Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

Dieses Verfahren nutzt die Live-Cell-Bildgebung, um die Übertragung von GFP-markiertem HIV über Virologische Synapsen zwischen HIV-exprimierenden Jurkat-CAT-T-Zellen und nicht infizierten primären T-Zellen sichtbar zu machen. Der Zelle-zu-Zelle-Übertragungsassay beginnt mit der Transfektion von Jurkat-CAT-T-Zellen mit HIV-gag-iGFP, einem infektiösen, fluoreszierenden HIV-1-Klon. Die transfizierten Jurkat-CAT-Zellen, die HIV-gag-iGFP exprimieren, werden anschließend mit CMTMR-markierten, nicht infizierten primären T-Zellen gemischt und in eine Bildgebungskammer gegeben, in der die Übertragung von GFP-markiertem HIV über die Virologische Synapse beobachtet werden kann.

Die resultierenden Daten werden mithilfe einer Bildanalyse-Software analysiert, um die Details der HIV-Übertragung über die virologischen Synapsen von T-Zellen aufzudecken. Hallo, mein Name ist Benjamin Dale aus dem Labor von Ben Chen an der Abteilung für Innere Medizin der Mount Sinai School of Medicine. Mein Name ist Greg McNerney aus dem Labor von Dr. Thomas Huser am NSF-Zentrum für Biophotonik am UC Davis Medical Center.

Und ich bin Deanna Thompson, ebenfalls aus dem Labor von Dr. Thomas Huser. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Visualisierung der Zell-Zell-Übertragung von HIV-1 unter Verwendung der lebenden konfokalen Mikroskopie. Bei diesem Verfahren werden Jurkat-Zellen mit einem infektiösen molekularen HIV-Klon transfiziert, der nur von geschultem Laborpersonal in zertifizierten Biosicherheitslaboren verwendet werden darf.

Stufe zwei plus oder Biosicherheitsstufe-drei-Zellkulturräume können das hier gezeigte Protokoll durchführen. Die Arbeit mit infektiösem HIV in bildgebenden Einrichtungen muss von der örtlichen institutionellen Biosicherheitsstelle genehmigt werden. Halten Sie die als Donorzellen verwendeten Jerk-Cat-Zellen in einer Konzentration zwischen zwei mal 10 hoch fünf und acht mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter aufrecht.

In der Kultur von Jerk-Cat-Zellen führt eine Zellkonzentration von mehr als achtmal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter zu einer Verringerung der Transduktions-Effizienz. Um das Verfahren zu beginnen, transfizieren Sie fünfmal 10 hoch sechs Jerk-Cat-Zellen mit dem viralen Plasmid HIV gag IGFP unter Verwendung der Amax-Nukleofektions-Methode, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben, und lassen Sie die Zellen über Nacht regenerieren. Periphere mononukleäre Blutzellen werden aus Buffycoats von menschlichem Vollblut durch Zentrifugation über eine FICO-Dichtegradienten-Trennung gereinigt.

Die primären CD4-positiven T-Zellen werden aus peripheren mononukleären Blutzellen durch negative Selektion unter Verwendung eines CD4-positiven T-Zell-Isolationskits gereinigt. Die negativ selektierten CD4-positiven T-Zellen werden aus einer magnetischen Säule gesammelt und in unserem PMI mit 10 % FPS kultiviert, das mit 10 Einheiten pro Milliliter rekombinantem humanen IL-2 ergänzt ist. Alternativ können die isolierten primären CD4-positiven T-Zellen portioniert und mithilfe kryogener Gefrierverpackungen eingefroren werden. Die Gefrierverpackungen werden für mindestens drei bis vier Stunden in einen minus 70 Grad Celsius kalten Gefrierschrank gestellt.

Die Zellen werden anschließend zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt. Nachdem nun die Jerk-Kopfzellen transfiziert und die Ziel-primären CD4-positiven T-Zellen isoliert wurden, fahren Sie am Tag nach der Transfektion mit der Reinigung und Markierung der Zellen fort. Die Jerk-Zellen exprimieren nun den infektiösen, fluoreszierenden HIV-Konstrukt.

Beim Umgang mit infektiösen Proben tragen wir einen vorn schließenden Laborkittel und zwei Paar Handschuhe. Entfernen Sie die zellulären Bestandteile aus den transfizierten Zellen durch Zentrifugation über ein Fial-High-Pack-Dichtheitsmedium. Geben Sie zunächst 1,5 Milliliter Fial Pack auf den Boden eines 15-Milliliter-Kegelrohrs.

Danach vorsichtig das Gradientenmaterial mit den transfizierten Jerk-Hat-Zellen in einem Volumen von fünf Milliliter unseres PMI-Mediums überlagern. Zu diesem Zeitpunkt sind die transfizierten Jerk-Hat-Zellen in der Lage, infektiöses HIV zu produzieren. Daher müssen alle Pipettenspitzen, die mit den HIV-exprimierenden Zellen in Kontakt gekommen sind, mit einer 10%igen Bleichmittel-Lösung desinfiziert werden.

