Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

Bei diesem Verfahren wird die Bildgebung von lebenden Zellen verwendet, um die Übertragung von GFP-markiertem HIV über virologische Synapsen zwischen HIV-exprimierenden Ruck-CAT-T-Zellen und nicht infizierten primären T-Zellen zu visualisieren. Der Zell-zu-Zell-Transfer-Assay beginnt mit der Durchtrennung von Jerk-CAT-T-Zellen mit HIV-Gag IG FP, einem infektiösen fluoreszierenden Klon von HIV one, den transfizierten Jerk-Cat-Zellen, die HIV-Gag exprimieren. IG FP werden dann mit C-M-T-M-R-markierten, nicht infizierten primären T-Zellen gemischt und in eine Bildgebungskammer geladen, in der der Transfer von GFP-markiertem HIV über die virologische Synapse beobachtet werden kann.

Die resultierenden Daten werden mit Hilfe von Bildanalysesoftware analysiert, um die Details der HIV-Übertragung über virologische T-Zell-Synapsen aufzudecken. Hallo, mein Name ist Benjamin Dale aus dem Labor von Ben Chen in der medizinischen Abteilung der Mount Sinai School of Medicine. Mein Name ist Greg McNerney im Labor von Dr. Thomas Huser am NSF Center for Biophotonics am UC Davis Medical Center.

Und ich bin Deanna Thompson, ebenfalls aus dem Labor von Dr. Thomas Huser. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Visualisierung des Zelltransfers von HIV one mit Hilfe der konfokalen Live-Mikroskopie. Bei diesem Verfahren werden Jerk-Hat-Zellen mit einem infektiösen molekularen Klon von HIV transfiziert, wobei nur geschultes Laborpersonal in zertifizierter Biosicherheit arbeitet.

Gewebekulturräume der Stufe zwei plus oder der Biosicherheitsstufe drei können das hier gezeigte Protokoll durchführen. Die Arbeit mit infektiösem HIV in bildgebenden Einrichtungen muss von der örtlichen institutionellen Biosicherheitsstelle genehmigt werden. Halten Sie die als Spenderzellen zu verwendenden Jerk-Cat-Zellen in einer Konzentration zwischen zwei mal 10 bis zur fünften und achtmal 10 bis zur fünften Zellen pro Milliliter.

In der Jerk-Cat-Kultur führt eine Medienzellkonzentration von mehr als acht mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter zu einer Verringerung der trans-Effizienz. Um den Eingriff zu beginnen, transfizieren Sie fünfmal 10 zu den sechs Jerk-Katzenzellen mit dem viralen Plasmid, HIV-Gag IGFP Unter Verwendung der amax-Nukleo-Affektion-Methode, wie im begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben, lassen Sie die Zellen über Nacht genesen. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes werden durch FICO-Dichtegradientenzentrifugation aus Buffy-Coats aus menschlichem Vollblut gereinigt.

Die primären CD-4-positiven T-Zellen werden aus den mononukleären Zellen des peripheren Blutes durch Negativselektion unter Verwendung eines CD-Vier-positiven T-Zell-Isolationskits gereinigt. Die negativ selektierten CD vier positive T-Zellen werden aus einer magnetischen Säule entnommen und in unserer PMI mit 10%FPS kultiviert, die mit 10 Einheiten pro Milliliter rekombinanter humaner IL ergänzt wird; zwei eins kann auch die isolierten primären CD vier positive T-Zellen aliquotieren und mit Hilfe von kryogenen Gefrierbehältern einfrieren. Die Gefrierbehälter werden für mindestens drei bis vier Stunden in einen Gefrierschrank bei minus 70 Grad Celsius gestellt.

Anschließend werden die Zellen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt. Nachdem nun die Jerk-Head-Zellen transfiziert und die primären CD-4-positiven T-Zellen isoliert wurden, fahren Sie am Tag nach der Transfektion mit der Reinigung und Markierung der Zellen fort. Die Jerk-Zellen exprimieren nun das infektiöse fluoreszierende HIV-Konstrukt.

Beim Umgang mit infektiösen Proben tragen wir einen Laborkittel mit Frontverschluss und zwei Paar Handschuhe. Entfernen Sie die zellulären Trümmer aus den transfizierten Zellen durch Zentrifugation über einem Fialmedium mit hoher Packungsdichte. Geben Sie zunächst 1,5 Milliliter Fial-Packung auf den Boden eines konischen 15-Milliliter-Röhrchens.

Überlagern Sie dann das Gradientenmaterial vorsichtig mit den transfizierten Jerk-Hat-Zellen in einem Volumen von fünf Millilitern unseres PMI-Mediums. Zu diesem Zeitpunkt sind die transfizierten Jerk-Hat-Zellen in der Lage, infektiöses HIV zu produzieren. Daher müssen alle Pipettenspitzen, die mit den HIV-exprimierenden Zellen in Berührung kommen, mit 10%iger Bleichlösung desinfiziert werden.

