einer Schere das Haar von der Kopfhaut des Tieres und desinfizieren Sie die Region anschließend mit einer 10%igen Povidon-Jod-Lösung und 70%igem Ethanol. Beginnen Sie die Operation, indem Sie mit einer kleinen Schere einen medianen Schnitt in die Kopfhaut setzen, ausgehend von vier bis fünf Millimetern kaudal zur Schädelbasis und nach vorne bis vor die Augen führend. Dieser Einschnitt sollte ausreichend lang sein, sodass die Haut nicht beim Anbringen der Platte stört, die den Kopf der Maus während der Zweiphotonen-Bildgebung stabilisiert.

Anschließend 100 % Ethanol auf den sterilen Wattestäbchen auftragen, um die Membranen auf dem Schädel zu trocknen. Diese mit feinen Pinzetten entfernen. Falls die Membranen nicht vollständig entfernt werden, ist die Befestigung der Kopfplatte instabil.

Unter einem Stereomikroskop die zu verfeinernde Stelle identifizieren. Bereiche von Interesse, die direkt über Schädelnähten liegen, vermeiden, da der Schädel in diesen Bereichen weniger stabil ist und darunter liegende große Blutgefäße sowie die Hirnhäute die Bildgebung stören würden, die an das Sichtfenster der interessierenden Region übermittelt wird. Anschließend mit einem Wattestäbchen erneut versuchen, den Schädel mit einer 10%-igen Lösung von Eisen(III)-chlorid zu behandeln.

Tragen Sie eine dünne Schicht des Perma-Bonds, Neun-10-Kleber, um die Ränder des Sichtfensters unterhalb der Kopfplatte auf. Legen Sie dann die Platte mit leichtem Druck über den interessierenden Bereich am Schädel des Tieres, um den Kleber zu verbinden. Geben Sie eine kleine Menge Acryl mit einer Spritze um den Rand des Sichtfensters herum auf.

Tragen Sie abschließend eine kleine Menge Tite 4 54 auf die Ränder des Sichtfensters auf, um Leckagen zu verhindern. Schrauben Sie die Kopfplatte am Tierhalter fest und überprüfen Sie die Stabilität unter einem Stereomikroskop. Durch vorsichtiges Abtasten mit einer Pinzette darf keine Bewegung des Schädels relativ zur Kopfplatte erfolgen.

Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf das Sichtfenster, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind, bevor Sie den Schädel abdünnen. Trocknen Sie den Schädel mit einer Kombination aus sterilen Wattestäbchen und Druckluft. Dünne Sie den Schädel mit einem IRF 0 0 7 Bohrer in einem Mikro-zu-Zwei-Bohrgerät ab.

Bei 4.000 U/min. Beginnen Sie sehr vorsichtig, einen kreisförmigen Bereich mit zwei bis 2,5 Millimeter Durchmesser auszudünnen. Verwenden Sie ausschließlich leichte, fast parallel zum Schädel verlaufende Wischbewegungen.

Üben Sie keinen direkten nach unten gerichteten Druck aus. Unterbrechen Sie das Bohren alle 20 bis 30 Sekunden, um Knochenspäne mit Druckluft zu entfernen. Diese Pausen beim Bohren ermöglichen es, dass der Schädel abkühlt, wodurch eine wärmeschädliche Beeinträchtigung des darunterliegenden Hirngewebes vermieden wird.

Während das Bohren fortschreitet, achten Sie auf den Übergang zur feuchteren, stacheligen Knochenlage, die als Diplo bezeichnet wird. Sobald diese Schicht erreicht ist, arbeiten Sie besonders vorsichtig mit dem Bohrer. Überprüfen Sie gelegentlich die Dicke des Schädels, indem Sie Salzlösung über die dünne Stelle geben und diese unter dem Stereomikroskop betrachten.

Salzlösung trägt zusätzlich zur Wärmeabfuhr bei. Während der Schädel abgeschliffen wird, werden kleinere Blutgefäße sichtbar. Verwenden Sie eine zahnmedizinische Mikroklinge, um die endgültige Abschleifung unter Salzlösung durchzuführen.

Das Mikromesser liefert ein deutlich besseres taktiles Feedback bezüglich der Stabilität des Schädels. Dadurch können deutlich dünnere Präparationen als allein mit dem Bohrer erreicht werden. Die optimale Schädeldicke für die Bildgebung liegt zwischen 10 und 30 Mikrometern.

Der gesamte Ausdünnungsprozess dauert normalerweise zwischen 15 und 30 Minuten. Überprüfen Sie mehrmals die Dicke des Schädels unter Epifluoreszenz, während Sie ein dünnes Schädel Fenster anlegen. Die Schärfe und die Tiefe der sichtbaren Mikroglia und der Gefäße geben einen guten Hinweis darauf, wann das Fenster zur Bildgebung bereit ist.

Wenn das Fenster bereit ist, verwenden Sie eine Glaspipette mit einem Durchmesser von einem Millimeter, um einen kleinen Tropfen Cy-Acrylkleber auf den dünnen Schädelbereich zu geben, und senken Sie vorsichtig ein Deckglas darauf ab. Drücken Sie dann sanft gegen den Schädel, um überschüssigen Kleber herauszudrücken, und vermeiden Sie die Bildung von Blasen zwischen Schädel und Deckglas, da diese die Sicht behindern könnten. Sobald der Kleber getrocknet ist, entfernen Sie mit einem Mikromesser vorsichtig jeglichen Kleberrest auf der Oberseite des Deckglases, um die Vorbereitung für die Zweiphotonen-Bildgebung abzuschließen.

