Name: Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-04T17:32:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie durch intravenöse Mikroinjektion von Gentamicin ein akutes Nierenversagen bei Zebrabärbling-Larven induzieren. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Nierenschäden mittels Immunhistochemie.

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Diese Arbeit wurde von der US National Institutes of Health (NIH) gewährt R01DK069403 und P30DK079307 finanziert.

Ein Teil der folgenden Protokoll basiert auf den veröffentlichten Methoden (Hentschel et al. 2005) und (Weinstein et al. 1995) mit leichten Modifikationen berichtet wurden. Teil 1: Mikroinjektionen Richten Sie im Voraus für die Mikroinjektion <ul><li> Die Fische werden an 2 Tagen nach der Befruchtung (dpf) injiziert. Daher sind erwachsene Zebrafisch 3 Nächte vor einer geplanten Experiment gezüchtet. Sammeln Embryonen und legen Sie sie in einer Petrischale mit Wasser E3 (5mm NaCl, 0,17 mm KCL, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4) bei 28,5 ° C. Am Ende des ersten Tages entfernen abgestorbene Embryonen aus der Petrischale und getrennte Embryonen, so dass es 8-10 Embryonen pro Petrischale sind. </li><li> Bereiten Sie die Glasnadeln Ziehen von Kapillaren (4 cm in der Länge, 0,63 / 0,20 OD / ID Millimeter (mm) R-6 Benutzerdefinierte Rohrglas Drummond Scientific Company, Broomall, PA 9-000-3000) mit einer Elektrode Abzieher. Die Spitze Durchmesser sollte von 10-20 mu m liegen. Unter einem Binokular (Leica S6E), mit einem Permanent-Marker ziehen etwa 10 1mm Linien entlang der Nadel, mit der Hilfe eines Herrschers, und speichern Sie die Nadeln in einer großen Petrischale auf Ton Rampen. </li><li> Bereiten Sie die Haltepipette: Fire-polish der Spitze eines dünnwandigen Borosilikatglas Kapillarrohr (152 mm, 1 / 0,75 OD / ID mm TW100-6, World Precision Instruments, Inc.) in einer Bunsenbrennerflamme, bis der innere Durchmesser die Spitze ist 0,4-0,5 mm. Solche Dimension ermöglicht eine gute Griffigkeit der Dottersack eines 2 dpf Zebrafisch-Larven. Halten Sie das eine Ende eines Stückes Glaskapillare mit langen Zangen und Wärme das Gegenteil Spitze mit der Kapillare mit dem Bunsenbrenner, indem sie senkrecht über dem hellblauen Innenkonus der Flamme, die heißesten, für 1-2 Sekunden, Rollen sie zur Erlangung einer sogar schmelzen. Wiederholen Sie dies einige Male untersuchen Sie anschließend die Kapillare unter dem Mikroskop, auf einer Bühne Mikrometer (Ward 94 W 9910). Dies ist ein kritischer Schritt, könnte es notwendig sein, Feuer-polish ein paar Holding Pipetten und wählen Sie die entsprechende Größe später, während Sie die Manipulation der Larven. Wenn Sie vorsichtig sind, dauert eine Haltepipette für mehrere Mikroinjektion Sitzungen. </li><li> Füllen Sie das Handbuch Mikroliterspritze Pump (MMP, World Precision Instruments, Inc.,) mit Mineralöl, nach den Anweisungen des Herstellers. Der Pipettenhalter ist in einem Joystick Manipulator (Narishige, MN-151), mit einem magnetischen Standfuß (Narishige, MN 151) auf einer Eisenplatte (Narishige, IP) verbunden eingefügt. </li></ul> Mikroinjektion <ul><li> Bereiten 20 &amp;mgr; l der Injektion Mischung:. 2.4μl Gentamicin (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml in Kochsalzlösung) und 17.6μl 10-kDa Lucifer Yellow Dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml in Kochsalzlösung) In der Kontrollgruppe Fisch die Gentamicin ist mit Kochsalzlösung ersetzt. Die fluoreszierenden Dextran (viele verschiedene Farben verwendet werden kann) ist ausreichend, um die Genauigkeit der Injektion zu überprüfen und wählen Larven, die mit dem nephrotoxicant injiziert wurden. </li><li> Werden 2 30mm Petrischalen mit 2 ml Mineralöl für die Platzierung der Injektion Mischung und Kontrolle Mischung unter, um ein Verdampfen der Lösungen zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie die Narkose: 400 mg Tricaine Pulver (Ethyl-m-Aminobenzoesäure Methansulfonat SIGMA A-5040) 97,7 ml DD-Wasser, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Passen Sie auf pH 7. Bewahren Sie diese Stammlösung in die Tiefkühltruhe, in Aliquots von 4,2 ml. Zur Nutzung Tricaine als Anästhetikum verdünnen 4,2 ml Tricaine Stammlösung in 100 ml Wasser E3 (Westerfield 1993) und lassen bei Raumtemperatur. </li></ul> Die folgenden Schritte sind unter einem Binokular durchgeführt <ul><li> Entfernen Sie alle verbleibenden Chorion mit feinen Pinzetten und betäuben das Zebrafisch-Übertragung sie in einer Petrischale mit Tricaine erwärmt bei Raumtemperatur. Zebrafische sollten Tricaine mindestens 15 Minuten vor Beginn der microinjections ausgesetzt werden. </li><li> Öffnen Sie die Spitze der Injektionsnadel mit einer Rasierklinge (VWR Scientific 55411-050). Halten Sie die Klinge in einem leichten Winkel zu einer Fase erstellen und schneiden Sie die Spitze wie ein Trinkgeld Öffnung von ca. 10-20 um Durchmesser zu erhalten. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung, Vakuum-und Luftversorgung der Mikroinjektion Geräten (World Precision Instruments Inc., PV820 pneumatische picopump). Legen Sie die Nadel in den Nadelhalter am Mikromanipulator und Kippen Basis (Word Precision Instruments, Inc., Model M3301R, TB-1) montiert. </li><li> Zum Füllen der Kanüle einen Tropfen (10 &amp;mgr; l) der Lösung in der 30mm-Petrischale mit Mineralöl (Fisher Chemicals, 0121-1) gefüllt injiziert werden. Drehen Sie den manuellen Mikromanipulator so tauchen die Spitze der Nadel in den Tropfen Lösung, stellen Sie die picopump "hold / vent"-Schalter auf "vent" ("vent" entspricht auf der PV820 Vakuum), und füllen Sie die Nadel durch Ziehen Lösung in der Nadelspitze. Das dauert ein paar Minuten, wenn die Lösung wird in die Nadel zu schnell,das bedeutet, dass der Durchmesser der Spitze zu groß ist, und die Injektionen nicht genau. Nachdem die Nadel gefüllt ist, stellen Sie die picopump auf "hold" ("hold" entspricht auf der PV820 injizieren). </li><li> Zur Kalibrierung der Nadel, setzen Sie die picopump "gated / timed"-Schalter auf "gated", drücken Sie das Fußpedal, um die Nadel Entlastung, und notieren Sie die Zeit, die (in Sekunden) für den Meniskus, um von einer Markierung zur nächsten (1 Reise mm Gesamtlänge). Wiederholen Sie die 3-fache, nehmen Sie die durchschnittliche Zeit (in Sekunden), und teilen Sie den Wert von 30 (Volumen in Nanoliter (nl) entsprechend 1 mm Luftlinie), um die Anzahl der Millisekunden benötigt, um 1 nl Lösung liefern zu bestimmen. Stellen Sie den Bereich Zeit-Knopf, um diese Zahl, und verschieben Sie die "gated / timed"-Schalter auf "getimte". Nun ist die picopump ist auf einen 1NL Puls der Lösung zu liefern. </li><li> Entfernen Sie die Mineralöl-Schüssel und die Position der Petrischale mit den Larven unter dem Mikroskop. Gruppe der Fisch in der Mitte der Petrischale und Fokus. </li><li> Legen Sie die Haltepipette im Handbuch Mikrospritze Pumpe (MMP, World Precision Instruments) auf der gegenüberliegenden Seite des Mikroinjektor verschaffen, ihre Spitze auf die Petrischale, und in die Fokusebene des Mikroskops. Bend it mit einem ziemlich flachen Winkel, so dass die Spitze der Haltepipette berührt den Boden der Petrischale und liegt in der Nähe horizontal. Stellen Sie sicher, keiner Luftblase im System haben, was die Reaktionszeit verlangsamen und verringern die Genauigkeit der MMP. </li><li> Wechseln Sie zu einem höheren Vergrößerung unter dem Mikroskop und mit einem superfeinen Wimpern mit Griff (Ted Pella 113) auf die Fischlarven Dorsalseite Position nach unten mit dem Eigelb sehr auf die Haltepipette schließen. Halten Sie die Fischlarven durch Saugen das Eigelb in die Haltepipette durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn die Mikrometerschraube Steuerung des manuellen Mikrospritze Pumpe. Achten Sie darauf, nicht auf den Mikrometer zu weit drehen, wie das Eigelb kann platzen, wenn gezogen zu tief in die Haltepipette. Konzentrieren Sie sich auf die Bildung von gemeinsamen Cardinalvene, die über den Dotter, direkt unterhalb des Periderm liegt und die Website von sehr hoher Durchblutung. Mit dem Mikromanipulator des Injektionsgeräts, führen Sie die Nadel in die Entwicklung gemeinsamer Cardinalvene. Es ist in der Regel notwendig, um die Nadel zurück ziehen ein wenig nach dem Einsetzen, wie die gemeinsame Cardinalvene ist sehr oberflächlich. Inject 1NL der Lösung, indem Sie das Fußpedal, dann die Larven aus den Haltepipette und senden es an Embryos Wasser. Dies ist ein kritischer Schritt, vor allem das erste Mal, weil es eine gewisse Übung in der Positionierung der Fische und die Steuerung der Saug-und Druckseite des Rigs benötigt. Wenn das Eigelb des Embryos ist richtig mit dem Haltepipette gehalten wird, wird er nicht wälzen, wenn die Nadel eindringt. </li><li> Um zu überprüfen, den Erfolg der Mikroinjektion, überwachen die Anwesenheit des Lucifer Yellow Dextran im Herzen der Zebrafische können unter einem Fluoreszenzmikroskop. Der Luzifer-Gelb bleibt sichtbar in das Herz für ca. 20 Minuten vor dem Ableiten in das Kreislaufsystem Wenn die nephrotoxischen Lösung ist richtig, innerhalb von 2 Stunden nach der Injektion injiziert werden Sie sehen sehr wenig Lucifer Yellow Dextran übrigen an der Injektionsstelle. Wenn die Lösung in den Dottersack, ein Ort von Lucifer Yellow Dextran injiziert wird, wird an der Injektionsstelle zu bleiben. (Abb. 1). Bringen Sie den Fisch auf E3 Medium. </li><li> Zwei Tage nach der Injektion, entwickeln sich die Larven pericardial Ödemen als Folge einer verminderten Nierenfunktion (Abb. 2). </li></ul> Teil 2: Fixierung und Immunfluoreszenz mit Na + / K +-ATPase-Antikörper (α-6F) <ul><li> Bei 