Name: Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Lernen Sie eine dünne Schädelfenster-Technik zur In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie von Mikrogliazellen in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung neuroinflammatorischer Prozesse in Echtzeit.

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Wir bedanken uns bei Emily A. Kelly für den Kopf-Bauweise. Wir sind dankbar für die Unterstützung des NIH Auszeichnungen an HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 und die großzügige Unterstützung der Geoffrey Waasdorp Neuropädiatrie Fund, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. AKM wird durch die NIH (EY019277), Whitehall-Stiftung, der Alfred P. Sloan Foundation und ein Career Award in der Biomedizin von der Burroughs Wellcome Fund finanziert. MET wird von einem Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Postdoc-Preis finanziert. DFM ist ein Auszubildender im Medical Scientist Training Program, durch NIH T32 und T32 GM07356 AI049815 finanziert.

1. Vorbereitung der Tiere für Imaging <ol><li> In unseren Experimenten verwenden wir Erwachsenen CX 3 CR 1 GFP / + Mäusen, die ausdrückliche GFP in mononukleären Zelllinien, darunter Mikroglia. 4 verschiedene Stämme von Mäusen verwendet, um die Bedürfnisse eines spezifischen Projekts zugeschnitten werden können. </li><li> Anesthetize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von drei Medikamenten-Cocktail, bestehend aus 0,05 mg / kg Fentanyl, 5,0 mg / kg Midazolam und 0,5 mg / kg Medetomidin. 5 Chirurgische Vorbereitung TSCW beginnt, nachdem das Tier reagiert nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie wie ein Schwanz kneifen. Während der Operation und Bildgebung, halten wir das Tier auf einem Heizkissen auf post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. Falls notwendig, eine Auffrischimpfung mit einem Drittel der ursprünglichen Dosis des Anästhetikums Cocktail gegeben, um die ursprüngliche Betäubung Flugzeug wiederherzustellen. </li><li> Deckel die Augen des Tieres mit einem schützenden Augensalbe zu halten die Augen feucht während der Narkose unterdrückt, die das Tier Blinkreflex. Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut des Tieres mit einer Rasierklinge, Schere, Schere, oder chemische Methoden. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einer 10% PVP-Jod-Lösung und 70% Ethanol. Alle chirurgischen Instrumente müssen autoklaviert, sterilisiert werden mit einem Glas-Bead-Sterilisator oder desinfiziert mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie eine Mittellinienschnitt der Kopfhaut mit einer kleinen Schere, beginnend 4-5 mm kaudal der Schädelbasis und Weiterentwicklung uns auf die vor den Augen. Es ist wichtig, dass dieser Einschnitt lange genug, dass die Haut nicht mit dem Kleben der Kopfplatte, die verwendet werden, um die Maus den Kopf zu stabilisieren, ist bei der Zwei-Photonen-Imaging (Abbildung 1) stören. Identifizieren Sie die Fläche unter einem Binokular verdünnt werden. Vermeiden Sie Bereiche von Interesse direkt über Schädelnähte befinden, wie der Schädel ist weniger stabil in diesen Bereichen und die zugrunde liegenden großen Gefäße und Meningen wird mit bildgebenden stören. </li><li> Wenden Sie 100% Ethanol um 10% Eisenchloridlösung mit einem sterilen Wattestäbchen, um die Membranen auf der Oberseite des Schädels trocken und kratzen sie weg mit feinen Pinzette oder einer Rasierklinge an. Die Nichtbeachtung der Membranen führt zu instabilen Kopfplatte Anlage zu entfernen. </li><li> Legen Sie eine dünne Schicht des Permabond 910 Leim an den Kanten des Sichtfensters unterhalb der Kopfplatte. Legen Sie die Kopfplatte mit Kleber über den Bereich der Zinsen auf das Tier den Schädel mit leichtem Druck (Abbildung 1) beschichtet. Es ist wichtig, dass die Kopfplatte ist nur bis auf die Knochen des Schädels aufgeklebt. Jede Haut oder Membranen, die zwischen der Kopfplatte und der Schädel gefangen verringert die Stabilität der Bindung. Eine kleine Menge von Acrylat um das Sichtfenster mit einer Spritze sofort Bindung der Kleber. Schließlich eine kleine Menge von Loctite 454 auf die Ränder des Sichtfensters, um Leckagen zu verhindern. </li><li> Schrauben Sie die Kopfplatte der Tierhalter (Abbildung 1) und überprüfen Sie die Stabilität der Kopfplatte unter einer Dissektion Umfang durch leichtes Sondieren mit einer Pinzette. Es sollte keine Bewegung des Schädels in Bezug auf die Kopfplatte werden. