Name: Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie den Zell-zu-Zell-Transfer von HIV mit fluoreszierenden Klonen und konfokaler Live-Mikroskopie visualisieren. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse virologischer Synapsen zwischen T-Zellen.

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Diese Prüfung wurde von den National Institutes of Health gewährt, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, Hirschl Karriere Scientist Awards zu BKC und von der NSF Center for Biophotonik Science and Technology, Cooperative Agreement PHY012099 und ein UCD Health System Research Award an TH unterstützt UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al Wissenschaft 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Überblick Zell-Zell-Ausbreitung von HIV wurde ursprünglich beschrieben mit HIV infiziert Jurkat-Zellen als Spenderzellen und primäre CD4 + T-Lymphozyten als Akzeptor Zellen 1,2,3. In diesen Studien wurde das Virus in fixierten Zellen mittels Antikörper-Färbung festgestellt. So verfolgen die Übertragung des Virus von Zelle zu Zelle in lebenden Zellen, nutzen wir ein rekombinanter, infektiöser molekularer Klon von HIV genannt HIV Gag-iGFP 4. Es trägt das grün fluoreszierende Protein (GFP) intern in die Gag-Protein zwischen den MA und CA-Domains eingeführt. Dieser molekulare Klon von HIV behält Infektiosität ohne die Notwendigkeit für Helfervirus. Viruspartikel aus diesem Klon gemacht werden stöchiometrisch mit dem grün fluoreszierenden Protein geladen und bietet eine starke Fluoreszenz-Signal auf virale Montage und zwischen Zellen zu überwachen. Wenn in Verbindung mit inerten Zell-Tracking Fluoreszenzfarbstoffen, Empfänger-Zellen können aus Eingangs-Spenderzellen diskriminiert werden, und so dass man für die Übertragung von HIV von einer infizierten T-Zellen zu einem nicht infizierten T-Zelle 5 zu visualisieren. Virologische Synapsenbildung und Übertragung des Virus von einer Zelle zur anderen kann dann in lebenden Zellen beobachtet werden, während sie in einem verschlossenen, gasdurchlässige Bildgebung Kammer kultiviert werden. (Tag 1) 2. Vorbereitung von HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkat T-Zellen <ol><li> Bereiten Sie die menschlichen CD4 + T-Zelllinie Jurkat (ATCC, Manassas, VA) durch eine sorgfältige Pflege der Zellen bei einer Konzentration zwischen 2 x 10 5 und 8 x 10 5 Zellen / ml in Jurkat Kulturmedien (RPMI 1640, 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / mL Streptomycin). Der Schlüssel zum Erfolg: Kultur der Jurkat-Zellen bei Konzentrationen von über 8 x 10 5 Zellen / ml wird in einer Verringerung der Transfektionseffizienz führen. Hinweis: Die Transfektion von HIV Gag-iGFP Provirus-DNA in T-Zellen, wie unten beschrieben, führt zur Produktion von ein Replikations-kompetenten humanen Immundefizienz-Virus. Als solche sind alle Verfahren, die nur von geschultem Laborpersonal in zertifizierten Sicherheitsstufe 2 + oder Biosicherheitsstufe 3 (BL2 + / BL3) Gewebekultur Zimmer vorgenommen werden. Arbeiten mit infektiösen HIV in bildgebenden Einrichtungen muss von Ihrem lokalen institutionellen Biosicherheit genehmigt werden. </li><li> Transfizieren die Jurkats mit der viralen Plasmid, HIV Gag-iGFP mit dem Amaxa Nukleofektion Methode (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 150 x g. Saugen Sie den Überstand und die Zellen in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifugieren Sie die Zellen und das Pellet zu 97 ul vorgewärmtes, Nucleofector Lösung V mit dem Hersteller zu ergänzen. Fügen Sie drei ul von Endotoxin kostenlose HIV-Gag-iGFP Plasmid (1 pg / mL) zu der Zellsuspension und vorsichtig mischen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Küvette und nucleofect mit dem Programm S-18. Sofortüberweisung die Zellen 3 ml vorgewärmtem Jurkat Kulturmedien ohne Antibiotika. </li><li> Zur Vorbereitung CD4 + Zielzellen für die virologische Synapsen, erhalten wir humanen peripheren mononukleären Zellen aus Buffy Coats mit Hilfe eines Standard-Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Schweden)-Protokoll. CD4 + T-Zellen werden dann negativ gewählt mit Hilfe eines magnetischen Beads Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Diese können kryogen in flüssigem N2 in Aliquots von 5 x 10 6 cells/500 ul des Einfrierens Medien (90% fötalem Rinderserum serum/10% DMSO) gespeichert werden. Aufgetaut primären CD4 + T-Zellen werden in RPMI 10% FBS, mit 10 Einheiten / ml IL-2 kultiviert. </li></ol> (Tag 2) 3. Rückgewinnung von lebenden Zellen aus Jurkats mit HIV Gag-iGFP und Färbung der Zielzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen Transfizierte <ol><li> Lassen Sie die Jurkat-Zellen aus der Transfektion über Nacht erholen. Dann entfernen Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation über einen Ficoll Hypaque Dichtegradienten Material. Dispense 1,5 ml Ficoll-Paque, um den Boden eines 15 ml konischen