4 dpf, zwischen 10 und 15 Larven Zebrafisch in 4ml Glasfläschchen (Weathon, 225012) setzen und befestigen Sie sie in 1ml Dent (80% MeOH 20% DMSO) für 4 Stunden bei RT. </li><li> Rehydrieren die Embryonen in einer abgestuften MeOH / PBT (PBS mit 0,5% Tween20) Serie, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, Pipettieren der Lösung aus und fügen neue Lösung für das gleiche Fläschchen (1 ml Lösung pro Durchstechflasche), 20 Minuten in jeder Lösung. Larven sollten nie der Luft ausgesetzt sein, lassen Sie ein wenig Lösung für die Larven beim Wechsel Lösungen. </li><li> Entfernen PBT und ersetzen 1ml mit Blocking-Lösung (PBS mit 1% DMSO, 0,5% Tween20, 10% normalem Ziegenserum) für 3 Stunden bei 4 ° C auf einem Kolbenpendel. </li><li> Übertragen Sie die Larven in einem 2ml Mikrozentrifuge. Entfernen Blockierserum und ersetzen mit 300μl Primärantikörper in Inkubationslösung (PBS mit 1% DMSO, 0,5% Tween20, 2% normalem Ziegenserum) über Nacht bei 4 ° C auf einem Kolbenpendel. Wir verwenden einen monoklonalen Na + / K +-ATPase-Antikörper (α-6F, Überstand, Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa) am 01.25 Verdünnung </li><li> Entfernen Sie den primären Antikörper und Waschen 3 x 30 Minuten mit Inkubationslösung bei RT. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper (Ziege anti-Maus-Cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) 1:500 verdünnt in Inkubationslösung für 2 Stunden beiRT. </li><li> Wash 3 x 30 Minuten mit PBT. </li></ul> Teil 3: Kunststoff-Einbettung mit JB-4 <ul><li> Entwässern Gewebe durch ein abgestuftes Ethanol-Reihe (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 Minuten pro Schritt. </li><li> Bereiten Sie die Infiltration Lösung: 25 ml JB-4 Embedding Lösung A (Polysciences 0226A) und 0.24g des Katalysators (Polysciences 02618). Es dauert eine Weile für den Katalysator zu lösen, etwa 20-30 Minuten. Die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu 1 Monat. </li><li> Dekantieren von der 100% Ethanol und ersetzen mit Kunststoff-Infiltration Lösung. Legen Sie die Fläschchen ein 4 ° C auf einem Rotator und ermöglichen Infiltration bis die Larven sinken auf den Boden der Glasflasche vor. Dieser Prozess dauert etwa 30 Minuten. </li><li> Embedding-Protokoll: Legen Sie die Kunststoffspritzerei Tassenrost (Polysciences, Inc. 16643A) unter einem Binokular. Übertragen Sie die Larven, zusammen mit Infiltration Lösung zu decken, in die Tassen. Die Kunststoff-Einbettung von Medien in einem kleinen Plastikschlauch vorbereitet. Wir normalerweise einbetten 4-5 Fische auf einmal, einen Fisch für jede Tasse. Bereiten Sie 5-6 ml der Einbettung Kunststoff (1,2 ml der Einbettung Lösung für jede Tasse) Zugabe von 35 ul von JB-4 Embedding-Lösung "B" (Polysciences Inc. 0226B) für jeden ml der Infiltration Lösung. Add 35 ul JB-4 Embedding-Lösung "B" (Polysciences Inc. 0226B) für jeden ml der Infiltration Lösung. Gut mischen, und Abpipettieren mit einer Kunststoff-Pasteurpipette mehrmals. Dies ist wichtig, denn wenn nicht gut gemischt die JB-4 wird nicht richtig polymerisieren. Nach 5ml der Einbettung Kunststoff hergestellt worden ist, zu entfernen Infiltration Kunststoff aus aller Proben mit einer Pasteurpipette. Füllen Sie den Becher mit Einbettung Kunststoff. Der Kunststoff muss Schlamm aus der Tasse, um eine gute Befestigung der Blockhalter auf die Probe zu gewährleisten. Um festzustellen, Zebrafisch Nierentubuli sind Querschnitte der beste. Zu diesem Zweck den Fisch vertikal eingebettet sind, mit gesenktem Kopf. Mit Hilfe der Wimper mit Griff oder feinen Pinzette, in regelmäßigen Abständen Position der Fische vertikal, bis der Kunststoff ist hart genug, dass sie nicht von ihrer Position zu bewegen. Es dauert etwa 20-30 Minuten. Legen Sie dann die EBH-2 Block Halter (Polysciences Inc. 15899) über die Tassen und lassen Sie das Fach bei 4 ° C über Nacht. Wenn die Polymerisation in abgeschlossen haben, können Sie Pop aus den Blöcken wie Eiswürfel. </li><li> Alternative Einbettung Protokoll für mehrere Larven: Fill Formen zur Hälfte mit kompletten JB-4 und lassen Sie es zu polymerisieren. Für die 15 mm im Quadrat Formen verwenden wir die JB-4 Volumen bei 700μl an der Form halber Strecke zu füllen. Anschließend fügen Sie den JB-4 getränkt Larven mit Härter zur vorpolymerisierte halb gefüllten Formen. Orient die Larven mit dem Kopf in Richtung des langen Seite der Form und Ausrichtung der Larven so die Augäpfel Line-Up (Sie können 10 Fische in einem Guss in eine Linie gestellt). Nach dem Block polymerisiert können Sie schneiden den Block Kanten, so drehen die Seite nach dem Messer und Sekundenkleber es zu einer plastischen "Chuck", die in das Mikrotom passt. Mit dieser Methode können Sie Position eine große Anzahl von Larven im gleichen Block, in der Kunststoff-zentriert, und bereit für