Bedecken Sie das dünne Schädel-Fenster mit Kochsalzlösung und lokalisieren Sie den Bereich von Interesse unter Epifluoreszenz. Um anschließende Aufnahmen des Bereichs zu ermöglichen, machen Sie ein Bild mit einer Fotokamera für die Bildgebung. Hier wird ein selbstgebauter Zweifotomikroskop mit einem auf 920 Nanometer abgestimmten Ti-Saphir-Laser verwendet.

Die Fluoreszenz wird mithilfe einer Fotomultiplierröhre oder PMT im Vollfeld-Erkennungsmodus und mit einem 5 81 80 Emissionsfilter detektiert. Während der gesamten Aufnahmesitzung wird ein 20x-Wasserimmersionsobjektiv verwendet. Stellen Sie die maximale Ausgangsleistung der Laserleistung am Objektiv zwischen 50 und 65 Milliwatt ein.

Wählen Sie anschließend einen interessierenden Bereich entweder in der kortikalen Schicht eins oder zwei bis zu 150 Mikrometer unterhalb der Oberfläche der Schale aus. Um die erneute Abbildung zu erleichtern, machen Sie Aufnahmen desselben Bildfeldes mit ein- bis drei- facher digitaler Vergrößerung. Blutgefäße können als Orientierungspunkte dienen, um bei nachfolgenden Bildgebungssitzungen leicht das gleiche Bildfeld wiederzufinden.

Bei einer Vergrößerung von drei x mehrere Zacken mit jeweils 80 bis 90 Z-Schritten und einem Schritt von 0,69 Mikrometer alle fünf Minuten bis zu 30 Minuten lang aufnehmen. Dies ermöglicht eine gute Erfassung der Mikroglia-Morphologie und -Aktivität über die Zeit zwischen den Aufnahmen der Zacken; überprüfen Sie dabei den Salzspiegel und die Tiefe der Anästhesie. Falls nötig, kann während des Verfahrens eine Auffrischungsdosis von einem Drittel der ursprünglichen Dosis des Anästhetikum-Cocktails verabreicht werden, um eine Ablagerung auf der Spritze und der Nadel während der Injektionstage vor der Injektion zu verhindern.

Die Innenauskleidung einer Nadel mit 35er Gauge und einer Mikrovolumenspritze mit 10 Mikroliter wurde silonisiert, indem man Lösungsmittel zurückzog, bis sowohl die Nadel als auch die Spritze vollständig gefüllt waren. Die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur einwirken lassen, anschließend die Lösung aus der Spritze ablassen, den Kolben entfernen und die Spritze samt Nadel vollständig trocknen lassen. Zum Schluss die Spritze und die Nadel gründlich mit entionisiertem Wasser spülen.

Nach der Silanisierung kann eine Spritze und Nadel über einen Zeitraum von mehr als sechs Monaten verwendet werden, bevor eine erneute Silanisierung erforderlich ist. Am Tag der Injektion geben Sie einen kleinen Tropfen der TAT-Lösung auf einen silanisierten Objektträger. Mit einer silanisierten Pipettenspitze entnehmen Sie die gewünschte Menge der Lösung aus diesem Tropfen und füllen sie in die Mikrovolumenspritze.

Unter Verwendung eines Bohrers wird eine kleine Kraniotomie mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern entweder drei Millimeter rostral oder lateral zum dünnen kortikalen Schädelknochenfenster durchgeführt, an dem Zwei-Photonen-Aufnahmen angefertigt wurden. Dazu wird der Schädel vorsichtig angedünnt und anschließend mit einer scharfen Pinzette die dünne Knochenlage entfernt.

Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die kalibrierte Nadel der Größe 35 und die Spritze mit der Kraniotomie auszurichten. Führen Sie die Nadel dann vorsichtig auf eine Tiefe von 700 bis 900 Mikrometern unterhalb der Oberfläche der Membran ein. Injizieren Sie drei Mikroliter mit einer Geschwindigkeit von 80 Nanolitern pro Minute mithilfe einer mikroprozessorgesteuerten Spritzenpumpe.

Diese Abbildung zeigt mit GFP markierte Mikroglia, die mittels Zweiphotonen-Bildgebung nach der Implantation des dünnen Schädelknochen-Fensters etwa 50 Mikrometer unterhalb der Ablöseoberfläche sichtbar gemacht wurden. Die einzelnen Zweiphotonen-Schnitte, die am Tag null, 15 bis 30 Minuten nach der Implantation des dünnen Schädelknochen-Fensters, sowie sieben und 17 Tage später angefertigt wurden, zeigen, dass die Fenster klar bleiben, während die Mikroglia auch ohne entzündliche Reize aktiviert bleiben. Dies unterstreicht die Eignung dieser Methode zur Untersuchung sowohl normaler als auch entzündlicher Interaktionen zwischen Immun-Effektorzellen und anderen neuronalen Zelltypen.

In vivo zeigen die Z-Projektionen sechs und 24 Stunden nach der Injektion des HIV-Neurotoxins TAT deutliche morphologische Veränderungen aktivierter Mikroglia. Dies verdeutlicht erneut, dass wir in der Lage sind, morphologische Veränderungen der Mikroglia in Echtzeit in akuten und chronischen Modellen der Neuroinflammation zu untersuchen. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man ein dünnes Schädel-Fenster präpariert und es zur Untersuchung der Neuroinflammation bei dieser Prozedur verwendet.

Es ist wichtig, sich beim Bearbeiten des Schädels Zeit zu nehmen, um Schäden, die durch die Präparation selbst verursacht werden könnten, zu vermeiden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.