Rohr. Gently Overlay dieses Gefälle Material mit den transfizierten Jurkats in einer 5-ml Volumen RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 xg für 20 min bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen aus dem media / Ficoll-Schnittstelle mit einer Pipette. Übertragung auf einen neuen 15 ml konischen Rohr. Verdünnen Sie die Zellen mit RMPI auf ein Gesamtvolumen von 15 ml und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Das Pellet in 3 ml Jurkat Kulturmedien in einer 2 cm gut (6-Well-Platte) und geben die Zellen der Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Zur Unterscheidung Zielzellen von Spenderzellen in Zell-Zell-Transfer-Experimenten haben wir prelabel der CD4 + Zielzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen. Primäre CD4 + T-Zellen sind die sogar alsIng. vor dem Gebrauch. Wir haben ausgezeichnete Erfolge Kennzeichnung T-Zellen sowohl mit CellTracker und CellTrace Farbstoffe (Invitrogen, Carlsbad, CA) hatte. Während der Farbstoffkonzentration und Inkubationszeiten müssen optimiert, je nach den besonderen Farbstoff und Zelltyp verwendet werden, folgt eine repräsentative Protokoll. Pellet 4 x 10 6 primären CD4 + T-Zellen durch Schleudern bei 400 xg für 10 min. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS resuspendieren und in 2 ml PBS. Add CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) auf eine Endkonzentration von 1,5 um und bei 37 ° C für 20 min. 8 ml komplette Jurkat Medien und Zentrifuge bei 400 xg für 10 min. Resuspendieren der Zellen in 3 ml komplettem Medium mit 10 Einheiten / ml IL-2 und in der Gewebekultur-Inkubator über Nacht ergänzt. </li></ol> (Tag 3) 4. Überwachung Zell-Zell-Transfer von HIV Gag-iGFP mit Live Cell Imaging Wir verwenden routinemäßig HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkat-Zellen 48 Stunden nach der Transfektion. Allerdings haben wir erfolgreich Zellen bereits nach 24 Stunden benutzt, und so spät wie 72 Stunden nach der Transfektion. <ol><li> Etwa 48 Stunden nach der Transfektion werden HIV Gag-iGFP Ausdruck Jurkats gezählt, gewaschen mit CO 2-unabhängigen Medien (Invitrogen, Carlsbad, CA), und erneut im Live Cell Imaging Medien (CO 2 unabhängige Medien, 10% fötalem Rinderserum, 100 U / mL Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, 10 Einheiten / ml IL-2) in einer Konzentration von 1-3 x 10 7 Zellen / ml. </li><li> In ähnlicher Weise, waschen und resuspendieren markierte primäre CD4 + T-Zellen bei einer Konzentration von 1-3 x 10 7 Zellen / ml im Live Cell Imaging Medien. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP-transfizierten Jurkats mit primären CD4 + T-Zellen bei einer 1:2 oder 1:3 Verhältnis und Last in einer Gewebekultur behandelt, gasdurchlässigen, Mikrokammer (ibidi, Verona, WI). Zum Beispiel, mix 20 ul von HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkats mit 40 ul der markierten primären CD4 + T-Zellen. Legen Sie 50 ul dieser Mischung in ein ibidi Kammer und Dichtung der Kammer mit Steckern. Sichern Sie den Stecker durch Umwickeln der Stecker / ibidi Kammer-Schnittstelle mit Parafilm. </li></ol> 5. Überlegungen für die Mikroskopie Plattformen: Spinning-Disk-konfokale Abbildung Nach dem Laden eines ibidi Bildgebung Kammer mit Zellen, haben wir sofort Montieren Sie das Gerät auf einer invertierten optischen Mikroskop (IX71 Olympus, Center Valley, PA). Die ibidi Kammer sollte das Mikroskop nur durch BL2 +-qualifiziertem Laborpersonal Tragen geeigneter Schutzkleidung übertragen werden. Obwohl live-cell imaging häufigsten verwendet teure Inkubationskammern, um eine stabile 37 ° C Umgebung zu erhalten, diese wurde mit einer einfachen und kostengünstigen Thermostat Heizung (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) zusammen mit einem T-Typ Thermoelement Spitze montiert neben die Probe für die richtige Temperatur Feedback. Wir haben festgestellt, mit CO 2-unabhängigen Medien uns zu hohen Zellvitalität zu halten bei gleichzeitiger Vermeidung der Verwendung eines CO 2-Kammer ermöglicht. Um die Plattform gegen Temperaturschwankungen im Raum Puffer und zu blockieren, die Hintergrund Licht ausgesetzt, so ist ein großer schwarzer Schleier über das ganze Mikroskop / Heizung Setup Erstellung einer isolierten Luftblase rund um das System drapiert. Dies reduziert Temperaturschwankungen und der damit verbundenen Temperatur-bezogene Probe Drift, sondern erfordert eine Vorwärmung für 30 Minuten vor dem Einbau der Probe. 