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf das Sichtfenster, um sicherzustellen, dass keine Leckagen. </li></ol> 2. Vorbereiten des Verdünnt Schädel Kortikalisfenster <ol><li> In Vorbereitung auf die Ausdünnung des Schädels, trockenen Schädel mit einer Kombination aus sterile Wattestäbchen und Druckluft. Wir haben uns zunächst dünn den Schädel mit einer sterilen IRF 007 Bohrer in einem MicroTorque II Bohrmaschine bei 4000 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Sehr sanft, beginnen Ausdünnen einer 2-2,5 mm Durchmesser Kreisfläche des Schädels. Verwenden Sie nur leichten geschwungenen Bewegungen nahezu parallel zu den Schädel, die Nutzung keinen direkten Druck. Stoppen Bohren alle 20-30 Sekunden, um Knochen Staub mit der Druckluft. Diese Brüche in Bohrungen ermöglichen den Schädel zu kühlen, so gibt es keine Hitze-induzierte Schäden an den darunter liegenden Hirngewebes. <ol class="lalpha"><li> Da die Bohrungen fortschreitet, bemerken den Übergang zu den feuchteren Spongiosa Schicht (dh die "Diploe"). Sobald diese Schicht erreicht ist, die Ausübung besonderer Vorsicht mit dem Bohrer. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie gelegentlich die Schlankheit des Schädels, indem über die ausgedünnt Bereich Kochsalzlösung und Betrachten unter dem Binokular. Saline wird weiter ermöglichen Wärmeableitung. Da der Schädel ist ausgedünnt, wird kleiner Gefäße sichtbar. </li><li> Verwenden Sie eine sterile zahnärztliche MicroBlade zur endgültigen Verdünnung unter Kochsalzlösung zu erreichen, wie die MicroBlade bietet viel mehr taktile Rückmeldung über die Stabilität des Schädels. Dies ermöglicht eine sehr viel dünner als die Vorbereitungen mit dem Bohrer allein. Aus unserer Erfahrung ist die optimale Schädel Dicke 10-30 um. <ol class="lalpha"><li> Es ist wichtig, um die Schlankheit des Schädels unter Epifluoreszenz mehrfach überprüfen während der ersten Versuche, einen dünnen Schädel-Fenster. Die Schärfe und Tiefe sichtbar Mikroglia und Gefäßsystem geben einen guten Hinweis darauf, wenn das Fenster bereit für die Bildgebung ist. </li></ol></li><li> Sobald das Fenster fertig ist, kleben Sie ein maßgeschneidertes rechteckiges Stück # 0 Deckglas wi th eine Dimension von weniger als 2 mm auf jeder Seite über dem Fenster. Mit einem Durchmesser von 1,0 mm Glaspipette, platzieren Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf dem Schädel gelichtet Bereich und vorsichtig weiter unten das kleine Stück Deckglas, dann drücken Sie vorsichtig gegen den Schädel zu verdrängen überschüssige Menge der Leim. Es ist wichtig, um eine Blasenbildung zwischen dem Glas und den Kleber zu vermeiden, da eingeschlossene Luft den Bereich führen wird unter an sich optisch undurchsichtig. Der Sekundenkleber wird verwendet, weil es transparent bleibt, wenn sie trocken und verhindert auch, dass Knochen und Membran Nachwachsen halten den Schädel unter dem Fenster dünn und durchscheinend. Wenn es einen Kleber auf der Oberseite des Deckglases, verwenden Sie die MicroBlade sorgfältig entfernen, sobald das Deckglas in Kraft ist und der Leim trocken ist. </li><li> Ein Schmerzmittel (z. B. Buprenorphin 2 mg / kg subkutan) wird unmittelbar nach der Operation verabreicht und bei Anzeichen von Schmerzen erneut verabreicht, einschließlich Zurückhaltung zu bewegen, essen oder trinken, Gewichtsverlust, Speichelfluss, Piloerektion, Atemgeräusche, usw. </li></ol> 3. Zwei-Photonen-Imaging <ol><li> In Vorbereitung auf die Zwei-Photonen-Imaging, decken die TSCW mit Kochsalzlösung und suchen Sie den Bereich von Interesse unter Epifluoreszenz (Abbildung 2). Für eine nachfolgende Bildgebung der Region, nehmen Sie ein Bild mit einer Fotokamera. </li><li> Für Zwei-Photonen-Imaging, verwenden wir ein maßgeschneidertes Zwei-Photonen-Mikroskop 6 mit einem Ti: Saphir-Lasers abgestimmt, um 920 nm. Die Fluoreszenz wird mit Hilfe eines Photomultipliers in Ganzfeld-Erkennung-Modus