Querschnitte. Ist darauf zu achten Ausrichtung der Block mit dem Messer, so dass entsprechende Abschnitte der einzelnen Fisch in einem einzigen Abschnitt getroffen werden. Dies kann beim Schneiden durch die Augen werden: dh Ausrichtung der Block, so dass entsprechende Abschnitte der Augen für jeden Fisch getroffen werden. Das Endergebnis ist, dass man viele Fische gleichzeitig zu analysieren auf einem einzigen Objektträger. </li></ul> Teil 4: Schnitte <ul><li> Stellen Sie die Probe in das Futter Inhaber des Mikrotoms (wir verwenden eine Shandon Finesse Thermo Electro Inc. Mikrotom) </li><li> Stellen Sie den Schiebeschalter wärmer bis 45 ° C. </li><li> Gießen DI-Wasser in ein Becherglas und stellen Sie es auf das Mikrotom in der Nähe </li><li> Vor Schneiden darauf, dass der Block wie orientiert sich an perfekten Querschnitt des Fisches zu erhalten. Die Orientierung Kopf Verstellhebel kann gedreht ermöglicht, die Probe Kopfhaltung genau auf das Messer sein. Fang an zu schneiden dicke Schnitte durch den Kopf des Fisches. Während Schnitte durch die Augen, orientieren den Block, so dass entsprechende Abschnitte der Augen sind für jeden Fisch entnommen. Wenn die Brustflossen in die Abschnitte angezeigt werden, ist, dass, wenn die pronephric Tubuli beginnen. Ab diesem Zeitpunkt etwa 32 4 um Abschnitte aus dem Block geschnitten. </li><li> Sammeln Sie die Abschnitte mit einer Pinzette und lassen Sie sie in das Becherglas mit Wasser löschen, ohne sie zu berühren das Wasser mit der Zange. Der Abschnitt wird so schnell expandieren, da sie die Oberfläche des Wassers trifft, jetzt können Sie es auf einer Folie zu sammeln. Legen Sie die Folie in das Wasser in einem 45 ° Winkel und nähern sich der Abschnitt mit Hilfe der Wimper mit Griff, berühren nur die Grenzen des Abschnitts. </li><li> Inkubieren Sie die Dias auf einer Folie wärmer, bis sie vollständig trocken sein. </li><li> Bildausschnitte mit epifluoreszenten oder konfokalen Mikroskopie. </li></ul> Teil 5: Repräsentative Resultate Wenn richtig ausgeführt, erscheinen injiziert Fische wie in Abbildung 1, mit wenig fluoreszierenden Dextran (in diesem Fall Lucifer Yellow) sichtbar in das Herz und in den Blutkreislauf. Wenn die Injektion zu tief ist, kann injizierten Materials gesehen konzentriert in den Dottersack, oder das Herz durchstochen verursacht starke Blutungen werden. Wenn die Haltepipette richtig gemacht wird, wird der Fisch nicht rollen oder zu verschieben, wenn sie injiziert, und dies wird eine genauere Injektion zu ermöglichen. Auch ist es wichtig, sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der MMP haben, was die Reaktionszeit verlangsamen und verringern die Genauigkeit des Systems. Im Allgemeinen als Folge der Gentamicin Nephrotoxizität, entwickeln 80% der injizierten Fische pericardial Ödem (Abb. 2). Wir verwenden einen Phänotyp Klassifikationssystem, in dem die Fische mit Ödeme evident pericardial Ödeme zeigen, aber keine anderen beobachtbaren Phänotyp, während stark ödematösen Fisch Perikarderguss und Rumpf Ödeme zeigen, mit leichten bis moderaten Achse Krümmung. Mit einem Nierenkanälchen Antikörper gegen Na + / K +-ATPase (α-6F) können wir die beschädigten Röhren in Querschnitten sichtbar zu machen, mit einem offensichtlichen Verlust von Zellpolarität und tubuläre Störung beschädigt Tubuli als die Kontrollen (Abb. 3) verglichen. Dieses Muster stimmt über mehrere Querschnitte. Um eine einwandfreie Querschnitte der Nierentubuli zu erhalten ist wichtig, um die Fische richtig zu positionieren während der Einbettung. Beim Vergleich Abschnitten werden Brustflossen und proximalen gewundenen Kanälchen als anatomische Marker verwendet. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Nephrotoxin Mikroinjektion. (A) Erfolgreiche Injektion eines 10kDa Dextran konjugiert lucifer gelb, mit schwachen Ausdruck in der gemeinsamen Cardinalvene, weißen Pfeil. (B) Falsche Injektion, was zu einer Anzahlung in Höhe von 10kDa Dextran konjugiert Lucifer Yellow, die nicht in das Kreislaufsystem, roter Pfeil verfliegt. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Gentamicin-vermittelte Ödem. (A) Control Larven Zebrafisch injiziert. Gentamicin injiziert Larven Zebrafisch mit (B) moderate oder (C) schwere Ödeme. Alle Larven sind bei 4 dpf mit anteriorer nach links und dorsal wird. Schwarze Pfeile zeigen auf pericardial Ödeme in B und C. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. AKI Immunhistochemie. α-6F Antikörper-Färbung für Na + / K +-ATPase 48 Stunden-post Gentamicin Injektion (4 dpf Larven) in Kontrolle (A, B) und Gentamicin injiziert (C, D) Larven. A, C bei 20-facher Vergrößerung und der B-und D sind 3X digitale Vergrößerungen des rechten Kanälchen in A und C. Hinweis Verlust der basolateralen Polarität und Tubulus Störung, weißen Pfeil in D im Vergleich zu B.