Bevor Sie das Röhrchen in einen Behälter in der Biosicherheitswerkbank werfen, verschließen Sie das Röhrchen und besprühen Sie die Außenseite des Röhrchens mit einer Lösung von 70 % Ethanol und wischen Sie es mit einem trockenen Kim-Tuch ab, zentrifugieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Abbruch. Nach der Zentrifugation werden die Zellen mit einer Pipette vorsichtig aus der Grenzfläche des Mediums entnommen und in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Verdünnen Sie die Zellen mit unserem PMI-Medium auf ein Gesamtvolumen von 15 Millilitern und zentrifugieren Sie bei 300 GS für 10 Minuten.

Bei Raumtemperatur suspendieren wir das Pellet in drei Millilitern Jerk-Hat-Nährmedium und geben es in eine zwei Zentimeter große Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Legen Sie die Platte in den Gewebekultur-Inkubator, bis sie am nächsten Tag verwendet werden kann. Am Abend desselben Tages markieren Sie die primäre CD mit vier positiven T-Zellen, die als Zielzellen verwendet wurden, um sie von den Spenderzellen zu unterscheiden. Erstes Pellet viermal 10 der sechs primären CD vier positive T-Zellen, indem es sich 10 Minuten lang bei 400 G dreht.

Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern PBS und Resus. In zwei Millilitern PBS suspendieren, Cell Tracker Orange auf eine Endkonzentration von 1,5 Mikromolar zugeben und minutenlang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Wenn die Zellen fertig inkubiert sind, fügen Sie acht Milliliter vollständiges Chica-Medium hinzu und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 400 g.

Die Zellen werden in drei Millilitern des kompletten Mediums, ergänzt mit 10 Einheiten pro Milliliter IL two, erneut suspendiert und über Nacht in den Gewebekultur-Inkubator gestellt. Nach der Inkubation über Nacht sind die Spender- und Zielzellen bereit für das Zell-zu-Zell-Transfer-Experiment. Bereiten Sie vor dem Einrichten des Zell-zu-Zell-Transfer-Experiments die Bildgebungskammer vor, um die Plattform gegen Temperaturschwankungen im Raum zu puffern.

Und um das Hintergrundlicht des Raums abzuschirmen, ist eine große schwarze Abdeckung über die gesamte Wärmeeinrichtung des Mikroskops drapiert, wodurch eine isolierte Lufttasche um das System herum entsteht. Die Bildgebungskammer wird mit einer thermostatischen Heizung mit einer Thermoelementspitze vom Typ T, die zur Temperaturrückmeldung neben der Probe platziert wird, auf stabilen 37 Grad Celsius gehalten. 30 Minuten vorheizen, bevor die Probe montiert wird.

Die konfokale Bildgebung mit Spinning-Disc mit einem inversen optischen Mikroskop wird verwendet, um konfokale 3D-Bilder des Zell-zu-Zell-Transfers von HIV zu erstellen. Die gesamte Hardware und die Erfassung, einschließlich eines Z-Tisches, werden über die und/oder IQ Version 1.8 Software gesteuert. Das Scannen erfolgt von einer konfokalen CS U 10 Spinning-Disc-Einheit, die gleichzeitig mehr als 800 konfokale Spots verwendet, um die Scanrate drastisch zu erhöhen und ihre Geschwindigkeit zu ergänzen. Das CS U 10 ist mit einer hochempfindlichen, elektronenvermehrenden, verkohlten, gekoppelten Gerätekamera gekoppelt, um eine schnelle Bildgebung bei schlechten Lichtverhältnissen zu ermöglichen, die sowohl das Photobleichen als auch die Phototoxizität reduziert.

Bei der Fluoreszenzlichtquelle handelt es sich um einen Multiwellenlängen-Argon-Krypton-Ionen-Gaslaser. Ein und/oder Oko-optischer abstimmbarer Filter oder ein OTF wird verwendet, um die gewünschten Wellenlängen auszuwählen, die hier 488 Nanometer und 568 Nanometer betragen, während ihre Leistung gesteuert wird, um das Photobleaching weiter zu reduzieren und die Bildgebungszeit zu verlängern. Das A OTF schaltet den Laser nach jeder Belichtungszeit von 15 bis 30 Millisekunden schnell ab, wenn die Kamera keine Bilder aufnimmt, wodurch unnötige Belichtungen vermieden werden, während die Bilder von der E-M-C-C-D-Kamera auf den Computer übertragen werden.

Das Laserlicht wird mit Hilfe eines 4 0 5 4 88 5 68 6 47 Quad-Band-Dichroitenspiegels in das Spinning-Disc-System eingebaut. Die Fluoreszenzemission wird mit Hilfe eines 560 Nanometer langen Diic-Spiegels mit einem Bildsplitter nach Wellenlänge getrennt. Der grüne Kanal wird mit einem Bandpassfilter von 525 über 50 Nanometern gefiltert und der rote Kanal wird mit einem Bandpassfilter von 609 über 54 Nanometern gefiltert. Die beiden Kanäle werden nebeneinander auf die E-M-C-C-D-Kamera projiziert.