und eine 580/180 Emissionsfilter erkannt. A 20X Wasser-Immersions-Objektiv (0,95 NA) ist im gesamten Imaging-Sitzung verwendet werden. Die maximale Leistung der Laserleistung auf das Ziel liegt zwischen 50 und 65 mW eingestellt. </li><li> Wählen Sie einen Bereich von Interesse in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 pm unterhalb der Pia-Oberfläche). Zur Erleichterung der Re-Imaging, machen Sie Fotos von der gleichen Sichtfeld bei 1X, 2X und 3X Digitalzoom. Blutgefäße können als Landmarken dienen, leicht zu finden die gleichen Sichtfeld während der nachfolgenden Abbildung Sitzungen. Unter einem Zoom von 3X, mehrere z-Stapeln mit 80-90 Z-Schritte in jedem Stapel und eine 0,69 &amp;mgr; Schritt können alle 5 Minuten für bis zu 30 Minuten, was eine gute Probenahme von Mikroglia-Morphologie und Verhalten im Laufe der Zeit können erworben werden ( Abbildung 3). Zwischen den Erwerb von Z-Stapel, sollte man überprüfen, das Niveau der Kochsalzlösung über die TSCW sowie des Tieres Narkosetiefe. </li></ol> 4. Die Injektion des HIV-1 Neurotoxin, Tat <ol><li> Zunächst silanisieren die innere Auskleidung einer 35-Gauge-Nadel und 10 ul Mikrovolumen Spritze Tat Ablagerung zu verhindern. Ziehen Sie die Silanisierung Lösung (Sigmacote), bis er sowohl die Nadel und Spritze füllt. Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Leeren Sie die Lösung aus der Spritze, entfernen Sie den Kolben, und lassen Sie die Spritze und Nadel vollständig trocknen. Schließlich, waschen Sie die Spritze und Nadel gründlich mit entionisiertem Wasser. </li><li> Führen Sie eine kleine Kraniotomie 0,5 mm im Durchmesser entweder 3 mm rostral oder lateral des TSCW, wo Zwei-Photonen-Bilder erhalten worden sind, mit einem kleineren Bohrer und sorgfältig Ausdünnung des Schädels, bis eine Pinzette mit scharfen Spitzen kann die verdünnte Schicht entfernen Knochen einfach weg. Wir verwenden eine 10 l Mikrovolumen Spritze mit 35-Gauge-Nadel durch eine Ultramicropump III Spritzenpumpe auf einem 3-Achs-Mikromanipulator und nach Futter bis die Nadelspitze auf die Kraniotomie montiert gesteuert ausgestattet, ist es sorgfältig fortgeschrittenen zu einer Tiefe von 700 bis 900 mu m unterhalb die Pia-Oberfläche, wo 3 ul Tat 1-72 (oder andere pro-inflammatorische Wirkstoffe) oder Kochsalzlösung (oder Kontrolle Fahrzeug) bei 80 nL / min geliefert wird. </li></ol> 5. Tierhaltung <ol><li> Wenn das Tier abzubildenden mehrfach an einem einzigen Tag werden, decken die offene Fläche des Schädels mit einer Mischung aus Augensalbe und Vaseline, um Beschwerden oder Schäden an der Schädelbasis zwischen Imaging-Sitzungen zu verhindern. Trennen Sie die Unterstützung Brücke aus dem kleinen Kopf-Platte (siehe Abbildung 1B) und platzieren Sie das Tier in einem Käfig erwärmt mit leicht zugänglichen Nahrung und Wasser. Alle Tiere werden einzeln nach der Operation jederzeit untergebracht werden. Sobald die Bildgebung Sitzungen für ein Tier für einen bestimmten Tag fertig sind, entfernen Sie vorsichtig den gesamten Kopf-Platte und Naht der Haut wieder über den Schädel mit Nr. 6 oder kleiner Naht. Wieder Haus die Tiere einzeln mit leicht zugänglichen Nahrung und Wasser zwischen experimentellen Tagen. Überprüfen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Stress, Schmerzen oder Infektion. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Stabilisierung des Tieres für Chirurgie und Zwei-Photonen-Imaging (A) und Kopf-Bauweise (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. GFP-markierten Mikroglia visualisiert mit Epifluoreszenz. jove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. GFP-markierten Mikroglia visualisiert mit Zwei-Photonen-Imaging nach der Implantation der TSCW, ca. 50 um unterhalb der Pia-Oberfläche. Die einzelnen Zwei-Photonen-Abschnitten entnommen 15-30 Minuten nach der Implantation der TSCW (Tag 0), sowie 7 und 17 Tage später, zeigen, dass die Fenster klar bleibt, während Mikrogliazellen in Abwesenheit von entzündlichen Beleidigungen bleiben inaktiviert. Die z-Projektionen genommen 6 und 24 Stunden nach der Injektion der HIV Neurotoxin tat weisen beeindruckende morphologische Veränderungen der aktivierten Mikroglia. Maßstab: 10 pm.