6. Data Acquisition, Transfer-und Bildverarbeitung Die Bilder sind aufgenommen mit einem 60x 1,42 NA Ölimmersionsobjektiv (UPlanApo N, Olympus), als der hohen numerischen Apertur (NA) erheblich verbessert die Auflösung. So erstellen Sie 3D-konfokale Bilder, ist das Scannen von einer sich drehenden Scheibe konfokalen Einheit (CSU-10, Yokagawa, Japan), die gleichzeitig verwendet&gt; 800 konfokalen Spots zu einem dramatischen Anstieg der Abtastrate durchgeführt. Zur Ergänzung seiner Geschwindigkeit, die CSU-10 ist mit einem hochempfindlichen Elektron-Multiplikation berechnet-coupled device (EMCCD, iXon + 897, Andor Technologies, Irland) Kamera auf schnelle, leichte Bildgebung, die sowohl Bleichen und Phototoxizität reduziert damit gepaart. Die Fluoreszenz-Lichtquelle ist ein Multi-Wellenlängen-ARKR Ionen-Gaslaser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), wo die gewünschten Wellenlänge (488 nm) und Laserleistung direkt vor dem Mikroskopobjektiv (&lt;1 mW) gemessen werden von einem ausgewählten akusto- optischen abstimmbaren Filter (AOTF), (Andor Technologies). Zur weiteren Reduzierung Ausbleichen und zu erweitern Total imaging Zeit, schaltet sich der AOTF schnell (Mikrosekunden) aus dem Laserstrahl jedes Mal, wenn die Kamera nicht aktiv ist (10-20 ms), während die neu erworbene Bild von der CCD (15-30 ms Belichtungszeit) geliefert wird, auf den Computer. Das Laserlicht wird in die sich drehende Scheibe-System mit einem 405/488/568/647 Quadband dichroitischen Spiegel (Semrock, Rochester, NY) gekoppelt. Fluoreszenzemission wird gefiltert mit einem 525/50 Bandpassfilter (Semrock) in einem Filterrad (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) montiert bVergleicht man die EMCCD Kamera und die konfokale Spinning-Disk-Einheit. Alle verwendeten Hard-und Übernahme, einschließlich einer z-Phase (Mad City Labs, Madison, WI), werden durch die Andor iQ v1.8 Software gesteuert. Um die Geschwindigkeit des Erwerbs von rund 1,2-1,9 zweite 3D Bildstapel zu maximieren, Ernte wir die Aufnahme Region des EMCCD Kamera bis auf die Zell-Paar der unmittelbaren Umgebung. Darüber hinaus auf Kosten der einige Informationen in z kann eine große z-Schritt zwischen 0,45-0,75 um zur Beschleunigung Akquisition werden. Imaging unter diesen Bedingungen kann bis zu 6 Stunden - mit kontinuierlichen 20-60 Minuten-Segmente - mit minimalem Ausbleichen. Insgesamt jedes Datensegment in der Regel nimmt 5-20 GB Speicherplatz als Zehntausende von Bildern getroffen werden. Zur Erleichterung des Transports und der Analyse der großen Datendateien, muss jeder Erwerb eingestellt abgebaut und exportiert als 1 Gb TIFF-Image-Datei-Segmente mit dem Andor iQ v1.8 Software. Von hier aus sind viele ausgezeichnete Software-Pakete für Bildanalyse, wie Metamorph, Volocity und ImageJ (wir empfehlen ihre Variation Fiji). Wenn zwei fluoreszierenden Markern verfolgt werden soll, haben wir gleichzeitig aufnehmen beide ohne zu verlangsamen Übernahme durch eine &quot;Split-Screen-Modus.&quot; Beide Marker werden durch zwei verschiedene ARKR Laserlinien auf einmal (oft 488 und 568 nm) angeregt. Direkt vor dem EMCCD Kamera wird ein Bild Splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK), dass die beiden unterschiedlichen Bilder trennt eingefügt. Jedes Bild wird dann unabhängig gefiltert mittels Fluoreszenz-Filter (Semrock) und projiziert side-by-Side an der Kamera auf einmal die Schaffung der &quot;split-screen&quot;-Effekt. Dies würde dann eine manuelle Zuschneiden und Ausrichten der Bilder später in der Bildverarbeitung. 7. Überlegungen für die Bildverarbeitung und Datenanalyse Wir arbeiten typischerweise Bildanalyse mit Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) auf Macintosh-Computern (Apple, Inc). Spinning Disk Laser konfokalen Mikroskopie-Aufnahmen werden zunächst in ihrer Intensität angepasst werden, um für Bleichen, dann mit Volocity entfalteten korrigieren. Intensitätsmessungen und Verfolgung von Gag puncta mit dem Volocity Quantifizierung Modul durchgeführt. Bei Bild-Sets, bei denen die Bewegung relativ zu einem vorgeformten Synapse muss berechnet werden, ist ein automatisiertes Tracking-Algorithmus eingesetzt werden, die Spuren der synaptischen Taste während der gesamten Sequenz. Manuelle Kontrolle der Regionen von Interesse durch die Nachführung Software definiert werden muss durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die Software richtig auf das gewünschte Objekt verfolgt werden. Für Objekte, bei denen der Kontrast mit der umgebenden Objekte zu schwach ist, kann die manuelle Abtastung auf einer Frame-by-Frame-Basis durchgeführt werden. Die Volocity Software-Paket ermöglicht den Export von XYZ Lage, das Volumen und integrierte Signal innerhalb der gewünschten Objekte. Der Abstand von der Synapse und die Geschwindigkeit des verfolgten Objekts werden durch die Normalisierung der Bewegungen in die Mitte der synaptischen Button berechnet. 8. Repräsentative Ergebnisse Innerhalb von 10 bis 15 Minuten Mischen sollte man in der Lage sein HIV Gag-iGFP Ausdruck Jurkat-Zellen anhaftende primäre CD4 + T-Zellen zu visualisieren. Imaging diese Konjugate, kann man die Bewegungen der Gag Punkte in infizierten Zellen sowie in Zielzellen nach synaspe beurteilen. Man kann die Bewegung des Gag-iGFP puncta in Zielzellen bald bemerken, nachdem Synapsen gebildet werden.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