Während sich die Bildgebungskammer aufwärmt, bereiten Sie die Zellen für das Zell-zu-Zell-Transfer-Experiment vor. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die HIV-Gag-IGFP-exprimierenden Zellen zu zählen. Stellen Sie das Hämozytometer in eine Petrischale, um eine direkte Exposition gegenüber den virusexprimierenden Zellen zu vermeiden.

Waschen Sie die Zellen mit Kohlendioxid und unabhängigen Medien und resuspendieren Sie sie in lebenden Zellbildgebungsmedien in einer Konzentration von ein- bis dreimal 10 der sieben Zellen pro Milliliter. Durch die Verwendung von kohlendioxidunabhängigen Medien entfällt die Notwendigkeit einer Kohlendioxid-Klimakammer. Für die Bildgebung.

Die Zellen zählen, waschen und resuspendieren auch die markierten primären CD vier positive T-Zellen, wie gerade für die Jerk-Hat-Zellen gezeigt. Als nächstes wird der Zell-zu-Zell-Transfer eingeleitet, 20 Mikroliter HIV-Gag-IGFP-transfizierte Dur-Hat-Zellen mit 40 Mikrolitern markierter primärer CD und vier positiven T-Zellen gemischt und 50 Mikroliter in eine mit Gewebekultur behandelte gasdurchlässige Flüssigkeit geladen. EBD-Mikrokammer, dichten Sie die Kammer mit Stopfen ab und sichern Sie die Stopfen, indem Sie die Stopfenschnittstelle der EBIT D-Kammer mit Paraform umwickeln.

Wischen Sie die Bildgebungskammer mit einem Chem-Tuch ab, das mit 70 % Ethanol verbunden ist, und lassen Sie es kurz in der Haube an der Luft trocknen. Transportieren Sie die versiegelte Bildgebungskammer in einem versiegelten Behälter, um eine versehentliche Exposition zu vermeiden. Sollte die Kammer während des Transports unmittelbar nach dem Beladen der IBD-Bildgebungskammer mit Zellen fallen gelassen werden, montieren Sie das Gerät auf das Mikroskop.

Nehmen Sie Bilder von Zellpaaren mit einem 60 x 1,42 NA Ölimmersionsobjektiv auf, da die hohe numerische Apertur die Auflösung erheblich verbessert, um die Erfassungsgeschwindigkeit pro 3D-Bildstapel zu maximieren. Schneiden Sie den Aufnahmebereich der Kamera der EM-CD auf den unmittelbaren Bereich eines Zellpaares zu. Darüber hinaus kann auch ein großer Z-Schritt zwischen 0,45 und 0,75 Mikrometern dazu beitragen, die Erfassung unter diesen Bedingungen zu beschleunigen.

Die Bilder werden kontinuierlich im Abstand von 20 bis 60 Minuten aufgezeichnet. Die wiederholte Bildgebung desselben Probenflecks kann bis zu sechs Stunden dauern, wobei das Photobleichen bei der Aufnahme minimal ist. Jedes Datensegment besteht aus Zehntausenden von Bildern, die insgesamt fünf bis 20 Gigabyte belegen können.

Um den Transport und die Analyse der großen Dateien zu erleichtern, wird jede Datei in ein Gigabyte große TIFF-Bilddateisegmente zerlegt und exportiert. Um die aufgenommenen Bilder zu analysieren, verwenden Sie eines von mehreren Bildanalyse-Softwareprogrammen. Konsultieren Sie das beigefügte schriftliche Protokoll für Einzelheiten zur Bildanalyse, einschließlich der Intensitätskorrektur des Bleichmittels und der automatischen und manuellen Verfolgung von Gag puncta.

Innerhalb von 10 bis 15 Minuten nach dem Mischen kann man die Bildgebung von HIV-Gag IGFP exprimierenden Jerk-Cat-Zellen visualisieren, die an primären CD 4-positiven T-Zellen haften. Mit diesen Konjugaten kann man die Bewegungen von gag puncta sowohl in infizierten Zellen als auch in Zielzellen beurteilen. Nach der Synapse, innerhalb von 30 Minuten bis drei Stunden, kann man die Bewegung von Gag IG FP puncta in Zielzellen beobachten, die mit dem Zelltracker markiert sind.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie den Zell-zu-Zell-Transfer von HIV zwischen T-Zellen visualisieren können. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es sehr wichtig, daran zu denken, alle Vorsichtsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe zwei plus oder der Biosicherheitsstufe drei beim Umgang mit Proben, die HIV-exprimierenden Zellen ausgesetzt waren, zu beachten. Denken Sie auch daran, gut gepflegte JCA-Zellen und endotoxinfreie DNA zu verwenden, um die Transfektion zu optimieren.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.