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</ol>

Es besteht wachsender Konsens, dass das eigentliche Substrat für die HIV-1 assoziiert neurokognitiven Defizite (HAND) die Vernichtung der synaptischen Architektur, vermutlich von pro-inflammatorischen Mediatoren aus HIV-1 infizierten mononukleären Phagozyten freigesetzt verursacht wird. Mikroglia-Aktivierung, mehrkernige Riesenzellen und Gliose aufgrund astrozytären Hypertrophie gelten als unspezifische Markenzeichen des HIV-1 Infektion und Entzündung im ZNS 7. Im Gegensatz dazu hat die Schwere der premortem neurologische Erkrankung mit Verlust der synaptischen Komplexität sowie Makrophagen Belastung im ZNS 8,9,10,11 korreliert. Allerdings dynamischen Wechselwirkungen zwischen Mikroglia, periphere infiltrierenden Makrophagen und Neuronen bei Patienten mit HAND kann einfach nicht modelliert mit herkömmlichen statischen Verarbeitung von konventionellen immunzytochemische Studien gewonnen werden. Jüngste Studien aus unseren Labors haben ergeben, dass zumindest einige dieser Wechselwirkungen zwischen peripheren und zentralen mononukleären Zellen und Neuronen in Teil kann durch stereotaktische Injektion des HIV-1-Protein Tat 1-72 werden in Hirnparenchym (Lu, Marker, Tremblay modelliert, Qi und Gelbard, unveröffentlichte Daten). Wir beschlossen daher, in vivo Zwei-Photonen-Imaging gelten für das Zusammenspiel von Monozyten abgeleiteten Makrophagen, im Gehirn ansässigen Mikroglia und Neuronen zu untersuchen, in einem kleinen gefügig Tiermodell für NeuroAIDS. Während offenen Schädel oder ausgedünnte Schädel Vorbereitungen leisten einer einzigen Untersuchung der kortikalen Architektur für eine kurze Zeit (Stunden), Ermittler in den zeitlichen Verlauf der subakuten Ereignisse können nicht diese Präparate ohne artifactually Aktivierung Mikroglia / Makrophagen durch chirurgische Manipulation der interessierten die Schädeldecken Fenster. Hier zeigen wir eine einfache Möglichkeit zur Umgehung dieser Beschränkung durch Verkleben ein winziges Stück Deckglas über dem Schädel gelichtet Bereich verhindert das Schädeldach aus nachwachsenden in der TSCW sowie die Aufrechterhaltung Transluzenz für ≥ 3 Wochen. Wir zeigen ferner, dass uns diese Technik, um das Verhalten der peripheren Monozyten Eingabe zerebralen Mikrovaskulatur sowie Gehirn-Wohnsitz Mikroglia in Reaktion auf die stereotaktische Injektion von HIV-Tat 1-72 im Kortex von Mäusen, die heterozygot für CX 3 CR 1 / GFP überwachen kann ( zu identifizieren Zellen der mononukleären Linie). Diese Technik kann leicht angepasst, um auf Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen verwenden, zum Beispiel verwenden wir routinemäßig heterozygot CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 Mäusen zu Wechselwirkungen zwischen Monozyten-Makrophagen, im Gehirn ansässigen Mikroglia und Neuronen in Untersuchung in vivo Modelle Neuroinflammation relevanten HAND. Unsere TSCW Vorbereitung ermöglicht Ermittler Zell-Zell-Interaktionen zwischen Peripherie und ZNS, die über Zeiträume von Wochen, in denen das Tier immer wieder vor und nach der experimentellen Behandlung abgebildet werden können auftreten zu studieren. So kann jedes Tier als seine eigene Kontrolle dienen. Eine Einschränkung für diese TSCW Modells ist, dass die Zielzellen untersucht werden entweder gentechnisch verändert, um verbesserte fluoreszierende Proteine ​​(eXFP) ausdrückliche oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff ohne mechanische Verletzung der Schädelkalotte gekennzeichnet werden müssen, und dass eXFP Ausdruck muss robust genug sein, um ermöglichen zellulären Architektur zu werden, nachdem wiederholt Imaging-Sitzungen über einen Zeitraum von Wochen visualisiert.