<ol><li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li>
<li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock%2C+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University Oregon Press. Oregon. (1993).</li>
</ol>

In diesem Video-Beitrag haben wir gezeigt, eine intravenöse Mikroinjektionstechnik für eine AKI-Modell, durch die Schaffung von Gentamicin vermittelten proximal tubuläre Schädigung in Zebrafisch-Larven. Dieser Schaden führt zur Bildung von Herzbeutel und / oder grober Ödeme, was die Unfähigkeit, Wasser zu regulieren. Wir beschrieben eine immunhistochemische Experiment mit einem Antikörper, differenziert Nierentubuli (Majumdar et al. 2000) markiert, zeigt Verlust der Zellpolarität und eine Störung des proximalen Tubulus in geschädigten Nieren. Intravenöse microinjections stellen eine effiziente Methode für die Bereitstellung einer löslichen Substanz in den Blutkreislauf des Zebrafisch-Larven. Diese Technik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Einführung einer Vielzahl von Stoffen und mit Hilfe eines fluoreszierenden Marker einheitliche Injektionen können ein Vielfaches so für konsistente Ergebnisse wiederholt werden.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;6F Maus monoklonaler Antikörper</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blockhalter EBH-2</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Borsilikatglas-Kapillaren</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-6</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarrohre R-6, kundenspezifisches Glasrohr</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3000</td><td></td></tr><tr><td>Katalysatorpulver</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618</td><td></td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>155-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10k Lucifer Yellow, lysinfixierbar</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Wimper</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8648</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen, 4 ml</td><td>Weathon</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>Eisenplatte</td><td>Narishige International</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Einbettungslösung A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Einbettungslösung B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B</td><td></td></tr><tr><td>Joystick-Mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Magnetständer</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Manuelle Mikrospritzpumpe</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsapparatur</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Shandon Finesse</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl, leicht</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenzieher</td><td>Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffformbehälter</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16643A</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerwärmer</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stufenmikrometer</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Kippvorrichtung</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TB 1</td><td></td></tr><tr><td>Tricain-Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td>Zerlegungsmikroskop</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr></tbody></table>

intravenöse mikroinjektionen mit zebrabärblingembryonen zu acute kidney injury study

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In diesem Video-Artikel beschreiben wir ein Zebrafisch-Modell der AKI mit Gentamicin als nephrotoxicant. Die Technik besteht aus intravenösen microinjections auf 2 dpf Zebrafisch. Diese Technik stellt eine effiziente und schnelle Methode, um lösliche Stoffe in die Blutbahn des Zebrafisch-Larven liefern, so dass für die Injektion von 15-20 Fische pro Stunde. Neben AKI Studien kann diese Mikroinjektionstechnik auch für andere Arten von experimentellen Studien, wie der Angiographie verwendet werden. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll der Technik von Geräten benötigt, um visuelle Maßnahmen verringerte Nierenfunktion. Darüber hinaus haben wir auch zeigen, den Prozess der Fixierung, whole mount Immunhistochemie mit einem Nierenkanälchen Marker-, Kunststoff-Einbettung und Schneiden der Larven Zebrafisch. Wir zeigen, dass Zebrafischlarven mit Gentamicin injiziert zeigen morphologischen Merkmalen im Einklang mit AKI: Ödeme, Verlust von Zellpolarität in proximalen tubulären Epithelzellen und morphologischen Störungen des Röhrchens.