Bevor Sie die Probe in einen Behälter innerhalb des Sicherheitswerkschranks entsorgen, verschließen Sie das Gefäß und besprühen Sie die Außenseite des Rohrs mit einer 70 %igen Ethanol-Lösung. Wischen Sie es anschließend mit einem trockenen Kim-Wipe ab. Zentrifugieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 400 ×g und ausgeschaltetem Bremsmodus. Nach der Zentrifugation entfernen Sie vorsichtig die Zellen mithilfe einer Pipette von der Grenzfläche zwischen Medium und Fial und überführen Sie in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie die Zellen mit unserem PMI-Medium auf ein Gesamtvolumen von 15 Milliliter und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 ×g.

Bei Raumtemperatur suspendieren wir das Pellet in drei Milliliter Jerk-Hat-Kulturmedium und überführen es in eine Zweizentimeter-Vertiefung einer sechswelligen Platte. Stellen Sie die Platte in den Gewebekultur-Inkubator, bis sie am folgenden Tag verwendet wird. Am Abend desselben Tages beschriften Sie die primären CD4-positiven T-Zellen, die als Zielzellen verwendet werden, um sie von den Spenderzellen zu unterscheiden. Pelletieren Sie zunächst viermal 10⁶ der primären CD4-positiven T-Zellen durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 Minuten.

Waschen Sie die Zellen anschließend mit fünf Millilitern PBS und resuspendieren Sie sie in zwei Millilitern PBS. Geben Sie Cell Tracker Orange bis zu einer Endkonzentration von 1,5 µM hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für Minuten. Nach Beendigung der Inkubation fügen Sie acht Milliliter vollständiges Chica-Medium hinzu und zentrifugieren bei 400 ×g für 10 Minuten.

Suspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter komplettem Medium, das mit 10 Einheiten pro Milliliter IL-2 ergänzt wurde, und stellen Sie sie über Nacht in den Zellkultur-Inkubator. Nach der Übernacht-Inkubation sind die Donor- und Target-Zellen bereit für das Zelle-zu-Zelle-Transfer-Experiment. Bevor Sie das Zelle-zu-Zelle-Transfer-Experiment aufbauen, bereiten Sie die Bildgebungskammer vor, um die Plattform gegen Temperaturschwankungen im Raum abzupuffern.

Um das störende Umgebungslicht auszublenden, wird eine große schwarze Abdeckhaube über die gesamte Mikroskop-Heizanordnung gelegt, wodurch ein isolierter Luftspalt um das System entsteht. Die Abbildungskammer wird mithilfe einer thermostatischen Heizung bei einer stabilen Temperatur von 37 Grad Celsius gehalten, wobei eine T-Typ-Thermoelementspitze neben der Probe zur Temperaturüberwachung dient. Vor dem Einbringen der Probe 30 Minuten vorheizen.

Die Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie mit einem invertierten optischen Mikroskop wird verwendet, um 3D-Konfokalaufnahmen des Zell-zu-Zell-Transfers von HIV zu erstellen. Alle Hardwarekomponenten und die Bildaufnahme, einschließlich einer Z-Ebene, werden über die Software Andor IQ, Version 1.8, gesteuert. Die Abtastung erfolgt mit einer CSU-10-Spinning-Disk-Konfokaleinheit, die gleichzeitig mehr als 800 konfokale Punkte nutzt, um die Abtastrate erheblich zu erhöhen und so ihre Geschwindigkeit zu ergänzen. Die CSU-10 ist mit einer hochsensiblen elektronenvervielfachenden CCD-Kamera gekoppelt, die eine schnelle Aufnahme bei schwachem Licht ermöglicht und dadurch sowohl Photobleichen als auch Phototoxizität verringert.

Die Fluoreszenzlichtquelle ist ein mehrwellenlängiger Argon-Krypton-Ionengaslaser. Ein optischer, tunabler Filter vom Typ And- oder Oko-A-OTF (AOTF) wird verwendet, um die gewünschten Wellenlängen auszuwählen – hier 488 Nanometer und 568 Nanometer – und gleichzeitig deren Leistung zu steuern, um die Photobleiche weiter zu reduzieren und die Aufnahmezeit zu verlängern. Der AOTF blockiert den Laser rasch nach jeder 15- bis 30-Millisekunden-Belichtung, wenn die Kamera keine Bilder aufnimmt, wodurch unnötige Belichtung vermieden wird, während die Bilder von der E-M-C-C-D-Kamera auf den Computer übertragen werden.

Das Laserlicht wird mithilfe eines 405/488/568/647-Vielbanddichroischen Spiegels in das Drehscheibensystem eingekoppelt. Die fluoreszente Emission wird nach Wellenlängen mittels eines 560-Nanometer-Longpass-Dichroischen Spiegels mit einem Bildteiler getrennt. Der grüne Kanal wird durch einen 525/50-Nanometer-Bandpassfilter und der rote Kanal durch einen 609/54-Nanometer-Bandpassfilter gefiltert. Die beiden Kanäle werden nebeneinander auf die E-M-CCD-Kamera projiziert.