Wir beschreiben hier eine einfache Methode zur Visualisierung der Übertragung von HIV von der Zell-Zell. Neuere Forschungen aus unserem Labor und andere &quot;legt nahe, dass dies die vorherrschende Form der HIV zwischen T-Zellen verteilt werden. Die hier beschriebene Methode nutzt eine rekombinante Form des HIV, genannt HIV Gag-iGFP, die einen genetisch kodierte grün fluoreszierendes Protein-Tag in den Kern Strukturprotein, Gag trägt. Aufgrund des hohen Niveaus der GFP in jedem Viruspartikel produziert, ermöglicht diese Replikations-kompetente Klon von HIV-Forscher an einzelne Viruspartikel in Echtzeit zu verfolgen. Dieser Virus sollte besonders nützlich in Studien über die Montage-und Zell-Zell-Transfer von HIV. Die Übertragung von HIV durch Zell-Zell-Transfer ist sehr effizient. Während einer dreistündigen Co-Kultur, Routine sehen wir Virus auf 20-30% der primären T-Zellen übertragen, wie mittels Durchflusszytometrie untersucht. Ähnliche Effizienzsteigerungen sind qualitativ im Live Cell Imaging gesehen. Viral infizierte T-Zellen beginnen bilden Synapsen mit infizierten primären T-Zellen fast unmittelbar nach der Einleitung des Co-Kultur. Interessant sind nicht alle primären T-Zellen zur Wechselwirkung mit HIV-infizierten Jurkat-Zellen trotz gezwungen Interaktionen mit Laser-Pinzette (unveröffentlichte Beobachtungen, GM). HIV Gag-iGFP wird zweifellos nützlich für die Bestimmung T-Zell-Subsets, die am anfälligsten für Zell-Zell-Transfer, sowohl in vitro und in vivo sind.