<table><tbody><tr><td>Fentanylzitrat</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midazolamhydrochlorid</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid (Domitor)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Beyond Bodi Heat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin- und Dexamethason-Augensalbe (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Iodin 10% Lösung</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eisenchlorid 10% Lösung</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td></td></tr><tr><td>Methylcyanoacrylat 910</td><td>Permabond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylat 454</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEETS-Zahnprothesenmaterial vernetzendes Methylmethacrylat</td><td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtorque II Handstück-Kit</td><td>Pearson Assessments</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>IRF 007 Bohrer</td><td>Feinwerktechnik Werkzeuge</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Norland biegsames Mikromesser, voller Radius</td><td>Salvin Dental</td><td>BLAD-NORLAND-69</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylat</td><td>The Original Superglue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#0 Glasdeckgläschen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63750-01</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l Mikrovolumenspritze</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ILS010LT</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>35-Gauge-NanoFil-Nadel</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NL35BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Kugelmühle, Karbidfräser #1/4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501860</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplierröhre</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saphir-Laser Mai-Tai</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein thin-schädel fenster-technik für chronische zwei-photonen- in-vivo- imaging von murine mikrogliazellen in modelle der neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionell in den Neurowissenschaften, in vivo Zwei-Photonen-Imaging des murinen zentrale Nervensystem hat entweder den Einsatz von Open-Schädel 1,2 oder ausgedünnte Schädel 3 Vorbereitungen beteiligt. Während die Open-Schädel-Technik ist sehr vielseitig, es ist nicht für das Studium Mikroglia optimal, weil sie invasiv ist und Mikroglia-Aktivierung verursachen. Auch wenn die ausgedünnten Schädel Ansatz ist minimal-invasiv, das wiederholte erneut Ausdünnung des Schädels für chronische Bildgebung erforderlich erhöht das Risiko von Gewebeschäden und Mikroglia-Aktivierung und ermöglicht eine begrenzte Anzahl von Imaging-Sitzungen. Hier präsentieren wir eine chronische Dünn-Schädel-Fenster-Methode für die Überwachung murine Mikroglia in vivo über einen längeren Zeitraum hinweg mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie man eine stabile, leicht zugängliche, ausgedünnte Schädel kortikale Fenster (TSCW) mit einem apposed Deckglas, dass transluzente im Laufe der drei Wochen intermittierende Beobachtung bleibt vorzubereiten. Diese TSCW Vorbereitung ist weit mehr immunologisch inert gegenüber Mikroglia-Aktivierung als offene Kraniotomie oder wiederholte Schädel Durchforstung und ermöglicht eine beliebige Anzahl von Imaging-Sitzungen während eines Zeitraums von Wochen. Wir bereiten TSCW in CX 3 CR 1 GFP / + Mäusen 4 bis Mikroglia mit Enhanced Green Fluorescent Protein auf ≤ 150 mu m unterhalb der Pia Oberfläche sichtbar zu machen. Wir zeigen auch, dass dieses Präparat in Verbindung mit stereotaktischen Hirn-Injektionen des HIV-1 neurotoxischen Protein Tat, neben dem TSCW, die zu induzieren vermag haltbare microgliosis ist, kann verwendet werden. Daher ist diese Methode sehr nützlich für die Prüfung Änderungen in Mikroglia-Morphologie und Motilität im Laufe der Zeit im lebenden Gehirn in Modelle der HIV-assoziierten neurokognitiven Disorder (HAND) und andere neurodegenerative Erkrankungen mit einem neuroinflammatorische Komponente.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden Monozyten<em&gt; In vivo</em&gt; Über Stunden, Tage oder Wochen mit der transkraniellen Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie zu einem ausgedünnten-Schädel-Fenster, dass eine intermittierende Beobachtung der ruhenden Mikrogliazellen, die durch benachbarte stereotaktische Injektion der HIV-1 regulatorischen Proteins Tat aktiviert werden können, ermöglicht vorzubereiten.

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

In der Neurowissenschaft beinhaltete die In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung des zentralen Nervensystems von Mäusen traditionell entweder die Anwendung einer offenen Schädelöffnung1,2 oder ...