Während die Abbildungskammer aufwärmt, bereiten Sie die Zellen für das Zelle-zu-Zelle-Transfer-Experiment vor. Zählen Sie die HIV-gag-IGFP-exprimierenden Ette-Zellen mit einem Hämozytometer. Stellen Sie das Hämozytometer in eine Petrischale, um eine direkte Exposition gegenüber den virusexprimierenden Zellen zu vermeiden.

Die Zellen mit CO2-unabhängigen Medien waschen und in Live-Cell-Imaging-Medien mit einer Konzentration von ein bis drei mal 107 Zellen pro Milliliter resuspendieren. Die Verwendung von CO2-unabhängigen Medien macht eine CO2-Umkammerung überflüssig. Zum Abbilden.

Die Zellen zählen, waschen und resuspendieren außerdem die markierten primären CD4-positiven T-Zellen, wie zuvor für die Jurkat-Zellen gezeigt. Als Nächstes initiieren Sie die Zell-zu-Zell-Übertragung, indem Sie 20 µL HIV-gag-I-GFP-transfizierter Jurkat-Zellen mit 40 µL markierten primären CD4-positiven T-Zellen mischen und 50 µL in eine zellkulturgeeignete, gasdurchlässige EBD-Mikrokammer geben. Versiegeln Sie die Kammer mit Stopfen und sichern Sie diese, indem Sie die Kontaktstelle zwischen Stopfen und EBD-Kammer mit Parafilm umwickeln.

Reinigen Sie die Bildgebungskammer mit einem mit 70 % Ethanol getränkten Chemiewisch und lassen Sie sie kurz in der Abzugshaube an der Luft trocknen. Transportieren Sie die verschlossene Bildgebungskammer in einem geschlossenen Behälter, um unbeabsichtigte Expositionen zu vermeiden. Falls die Kammer nach dem Beladen der IBD-Bildgebungskammer mit Zellen während des Transports fallen gelassen wird, befestigen Sie das Gerät unmittelbar am Mikroskop.

Nehmen Sie Bilder von Zellpaaren mit einem 60x/1,42-NA-Ölimmersionsobjektiv auf, da die hohe numerische Apertur die Auflösung erheblich verbessert und somit die Geschwindigkeit der Aufnahme pro 3D-Bildstapel maximiert. Beschneiden Sie den Aufnahmebereich der Kamera des EM-CD auf den unmittelbaren Bereich eines Zellpaares. Außerdem kann ein großer Z-Schritt zwischen 0,45 und 0,75 Mikrometern die Aufnahmegeschwindigkeit unter diesen Bedingungen ebenfalls erhöhen.

Die Aufnahmen werden kontinuierlich im Abstand von 20 bis 60 Minuten durchgeführt. Bei geeigneter Durchführung kann die wiederholte Abbildung derselben Probenstelle bis zu sechs Stunden dauern, wobei eine minimale Photo-Bleaching-Effekte auftreten. Jedes Datensegment besteht aus mehreren zehntausend Bildern, die insgesamt fünf bis 20 Gigabyte Speicherplatz belegen können.

Um den Transport und die Analyse der großen Dateien zu erleichtern, wird jede Datei in Segmente von jeweils einem Gigabyte aufgeteilt und als TIFF-Bilddatei exportiert. Zur Analyse der aufgenommenen Bilder verwenden Sie eines von mehreren Bildanalyse-Softwareprogrammen. Weitere Einzelheiten zur Bildanalyse, einschließlich der Korrektur der Intensitätsverarmung sowie der automatischen und manuellen Verfolgung von gag-Punkten, finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll.

Innerhalb von 10 bis 15 Minuten nach dem Mischen können HIV-gag-IGFP-exprimierende Jerk-Katzenzellen beobachtet werden, die an primären CD4-positiven T-Zellen haften. Anhand dieser Konjugate lässt sich die Bewegung von gag-Punkten in infizierten Zellen sowie in Zielzellen analysieren. Nach der Synapse, innerhalb von 30 Minuten bis drei Stunden, kann man die Bewegung von gag-IGFP-Punkten in Zielzellen beobachten, die mit einem Zelltracer markiert sind.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie die Zell-zu-Zell-Übertragung von HIV zwischen T-Zellen sichtbar gemacht werden kann. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es sehr wichtig, alle Vorsichtsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe 2 plus oder der Biosicherheitsstufe 3 einzuhalten, wenn Proben bearbeitet werden, die mit HIV-exprimierenden Zellen in Kontakt gekommen sind. Denken Sie außerdem daran, gut gepflegte JCA-Zellen und endotoxinfreie DNA zu verwenden, um die Transfektion zu optimieren.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.