<table><tbody><tr><td>Jurkat-T-Zellen</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leukozyten-Buffercoat aus Vollblut</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector-System und Lösung V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi-Präp-Kits</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-Gag-iGFP-Plasmid</td><td>Chen Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD4+-T-Zell-Isolationskit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celltracker/CellTrace-Farbstoffe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-unabhängige Medien</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungskammern</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 inverses Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlanApo N 1,42NA 60X Öl-Objektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C ArKr-Ionengaslaser</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-10 Nipkow-Scheiben-Confocal-Einheit</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dichroitische Strahlteiler Di01-T405/488/568/647-13x15x0,5</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>525/50-Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon+ 897 elektronenvervielfachende CCD-Kamera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASI 400 thermostatische Heizung</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing zell-zell-transfer von hiv unter verwendung von fluoreszierenden klone von hiv und live-konfokale mikroskopie

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Durch die Fusion des grün fluoreszierenden Proteins, um ihre Lieblings-Proteine, Biologen haben jetzt die Möglichkeit zu studieren lebende komplexen zellulären Prozesse mittels Fluoreszenz-Video-Mikroskopie. So verfolgen die Bewegungen des humanen Immundefizienz-Virus-Core-Protein während der Zell-Zell-Übertragung des Humanen Immundefizienz-Virus, haben wir die Gag-Protein in Zusammenhang mit einer infektiösen molekularen Klon von HIV, genannt HIV Gag-iGFP GFP-markierten. Wir untersuchen diese virale Klon mit Video-konfokale Mikroskopie. In den folgenden visualisiert Experiment transfizieren wir eine menschliche T-Zell-Linie mit HIV Gag-iGFP, und wir nutzen fluoreszenzmarkierten infizierten CD4 + T-Zellen als Zielzellen für das Virus dienen. Anhand der unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungen wir ohne weiteres folgen virale Produktion und den Transport über interzelluläre Strukturen können als virologische Synapsen. Einfache gasdurchlässige Bildgebung Kammern ermöglichen es uns, Synapsen mit Live-konfokale Mikroskopie von Minuten bis Tagen zu beobachten. Diese Ansätze können verwendet werden, um virale Proteine ​​verfolgen, wie sie in von einer Zelle zur nächsten zu bewegen.

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

Durch die Fusion des grün fluoreszierenden Proteins an ihre bevorzugten Proteine sind Biologen nun in der Lage, lebende komplexe zelluläre Prozesse mithilfe von ... zu untersuchen.