Bei erwachsenen Patienten, die mit HIV infiziert sind, stört eine Neuroinflammation die normale synaptische Signalübertragung, was zu neurokognitiven Defiziten führt, darunter Schwierigkeiten bei Abstraktion, verbaler Flüssigkeit, Aufmerksamkeit, Lernen, Erfassung neuer Informationen und Gedächtnis. HIV-1 Tat induziert die Sekretion entzündlicher Moleküle, die die synaptische Dysfunktion nachahmen können, wie sie hier bei HIV-Patienten beobachtet wird. Erwachsene Mäuse, die GFP in mononukleären Zellen, einschließlich Mikroglia, exprimieren, werden verwendet, um die durch HIV-1 Tat induzierte Neuroinflammation mittels Zweiphotonen-Mikroskopie an einem dünnen Schädel zu untersuchen.Die Reaktionen von Mikroglia nach Injektion von Tat können in vivo abgebildet werden. Die resultierenden Bilder zeigen eine Verkürzung und Verdickung mikroglialer Fortsätze sowie die Bildung phagozytischer, becherartiger Strukturen und den Verkehr peripherer Monozyten in zerebralen Mikrogefäßen. Hallo, ich bin Dan Marker aus dem Labor von Harris Galbard und dem Zentrum für neuronale Entwicklung und Erkrankungen an der Universität von Rochester.Hallo, ich bin EF Trombley aus dem Esca-Labor der Abteilung für Neurobiologie und Anatomie an der Universität von Rochester. Hallo, ich bin Shain Luu, ebenfalls aus dem Albas-Labor. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Zweiphotonen-Bildgebung unter Verwendung einer dünnen Schädelpräparation zeigen.Wir verwenden dieses Verfahren, um eine chronische Neuroinflammation zu untersuchen. Beginnen wir also mit dem hier gezeigten Experiment. OT, die GFP in mononukleären Zelllinien, einschließlich Mikroglia, exprimieren, werden verwendet.Unterschiedliche Mausstämme können verwendet werden, um die Anforderungen eines bestimmten Projekts zu erfüllen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer mit Fentanyl, Midazolam meine anesthetisierten Maus auf eine Operation. Stellen Sie zunächst sicher, dass das Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize wie einen Schwanzkneif reagiert.Stellen Sie das Tier auf eine Heizplatte, um eine Hypothermie nach der Anästhesie zu verhindern. Anschließend bedecken Sie die Augen des Tieres mit einem schützenden Augensalbe, um die Augen feucht zu halten. Alle chirurgischen Instrumente sollten zuvor im Autoklaven oder mit einem Glasperlen-Sterilisator sterilisiert worden sein; desinfizieren Sie die Instrumente zusätzlich, indem Sie sie in 70 %igem Ethanol einweichen.Entfernen Sie mit einer Schere das Haar von der Kopfhaut des Tieres und desinfizieren Sie die Region anschließend mit einer 10%igen Povidon-Jod-Lösung und 70%igem Ethanol. Beginnen Sie die Operation, indem Sie mit einer kleinen Schere einen medianen Schnitt in die Kopfhaut setzen, ausgehend von vier bis fünf Millimetern kaudal zur Schädelbasis und nach vorne bis vor die Augen führend. Dieser Einschnitt sollte ausreichend lang sein, sodass die Haut nicht beim Anbringen der Platte stört, die den Kopf der Maus während der Zweiphotonen-Bildgebung stabilisiert.Anschließend 100 % Ethanol auf den sterilen Wattestäbchen auftragen, um die Membranen auf dem Schädel zu trocknen. Diese mit feinen Pinzetten entfernen. Falls die Membranen nicht vollständig entfernt werden, ist die Befestigung der Kopfplatte instabil.Unter einem Stereomikroskop die zu verfeinernde Stelle identifizieren. Bereiche von Interesse, die direkt über Schädelnähten liegen, vermeiden, da der Schädel in diesen Bereichen weniger stabil ist und darunter liegende große Blutgefäße sowie die Hirnhäute die Bildgebung stören würden, die an das Sichtfenster der interessierenden Region übermittelt wird. Anschließend mit einem Wattestäbchen erneut versuchen, den Schädel mit einer 10%-igen Lösung von Eisen(III)-chlorid zu behandeln.Tragen Sie eine dünne Schicht des Perma-Bonds, Neun-10-Kleber, um die Ränder des Sichtfensters unterhalb der Kopfplatte auf. Legen Sie dann die Platte mit leichtem Druck über den interessierenden Bereich am Schädel des Tieres, um den Kleber zu verbinden. Geben Sie eine kleine Menge Acryl mit einer Spritze um den Rand des Sichtfensters herum auf.Tragen Sie abschließend eine kleine Menge Tite 4 54 auf die Ränder des Sichtfensters auf, um Leckagen zu verhindern. Schrauben Sie die Kopfplatte am Tierhalter fest und überprüfen Sie die Stabilität unter einem Stereomikroskop. Durch vorsichtiges Abtasten mit einer Pinzette darf keine Bewegung des Schädels relativ zur Kopfplatte erfolgen.Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf das Sichtfenster, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind, bevor Sie den Schädel abdünnen. Trocknen Sie den Schädel mit einer Kombination aus sterilen Wattestäbchen und Druckluft. Dünne Sie den Schädel mit einem IRF 0 0 7 Bohrer in einem Mikro-zu-Zwei-Bohrgerät ab.Bei 4.000 U/min. Beginnen Sie sehr vorsichtig, einen kreisförmigen Bereich mit zwei bis 2,5 Millimeter Durchmesser auszudünnen. Verwenden Sie ausschließlich leichte, fast parallel zum Schädel verlaufende Wischbewegungen.Üben Sie keinen direkten nach unten gerichteten Druck aus. Unterbrechen Sie das Bohren alle 20 bis 30 Sekunden, um Knochenspäne mit Druckluft zu entfernen. Diese Pausen beim Bohren ermöglichen es, dass der Schädel abkühlt, wodurch eine wärmeschädliche Beeinträchtigung des darunterliegenden Hirngewebes vermieden wird.Während das Bohren fortschreitet, achten Sie auf den Übergang zur feuchteren, stacheligen Knochenlage, die als Diplo bezeichnet wird. Sobald diese Schicht erreicht ist, arbeiten Sie besonders vorsichtig mit dem Bohrer. Überprüfen Sie gelegentlich die Dicke des Schädels, indem Sie Salzlösung über die dünne Stelle geben und diese unter dem Stereomikroskop betrachten.Salzlösung trägt zusätzlich zur Wärmeabfuhr bei. Während der Schädel abgeschliffen wird, werden kleinere Blutgefäße sichtbar. Verwenden Sie eine zahnmedizinische Mikroklinge, um die endgültige Abschleifung unter Salzlösung durchzuführen.Das Mikromesser liefert ein deutlich besseres taktiles Feedback bezüglich der Stabilität des Schädels. Dadurch können deutlich dünnere Präparationen als allein mit dem Bohrer erreicht werden. Die optimale Schädeldicke für die Bildgebung liegt zwischen 10 und 30 Mikrometern.Der gesamte Ausdünnungsprozess dauert normalerweise zwischen 15 und 30 Minuten. Überprüfen Sie mehrmals die Dicke des Schädels unter Epifluoreszenz, während Sie ein dünnes Schädel Fenster anlegen. Die Schärfe und die Tiefe der sichtbaren Mikroglia und der Gefäße geben einen guten Hinweis darauf, wann das Fenster zur Bildgebung bereit ist.Wenn das Fenster bereit ist, verwenden Sie eine Glaspipette mit einem Durchmesser von einem Millimeter, um einen kleinen Tropfen Cy-Acrylkleber auf den dünnen Schädelbereich zu geben, und senken Sie vorsichtig ein Deckglas darauf ab. Drücken Sie dann sanft gegen den Schädel, um überschüssigen Kleber herauszudrücken, und vermeiden Sie die Bildung von Blasen zwischen Schädel und Deckglas, da diese die Sicht behindern könnten. Sobald der Kleber getrocknet ist, entfernen Sie mit einem Mikromesser vorsichtig jeglichen Kleberrest auf der Oberseite des Deckglases, um die Vorbereitung für die Zweiphotonen-Bildgebung abzuschließen.Bedecken Sie das dünne Schädel-Fenster mit Kochsalzlösung und lokalisieren Sie den Bereich von Interesse unter Epifluoreszenz. Um anschließende Aufnahmen des Bereichs zu ermöglichen, machen Sie ein Bild mit einer Fotokamera für die Bildgebung. Hier wird ein selbstgebauter Zweifotomikroskop mit einem auf 920 Nanometer abgestimmten Ti-Saphir-Laser verwendet.Die Fluoreszenz wird mithilfe einer Fotomultiplierröhre oder PMT im Vollfeld-Erkennungsmodus und mit einem 5 81 80 Emissionsfilter detektiert. Während der gesamten Aufnahmesitzung wird ein 20x-Wasserimmersionsobjektiv verwendet. Stellen Sie die maximale Ausgangsleistung der Laserleistung am Objektiv zwischen 50 und 65 Milliwatt ein.Wählen Sie anschließend einen interessierenden Bereich entweder in der kortikalen Schicht eins oder zwei bis zu 150 Mikrometer unterhalb der Oberfläche der Schale aus. Um die erneute Abbildung zu