Wir beschreiben eine Technik der Mikroinjektion der Aminoglykosid, Gentamicin, in 2 Tagen nach fetilization (dpf) Zebrafischlarven zu akutem Nierenversagen (AKI) zu induzieren. Wir beschreiben ein Verfahren zur whole mount Immunhistochemie, Kunststoff eingebettet und Schnitte mit Zebrabärblingembryonen der AKI-vermittelten Schaden zu visualisieren.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In diesem Videoartikel beschreiben wir ein Zebrafisch-Modell für eine akute Nierenschädigung (AKI) unter Verwendung von Gentamicin als Nephrotoxikum. Die Technik besteht aus intravenösen Mikroinjektionen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Modell einer akuten Nierenschädigung bei Zebrafischen mithilfe des AMG-Glykosids Gentamicin als Nephrotoxin zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Gentamicin in die gemeinsame Kardinalvene von zwei Tage nach der Befruchtung stammenden Zebrafischembryonen injiziert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die emus-Phänotypen bei vier Tage nach der Befruchtung stammenden injizierten Larven zu bewerten.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Zebrafische vier Tage nach der Befruchtung für die Immunhistochemie mit einem Antikörper gegen das Nierentubel-Epithel am zu bearbeiten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Einbetten und Schneiden der Zebrafische, Larven, und die Visualisierung geschädigter Tubuli aufgrund des Verlusts der Zellpolarität und der Störung der Tubulusstruktur. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die geschädigte Nierentubulusabschnitte mittels Immunhistochemie mit einem Niereneplithel-Antikörper zeigen.Hallo, ich bin Carala San Cosentino aus dem Neil Hari Labor der Abteilung für Entwicklungsbiologie an der Universität von Pittsburgh. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um das Aminoglykosid Gentamycin in zwei Tage nach der Befruchtung alte Zebrafischlarven mikroinjizieren. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um eine akute Nierenschädigung in Zebrafischlarven zu induzieren.Beginnen wir also. Züchten Sie adulten Zebrafische drei Nächte vor dem geplanten Experiment. Um Embryonen im Stadium zwei Tage nach der Befruchtung zu erhalten, bereiten Sie E3-Medium mit fünf Millimolar Natriumchlorid, 0,17 Millimolar Kaliumchlorid, 0,33 Millimolar Calciumchlorid, 0,33 Millimolar Magnesiumsulfat vor, sammeln Sie die Embryonen und geben Sie sie in eine Petrischale mit erwärmtem E3-Wasser in einen Inkubator bei 28,5 Grad Celsius.Entfernen Sie am Ende des ersten Tages alle toten Embryonen aus der Petrischale. Verteilen Sie die Embryonen auf mehrere Petrischalen mit jeweils 80 bis 100 Embryonen. Bereiten Sie Glasinjektionsnadeln vor, indem Sie Kapillarrohre mit einem Elektrodenzieher auf einen Enddurchmesser von etwa 10 bis 20 Mikron ziehen.Nach dem Ziehen die Kapillare unter ein Stereomikroskop legen und mit einem Lineal ungefähr zehn Markierungen im Abstand von je einem Millimeter entlang der Nadel mit einem Permanentstift anbringen. Die Nadeln in einer großen Petrischale auf Tonrampen lagern. Als Nächstes die Haltepipette durch Anflämmen vorbereiten.Polieren der Spitze einer dünnwandigen Borosilikatglas-Kapillare. Halten Sie die Glas-Kapillare mit einer langen Zange und erhitzen Sie die Spitze der Kapillare, indem Sie sie für ein bis zwei Sekunden senkrecht über den hellblauen inneren Kegel der Flamme halten. Drehen Sie die Kapillare, um eine gleichmäßige Schmelze zu erzielen.Wiederholen Sie dies mehrmals, dann untersuchen Sie die Kapillare unter dem Objektmikrometer. Der Durchmesser der Kapillare sollte zwischen 0,4 und 0,5 Millimetern liegen. Nachdem die Kapillaren und Halter vorbereitet wurden, füllen Sie die manuelle Mikrospritzpumpe gemäß den Herstelleranweisungen mit Mineralöl.Setzen Sie den Pipettenhalter in einen Joystick-Manipulator ein, der über einen Magnethalter mit einer Eisenplatte verbunden ist. Bereiten Sie 20 Mikroliter der nephrotoxischen Injektionsmischung vor. 2,4 Nanoliter Gentamicin und 17,6 Nanoliter Lucifer Yellow Dextran in der Kontroll-rva.Das Gentamicin wird durch Kochsalzlösung ersetzt. Bereiten Sie zwei 30-Millimeter-Petri-Schalen mit jeweils zwei Millilitern Mineralöl in der Nähe des Injektionsmikroskops vor, um die nephrotoxische und die Kontrollmischung vor der Injektion abzulegen. Bereiten Sie das Anästhetikum vor, indem Sie 400 Milligramm Trica-Pulver in 97,7 Millilitern zweifach destilliertem Wasser und 2,1 Millilitern einmolarer Trisslösung lösen und auf pH 7 einstellen.Bewahren Sie diese Stammlösung im Gefrierschrank in Eloqua von 4,2 Milliliter auf. Um Trica als Anästhetikum zu verwenden, verdünnen Sie die 4,2-Milliliter-Trica-Stammlösung in 100 Milliliter E drei und lassen Sie sie bei Raumtemperatur stehen, um Larven für die Injektion unter einem Stereomikroskop vorzubereiten; entfernen Sie manuell die Coons mit feinen Pinzetten. Betäuben Sie die Zebrafischembryonen, indem Sie sie in eine Petrischale mit bei Raumtemperatur erwärmtem Trica überführen.Zebrafischembryos sollten mindestens 15 Minuten lang Trica ausgesetzt werden. Öffnen Sie vor Beginn der Mikroinjektionen die Spitze der Injektionsnadel mit einem Rasiermesser. Halten Sie die Klinge unter leichtem Winkel, um eine Schräge zu erzeugen, und schneiden Sie die Spitze so ab, dass eine Öffnung von etwa 10 bis 20 Mikrometern Durchmesser entsteht.Schalten Sie die Strom- und Luftzufuhr für die Mikroinjektionsapparatur ein. Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein. Füllen Sie die Nadel, indem Sie einen 10 µL-Tropfen der Injektionslösung in die mit Öl gefüllte Petrischale geben.Unter dem Mikroskop die manuelle Piko-Pumpe einschalten und die Nadelspitze unter die Flüssigkeitsoberfläche bringen. Die Piko-Pumpe auf Vent stellen, um die Nadel im Tropfen zu füllen. Dieser Vorgang dauert einige Minuten.Wenn sich die Lösung zu schnell in die Nadel hineinbewegt, ist der Durchmesser der Spitze zu groß und die Injektionen werden nicht genau sein. Nachdem die Nadel gefüllt wurde, stellen Sie die Piko-Pumpe auf Halteposition, um die Nadel zu kalibrieren, und schalten Sie den Piko-Pumpenschalter auf „gated“. Drücken Sie das Fußpedal, um die Nadel zu entladen, und notieren Sie die Zeit in Sekunden, die der Meniskus benötigt, um von einer Millimetermarkierung zur nächsten zu wandern. Wiederholen Sie dies dreimal, teilen Sie die durchschnittliche Zeit durch 30 – dies entspricht dem Volumen in Nanolitern, das einer linearen Strecke von einem Millimeter entspricht – und ermitteln Sie so die Anzahl der Millisekunden, die erforderlich sind, um ein Nanoliter Lösung abzugeben.Stellen Sie den Bereichsperiodenregler auf diese Zahl ein und schalten Sie den getakteten Zeitumschalter auf „timed“. Nun ist die Peal-Pumpe so eingestellt, dass sie einen Ein-Nanoliter-Tropfen der Lösung abgibt. Platzieren Sie als Nächstes die Petrischale mit den Larven unter dem Mikroskop.Gruppieren Sie die Larven in der Mitte der Petrischale und stellen Sie das Mikroskop scharf. Platzieren Sie die Haltepipette in der manuellen Mikrospritzenpumpe auf der gegenüberliegenden Seite des Mikroinjektors und führen Sie deren Spitze in die Petrischale in die Fokusebene des Mikroskops ein. Biegen Sie sie mit einem ziemlich flachen Winkel so, dass die äußerste Spitze der Haltepipette den Boden der Petrischale berührt und nahezu horizontal ausgerichtet ist.Wechseln Sie zu einer höheren Vergr&ouml;&szlig;erung am Mikroskop und verwenden Sie einen superfeinen Wimpernhaken mit Griff. Positionieren Sie den Larvenzebrafisch mit der dorsalen Seite nach unten, sodass der Dott nahe der Haltepipette liegt. Drehen Sie den Mikrometertreibzug, der die manuelle Mikrospritzenpumpe steuert, gegen den Uhrzeigersinn, um den Larvenzebrafisch zu fixieren, indem Sie den Dott in die Haltepipette ansaugen.Achten Sie darauf, den Mikrometer nicht zu weit zu drehen, da das Eigelb platzen kann. Wenn es zu tief in die Haltepipette gezogen wird, fokussieren Sie auf die sich bildende gemeinsame Kardinalvene, die über dem Eigelb direkt unterhalb des Periderms liegt und eine Region mit hohem Blutfluss darstellt. Mit dem Mikromanipulator der Injektionsvorrichtung.Führen Sie die Nadel in die sich entwickelnde gemeinsame Kardinalvene ein. Nach der Einführung muss die Nadel in der Regel etwas zurückgezogen werden, da die gemeinsame Kardinalvene sehr oberflächlich liegt. Wenn der Dott des Larvenstücks mit der Haltepipette richtig gehalten wird, rollt es nicht, während die Nadel eindringt.Injizieren Sie ein Nanoliter Lösung, indem Sie das Fußpedal betätigen. Danach lösen Sie die Larven aus der Haltepipette und führen sie ins Larvenwasser zurück. Um den Erfolg der Mikroinjektion zu überprüfen, überwachen Sie das Vorhandensein von Lucifer Yellow Dextran im Herzen der Zebrafischlarven.Unter einem Fluoreszenzmikroskop bleibt Lucifer Yellow im Kreislaufsystem etwa 20 Minuten lang sichtbar; kehren Sie die Larven vier Tage nach der Befruchtung in frisches E3-Medium zurück. Geben Sie zwischen 10 und 15 Zebrafischlarven in 4-Milliliter-Glasfläschchen und fixieren Sie sie vier Stunden bei Raumtemperatur in einem Milliliter Dent's Lösung. Rehydrieren Sie die Larven in einer abgestuften Methanol-P-B-T-P-B-S-Lösung mit 0,5 %, von 20 über 75 zu 25, 50 zu 50, 25 zu 75, bis 100 % PBT, wobei Sie die Lösung abpipettieren und eine neue Lösung zum selben Fläschchen hinzufügen.Ein Milliliter Lösung pro Gefäß. 20 Minuten in jeder Lösung. Die Larven dürfen niemals Luft ausgesetzt werden.Stets etwas Lösung über den Larven belassen. Beim Wechseln der Lösungen das PBT entfernen und durch ein Milliliter Blockierungslösung PBS mit 1 % DMSO und 0,5 % zwischen 20 und 10 % normalem Ziehenserum für drei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Mutaschüttler ersetzen. Die Larven in ein zwei-Milliliter-Eppendorf-Gefäß überführen.Entfernen Sie das blockierende Serum und ersetzen Sie es durch 300 Mikroliter Primärantikörper. Ein monoklonaler Natrium-Kalium-Antikörper bei TPS in einer Verdünnung von 1:25, Alpha-sechs-F-Supernatant, und 300 Mikroliter Inkubationslösung PBS mit 1 % DMSO, 0,5 % Tween 22 und 2 % normalem Zieuserserum über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Mutaschüttler. Entfernen Sie den Primärantikörper und waschen Sie dreimal je 30 Minuten mit je einem Milliliter Inkubationslösung bei Raumtemperatur, wobei jede Waschung auf einem Mutaschüttler erfolgt.Dann inkubieren Sie mit sekundärem Antikörper, der im Inkubationspuffer im Verhältnis 1:500 verdünnt ist, zwei Stunden bei Raumtemperatur. Danach waschen Sie dreimal für jeweils 30 Minuten mit PBT, dehydrieren die Larven anschließend durch eine abgestufte Ethanolreihe, wobei jede Stufe 10 Minuten dauert. Bereiten Sie die Infiltrationslösung vor, indem Sie 25 Milliliter JB-4-Einbettungslösung A und 0,24 Gramm Katalysator verwenden und 20 bis 30 Minuten auflösen. Die Lösung kann bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden.Entfernen Sie das 100 % Ethanol und ersetzen Sie es durch Plastikinfiltrationslösung. Stellen Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius auf einen Rotator und lassen Sie die Infiltration etwa 30 Minuten lang andauern, bis die Larven auf den Boden des Röhrchens sinken. Um die Larven einzubetten, stellen Sie die Kunststoffformierschalen unter ein Stereomikroskop.