Dieses Verfahren nutzt die Live-Cell-Bildgebung, um die Übertragung von GFP-markiertem HIV über Virologische Synapsen zwischen HIV-exprimierenden Jurkat-CAT-T-Zellen und nicht infizierten primären T-Zellen sichtbar zu machen. Der Zelle-zu-Zelle-Übertragungsassay beginnt mit der Transfektion von Jurkat-CAT-T-Zellen mit HIV-gag-iGFP, einem infektiösen, fluoreszierenden HIV-1-Klon. Die transfizierten Jurkat-CAT-Zellen, die HIV-gag-iGFP exprimieren, werden anschließend mit CMTMR-markierten, nicht infizierten primären T-Zellen gemischt und in eine Bildgebungskammer gegeben, in der die Übertragung von GFP-markiertem HIV über die Virologische Synapse beobachtet werden kann.Die resultierenden Daten werden mithilfe einer Bildanalyse-Software analysiert, um die Details der HIV-Übertragung über virologische Synapsen von T-Zellen aufzudecken. Hallo, mein Name ist Benjamin Dale aus dem Labor von Ben Chen an der Abteilung für Innere Medizin der Mount Sinai School of Medicine. Mein Name ist Greg McNerney aus dem Labor von Dr. Thomas Huser am NSF-Zentrum für Biophotonik am UC Davis Medical Center.Und ich bin Deanna Thompson, ebenfalls aus dem Labor von Dr. Thomas Huser. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Visualisierung der Zell-Zell-Übertragung von HIV-1 mithilfe lebend-konfokaler Mikroskopie. Bei diesem Verfahren werden Jurkat-Zellen mit einem infektiösen molekularen HIV-Klon transfiziert, der ausschließlich von geschultem Laborpersonal in zertifizierter Biosicherheit gehandhabt wird.Stufe-zwei-plus- oder Biosicherheitsstufe-drei-Zellkulturräume können das hier gezeigte Protokoll durchführen. Die Arbeit mit infektiösem HIV in bildgebenden Einrichtungen muss von der örtlichen institutionellen Stelle für Biosicherheit genehmigt werden. Pflegen Sie die als Donorzellen verwendeten Jerk-Cat-Zellen bei einer Konzentration zwischen zwei mal 10 hoch fünf und acht mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter.In der Kultur von Jerk-Katzenzellen führt eine Zellkonzentration von mehr als achtmal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter zu einer Verringerung der Transduktions-Effizienz. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie fünfmal 10 hoch sechs Jerk-Katzenzellen mit dem viralen Plasmid HIV gag IGFP mittels der Amax-Nukleofektions-Methode transduzieren, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben, und lassen Sie die Zellen über Nacht regenerieren. Periphere mononukleäre Blutzellen werden aus Buffy-Coats von menschlichem Vollblut durch Zentrifugation über eine FICO-Dichtegradienten-Trennung gewonnen.Die primären CD4-positiven T-Zellen werden aus peripheren mononukleären Blutzellen durch negative Selektion unter Verwendung eines CD4-positiven T-Zell-Isolationskits gereinigt. Die negativ selektierten CD4-positiven T-Zellen werden aus einer magnetischen Säule gesammelt und in unserem PMI mit 10 % FPS kultiviert, das mit 10 Einheiten pro Milliliter rekombinantem humanen IL-2 ergänzt ist. Alternativ können die isolierten primären CD4-positiven T-Zellen portioniert und mithilfe kryogener Gefriermittel eingefroren werden. Die Gefriermittel werden für mindestens drei bis vier Stunden in einen minus 70 Grad Celsius kalten Gefrierschrank gestellt.Die Zellen werden anschließend zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt. Nachdem nun die Jerk-Kopfzellen transfiziert und die Ziel-primären CD4-positiven T-Zellen isoliert wurden, fahren Sie am Tag nach der Transfektion mit der Reinigung und Markierung der Zellen fort. Die Jerk-Zellen exprimieren nun den infektiösen, fluoreszierenden HIV-Konstrukt.Bei der Handhabung infektiöser Proben tragen wir einen vorn schließenden Laborkittel und zwei Paar Handschuhe. Entfernen Sie die zellulären Bestandteile aus den transfizierten Zellen durch Zentrifugation über ein Fial-High-Pack-Density-Medium. Geben Sie zunächst 1,5 Milliliter Fial Pack auf den Boden eines 15-Milliliter-Konizialrohrs.Danach vorsichtig das Gradientenmaterial mit den transfizierten Jerk-Hat-Zellen in einem Volumen von fünf Milliliter unseres PMI-Mediums überlagern. Zu diesem Zeitpunkt sind die transfizierten Jerk-Hat-Zellen in der Lage, infektiöses HIV zu produzieren. Daher müssen alle Pipettenspitzen, die mit den HIV-exprimierenden Zellen in Kontakt kommen, mit einer 10%igen Bleichmittel-Lösung desinfiziert werden.Decken Sie das Röhrchen zu und besprühen Sie die Außenseite des Röhrchens mit einer 70 %igen Ethanol-Lösung, bevor Sie es in einen Behälter im Sicherheitswerkbank entsorgen; wischen Sie es anschließend mit einem trockenen Kim-Tuch ab. Zentrifugieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 400 × g und ausgeschaltetem Bremsmodus. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig mit einer Pipette die Zellen von der Phasengrenze zwischen Medium und Fial und überführen Sie die Zellen in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie die Zellen mit unserem PMI-Medium auf ein Gesamtvolumen von 15 Milliliter und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 × g.Bei Raumtemperatur suspendieren wir das Pellet in drei Milliliter Jerk-Hat-Kulturmedium und überführen es in eine Zweizentimeter-Vertiefung einer sechswelligen Platte. Stellen Sie die Platte in den Gewebekultur-Inkubator, bis sie am folgenden Tag verwendet wird. Am Abend desselben Tages beschriften Sie die primären CD4-positiven T-Zellen, die als Zielzellen verwendet werden, um sie von den Spenderzellen zu unterscheiden. Pelletieren Sie zunächst viermal 10 der sechs primären CD4-positiven T-Zellen durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 Minuten.Waschen Sie die Zellen anschließend mit fünf Millilitern PBS und resuspendieren Sie sie in zwei Millilitern PBS. Geben Sie Cell Tracker Orange bis zu einer Endkonzentration von 1,5 µM hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für Minuten. Nach Beendigung der Inkubation fügen Sie acht Milliliter vollständiges Chica-Medium hinzu und zentrifugieren bei 400 × g für 10 Minuten.Suspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter komplettem Medium, das mit 10 Einheiten pro Milliliter IL-2 ergänzt wurde, und stellen Sie sie über Nacht in den Zellkultur-Inkubator. Nach der Übernacht-Inkubation sind die Donor- und Target-Zellen für das Zelle-zu-Zelle-Transfer-Experiment bereit. Bevor Sie das Zelle-zu-Zelle-Transfer-Experiment aufbauen, bereiten Sie die Abbildungskammer vor, um die Plattform gegen Temperaturschwankungen im Raum abzupuffern.Um das störende Umgebungslicht auszublenden, wird eine große