erleichtern, machen Sie Aufnahmen desselben Bildfeldes mit ein- bis drei- facher digitaler Vergrößerung. Blutgefäße können als Orientierungspunkte dienen, um bei nachfolgenden Bildgebungssitzungen leicht das gleiche Bildfeld wiederzufinden.Bei einer Vergrößerung von drei x mehrere Zacken mit jeweils 80 bis 90 Z-Schritten und einem Schritt von 0,69 Mikrometer alle fünf Minuten bis zu 30 Minuten lang aufnehmen. Dies ermöglicht eine gute Erfassung der Mikroglia-Morphologie und -Aktivität über die Zeit zwischen den Aufnahmen der Zacken; überprüfen Sie dabei den Salzspiegel und die Tiefe der Anästhesie. Falls nötig, kann während des Verfahrens eine Auffrischungsdosis von einem Drittel der ursprünglichen Dosis des Anästhetikum-Cocktails verabreicht werden, um eine Ablagerung auf der Spritze und der Nadel während der Injektionstage vor der Injektion zu verhindern.Die Innenauskleidung einer Nadel mit 35er Gauge und einer Mikrovolumenspritze mit 10 Mikroliter wurde silonisiert, indem man Lösungsmittel zurückzog, bis sowohl die Nadel als auch die Spritze vollständig gefüllt waren. Die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur einwirken lassen, anschließend die Lösung aus der Spritze ablassen, den Kolben entfernen und die Spritze samt Nadel vollständig trocknen lassen. Zum Schluss die Spritze und die Nadel gründlich mit entionisiertem Wasser spülen.Nach der Silanisierung kann eine Spritze und Nadel über einen Zeitraum von mehr als sechs Monaten verwendet werden, bevor eine erneute Silanisierung erforderlich ist. Am Tag der Injektion geben Sie einen kleinen Tropfen der TAT-Lösung auf einen silanisierten Objektträger. Mit einer silanisierten Pipettenspitze entnehmen Sie die gewünschte Menge der Lösung aus diesem Tropfen und füllen sie in die Mikrovolumenspritze.Unter Verwendung eines Bohrers wird eine kleine Kraniotomie mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern entweder drei Millimeter rostral oder lateral zum dünnen kortikalen Schädelknochenfenster durchgeführt, an dem Zwei-Photonen-Aufnahmen angefertigt wurden. Dazu wird der Schädel vorsichtig angedünnt und anschließend mit einer scharfen Pinzette die dünne Knochenlage entfernt.Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die kalibrierte Nadel der Größe 35 und die Spritze mit der Kraniotomie auszurichten. Führen Sie die Nadel dann vorsichtig auf eine Tiefe von 700 bis 900 Mikrometern unterhalb der Oberfläche der Membran ein. Injizieren Sie drei Mikroliter mit einer Geschwindigkeit von 80 Nanolitern pro Minute mithilfe einer mikroprozessorgesteuerten Spritzenpumpe.Diese Abbildung zeigt mit GFP markierte Mikroglia, die mittels Zweiphotonen-Bildgebung nach der Implantation des dünnen Schädelknochen-Fensters etwa 50 Mikrometer unterhalb der Ablöseoberfläche sichtbar gemacht wurden. Die einzelnen Zweiphotonen-Schnitte, die am Tag null, 15 bis 30 Minuten nach der Implantation des dünnen Schädelknochen-Fensters, sowie sieben und 17 Tage später angefertigt wurden, zeigen, dass die Fenster klar bleiben, während die Mikroglia auch ohne entzündliche Reize aktiviert bleiben. Dies unterstreicht die Eignung dieser Methode zur Untersuchung sowohl normaler als auch entzündlicher Interaktionen zwischen Immun-Effektorzellen und anderen neuronalen Zelltypen.In vivo zeigen die Z-Projektionen sechs und 24 Stunden nach der Injektion des HIV-Neurotoxins TAT deutliche morphologische Veränderungen aktivierter Mikroglia. Dies verdeutlicht erneut, dass wir in der Lage sind, morphologische Veränderungen der Mikroglia in Echtzeit in akuten und chronischen Modellen der Neuroinflammation zu untersuchen. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man ein dünnes Schädel-Fenster präpariert und es zur Untersuchung der Neuroinflammation bei dieser Prozedur verwendet.Es ist wichtig, sich beim Bearbeiten des Schädels Zeit zu nehmen, um Schäden, die durch die Präparation selbst verursacht werden könnten, zu vermeiden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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