schwarze Abdeckung über den gesamten Mikroskop-Heiz-Aufbau gelegt, wodurch ein isolierter Luftspalt um das System entsteht. Die Abbildungskammer wird mithilfe einer thermostatischen Heizung konstant auf 37 Grad Celsius gehalten, wobei eine T-Typ-Thermoelementspitze neben der Probe zur Temperaturüberwachung dient. Vor dem Einbringen der Probe 30 Minuten vorheizen.Die Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie mit einem invertierten optischen Mikroskop wird verwendet, um 3D-konfokale Aufnahmen des Zell-zu-Zell-Transfers von HIV zu erstellen. Alle Hardwarekomponenten und die Bildaufnahme, einschließlich einer Z-Ebene, werden über die Software Andor IQ, Version 1.8, gesteuert. Die Abtastung erfolgt mit einer CSU-10-Spinning-Disk-Konfokaleinheit, die gleichzeitig mehr als 800 konfokale Punkte nutzt, um die Abtastrate erheblich zu erhöhen und so ihre Geschwindigkeit zu ergänzen. Die CSU-10 ist mit einer hochsensiblen elektronenvervielfachenden CCD-Kamera gekoppelt, die eine schnelle Aufnahme bei schwachem Licht ermöglicht und dadurch sowohl Photobleichen als auch Phototoxizität verringert.Die Fluoreszenzlichtquelle ist ein mehrwellenlängiger Argon-Krypton-Ionengaslaser. Ein Oko-Optik-Abstimmfilter (AOTF) wird verwendet, um die gewünschten Wellenlängen auszuwählen, hier 488 Nanometer und 568 Nanometer, und gleichzeitig deren Leistung zu steuern, um die Photobleiche zu verringern und die Aufnahmezeit zu verlängern. Das AOTF blockiert den Laser blitzschnell nach jeder 15 bis 30 Millisekunden dauernden Belichtung, wenn die Kamera keine Bilder aufnimmt, wodurch unnötige Belichtung vermieden wird, während die Bilder von der E-M-C-C-D-Kamera auf den Computer übertragen werden.Das Laserlicht wird mithilfe eines 405/488/568/647-Quadbanddichroischen Spiegels in das Drehscheibensystem eingekoppelt. Die fluoreszente Emission wird nach Wellenlängen mittels eines 560-Nanometer-Longpassdichroischen Spiegels mit einem Bildteiler getrennt. Der grüne Kanal wird durch einen 525/50-Nanometer-Bandpassfilter und der rote Kanal durch einen 609/54-Nanometer-Bandpassfilter gefiltert. Die beiden Kanäle werden nebeneinander auf die E-M-CCD-Kamera projiziert.Während die Abbildungskammer aufwärmt, bereiten Sie die Zellen für das Zelle-zu-Zelle-Transfer-Experiment vor. Zählen Sie die HIV-gag-IGFP-exprimierenden Ette-Zellen mit einem Hämozytometer. Stellen Sie das Hämozytometer in eine Petrischale, um eine direkte Exposition gegenüber den virusexprimierenden Zellen zu vermeiden.Die Zellen mit CO₂-unabhängigen Medien waschen und in Live-Cell-Imaging-Medien mit einer Konzentration von ein bis drei mal 10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendieren. Die Verwendung von CO₂-unabhängigen Medien macht eine CO₂-Umkammerung überflüssig. Zum Imaging.Die Zellen zählen, waschen und resuspendieren außerdem die markierten primären CD4-positiven T-Zellen, wie zuvor für die Jurkat-Zellen gezeigt. Als Nächstes initiieren Sie die Zell-zu-Zell-Übertragung, indem Sie 20 µL HIV-gag-I-GFP-transfizierter Jurkat-Zellen mit 40 µL markierten primären CD4-positiven T-Zellen mischen und 50 µL dieser Mischung in eine zellkulturgeeignete, gasdurchlässige EBD-Mikrokammer geben. Verschließen Sie die Kammer mit Stopfen und sichern Sie diese, indem Sie die Verbindungsstelle zwischen Stopfen und EBD-Kammer mit Parafilm umwickeln.Reinigen Sie die Bildgebungskammer mit einem mit 70 % Ethanol getränkten Chemiewisch und lassen Sie sie kurz in der Abzugshaube an der Luft trocknen. Transportieren Sie die verschlossene Bildgebungskammer in einem geschlossenen Behälter, um unbeabsichtigte Exposition zu vermeiden. Falls die Kammer nach dem Beladen der IBD-Bildgebungskammer mit Zellen während des Transports fallen gelassen wird, montieren Sie das Gerät unmittelbar auf das Mikroskop. Nehmen Sie Bilder von Zellpaaren mit einem 60x 1,42 NA Öl-Immersionsobjektiv auf, da die hohe numerische Apertur die Auflösung erheblich verbessert und die Geschwindigkeit der Aufnahme pro 3D-Bildstapel maximiert. Beschneiden Sie den Aufnahmebereich der Kamera des EM-CD auf den unmittelbaren Bereich eines Zellpaares. Außerdem kann ein großer Z-Schritt zwischen 0,45 und 0,75 Mikrometern die Aufnahme unter diesen Bedingungen beschleunigen.Bilder werden kontinuierlich im Abstand von 20 bis 60 Minuten aufgenommen. Bei geeigneter Aufnahmebedingung kann die wiederholte Abbildung derselben Probenstelle bis zu sechs Stunden dauern, wobei eine minimale Photo-Bleaching-Effekte auftreten. Jedes Datensegment besteht aus Zehntausenden von Bildern, die insgesamt fünf bis 20 Gigabyte Speicherplatz belegen können.Um den Transport und die Analyse der großen Dateien zu erleichtern, wird jede Datei in Segmente von jeweils einem Gigabyte als TIFF-Bilddateien aufgeteilt und exportiert. Zur Analyse der aufgenommenen Bilder verwenden Sie eines von mehreren Bildanalyse-Softwareprogrammen. Weitere Einzelheiten zur Bildanalyse, einschließlich der Korrektur der Intensitätsverarmung sowie der automatischen und manuellen Verfolgung von gag-Punkten, finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll.Innerhalb von 10 bis 15 Minuten nach der Mischung lassen sich HIV-gag-IGFP-exprimierende Jerk-Katzenzellen beobachten, die an primäre CD4-positive T-Zellen haften. An diesen Konjugaten kann man die Bewegungen von Gag-Punkten in infizierten Zellen sowie in Zielzellen untersuchen. Nach der Synapse, innerhalb von 30 Minuten bis drei Stunden, kann man die Bewegung von Gag-IGFP-Punkten in Zielzellen beobachten, die mit einem Zelltracer markiert sind.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Zelle-zu-Zelle-Übertragung von HIV zwischen T-Zellen sichtbar macht. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es sehr wichtig, stets alle Vorsichtsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe zwei plus oder der Biosicherheitsstufe drei zu beachten, wenn Proben bearbeitet werden, die mit HIV-exprimierenden Zellen in Kontakt gekommen sind. Denken Sie außerdem daran, gut gepflegte JCA-Zellen und endotoxinfreie DNA zu verwenden, um die Transfektion zu optimieren.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine Technik, die Kombination von in situ-Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) ermöglicht die Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Nähe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen, um ihre Virus-infizierte Zielzellen, und die Bestimmung der quantitativen Beziehungen zwischen diesen Immunsystem Effektoren und Targets auf eine Infektion Ergebnisse.

Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ</em

Wir haben einen lentiviralen Vektor, besitzt neben dem Tat-responsive LTR entwickelt, das Rev-Response-Element (RRE), dass die Expression des Reportergens in einer HIV-1 Tat-und Rev-abhängigen Weise regulieren können. Der Vektor erlaubt den spezifischen Nachweis von HIV Replikation in lebenden Zellen über die Expression von GFP.

Spezielle Kennzeichnung von HIV-1 positiven Zellen mit Hilfe eines Rev-abhängigen Lentivirale Vector mit dem Ausdruck des Green Fluorescent Protein

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bildung einer HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsen auf Glas unterstützt planare Doppelschichten durch Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie sichtbar zu machen. Das Verfahren kann auch mit Immunfluoreszenzfärbung kombiniert werden, um die Aktivierung und Umverteilung von Signalmolekülen, die während der HIV-1-induzierten Umschlag virologische Synapsenbildung auftreten zu erkennen.

Imaging von HIV-1 Envelope-induzierte virologische Synapse und Signalisierung auf Synthetic Lipiddoppelschichten

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Quelle: Shah, R., et al. Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine sowie zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die gleichzeitige Visualisierung von HIV-1-DNA, RNA und Kapsidprotein in infizierten menschlichen Lymphozyten mittels verzweigter DNA-Hybridisierung und Immunfluoreszenz, wodurch eine detaillierte Analyse der einzelnen Stadien der Virusreplikation...

Multiplexes Fluoreszenz-Imaging von viralen Nukleinsäuren und Proteinen in infizierten menschlichen Lymphozyten

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Live-Cell-Imaging von alphaherpes Virusinfektionen ermöglicht die Analyse der dynamischen Ereignisse gerichteten Transport und interzelluläre Ausbreitung. Hier präsentieren wir Methoden, die rekombinanten viralen Stämmen, fluoreszierende Fusionsproteine ​​Visualisierung der viralen Baugruppen während der Infektion von primären Neuronen erleichtern nutzen.

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, in dem einzelne Zellen auf akute Ereignisse und produktive HIV-1-Infektionen auf einem nanofluidischen Gerät überwacht werden. Bildgebende Daten definieren Virus-Wirt-Rezeptor-Interaktionen und Signalwegdynamik. Dies ist die erste Methode für nanofluidische Hochdurchsatz-Längskultur und Bildgebung von Einzelzellen, um Signalkinetik und molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

Einzelzellcharakterisierung von Kalziumzufluss und HIV-1-Infektion mit einer multiparametern optofluidischen Plattform

Erfahren Sie, wie Sie den Zell-zu-Zell-Transfer von HIV mit fluoreszierenden Klonen und konfokaler Live-Mikroskopie visualisieren. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse virologischer Synapsen zwischen T-Zellen.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

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