Überführen Sie die Larven zusammen mit ausreichend Infiltrationslösung, um die Larven in den Bechern zu bedecken. Das plastische Einbettungsmaterial wird in einem kleinen Plastikröhrchen vorbereitet. Normalerweise betten wir vier bis fünf Larven gleichzeitig ein, wobei eine Larve pro Becher verwendet wird, und bereiten fünf Milliliter Einbettungskunststoff vor.Fügen Sie 35 µL JB vier, Einbettlösung B, zu jedem Milliliter Infiltrationslösung hinzu und mischen Sie die Lösung mehrmals gründlich durch Auf- und Abpipettieren mit einer Plastikpipette oder Pasteurpipette, um sicherzustellen, dass JB vier ordnungsgemäß polymerisiert. Nachdem fünf Milliliter Einbettkunststoff vorbereitet wurden, entfernen Sie die Infiltrationslösung mit einer Pasteurpipette von den runden Proben. Füllen Sie die Mulde mit Einbettkunststoff; der Kunststoff muss aus der Mulde austreten, um eine gute Haftung des Blockhalters an der Probe sicherzustellen.Zur Detektion von Nierentubuli bei Zebrafischen eignen sich Querschnitte am besten für diesen Zweck. Die Larven müssen vertikal eingebettet werden, mit dem Kopf nach unten, wobei eine Wimper mit Griff oder feine Pinzette hilfreich ist.Positionieren Sie die Larven periodisch vertikal, bis der Kunststoff fest genug ist, sodass sie ihre Position nicht mehr verändern. Dies dauert etwa 20 bis 30 Minuten. Danach platzieren Sie den EVH-Zweiblockhalter über die Vertiefungen und lassen das Tablett über Nacht bei vier Grad Celsius stehen, bis die Polymerisation vollständig ist.Platzieren Sie die Probe in der Spannvorrichtung des Mikrotoms und stellen Sie den Objektträgerwärmer auf 45 Grad Celsius ein. Füllen Sie deionisiertes Wasser in ein Becherglas und stellen Sie es vor dem Schneiden in die Nähe des Mikrotoms. Achten Sie darauf, dass der Block so ausgerichtet ist, dass perfekte transversale Schnitte der Larven entstehen.Die Einstellhebel für die Kopforientierung können gedreht werden und die Hintergrundbeleuchtung bei der Positionierung der Probe. Schneiden Sie dicke Schnitte durch den Kopf. Orientieren Sie die Gewebeproben so, dass für jedes Larvenexemplar äquivalente Augenabschnitte entnommen werden.Wenn die Brustflossen in den Schnitten erscheinen, beginnen die Pronephrostubuli. Ab diesem Punkt schneiden Sie etwa 32 vier Mikrometer dicke Schnitte aus den Blocken. Sammeln Sie die Schnitte mit einer Pinzette und lassen Sie sie in das Becherglas mit Wasser fallen, ohne dass die Pinzette das Wasser berührt.Der Schnitt wird sich sofort ausdehnen, sobald er die Wasseroberfläche berührt. Nun können Sie ihn auf einem Objektträger auffangen. Führen Sie den Objektträger unter einem Winkel von 45 Grad ins Wasser ein und nähern Sie sich dem Schnitt mit Hilfe einer Wimper mit Griff, wobei Sie nur die Ränder des Schnitts berühren. Inkubieren Sie die Objektträger auf einer Warmluftplattform, bis sie vollständig trocken sind, und nehmen Sie die Schnitte mittels Epi-Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie auf.Wenn die Injektion korrekt durchgeführt wird, erscheint die injizierte Larve wie hier im oberen Bild gezeigt, wobei der fluoreszierende Luciferase-gelbe Dextran im Gefäßsystem der Larven sichtbar ist. Wenn die Injektion zu tief erfolgt, wie im unteren Bild dargestellt, kann das injizierte Material im Dottersack gesehen werden oder das Herz kann verletzt werden, was zu starkem Bluten führt. Die Larven entwickelten ein perikardiales Ödem als Folge der Gentamicin-Nephrotoxizität, wie hier zu sehen ist.Die Kontrolllarven oben zeigen kein Perikardödem. Nach Injektion von Gentamycin weisen jedoch 80 % der Zebrafischlarven ein mäßiges oder schweres Ödem auf, wie durch die Pfeile in den mittleren und unteren Bildern angezeigt. Wir verwenden ein phänotypbasiertes Klassifizierungssystem, bei dem Larven mit mäßigem Ödem ein deutliches Perikardödem aufweisen, jedoch keine weiteren beobachtbaren Phänotypen zeigen.Während schwere ödematöse Larven Perikard- und Rumpfödeme, fehlende Durchblutung des Rumpfes sowie eine leichte bis mäßige Krümmung des Zugangs zeigen, wird ein Nierentubulus-Antikörper gegen Natrium-Kalium-ATPase verwendet. Die geschädigten Tubuli werden in Querschnitten dargestellt, wobei in den Panel C und D ein deutlicher Verlust der Zellpolarität sowie eine tubuläre Disruption in den geschädigten Tubuli im Vergleich zu den Kontrollen in den Panel A und B erkennbar ist. Dieses Muster bleibt bei mehreren Querschnitten konsistent, wenn die Abschnitte verglichen werden. Faktorielle Flossen und proximale gewundene Tubuli dienen als anatomische Marker.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine akute Nierenschädigung bei Zebrafischembryonen induziert. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, Injektionsnadeln mit einem Durchmesser von 10–20 Mikrometern zu verwenden. Es kann notwendig sein, einige Haltepipetten nachzupolieren, um die geeigneten Spitzen zu erhalten; jedoch kann man diese anschließend weiterverwenden, da sie für mehrere Injektionsdurchgänge geeignet sind.Außerdem ist es wichtig sicherzustellen, dass keine Luftblase im Mikroserien-JA-Gerät vorhanden ist, da dies die Position des Systems verringern würde. Schließlich sollte der Fisch während der Einbettung vertikal positioniert werden, um einen perfekten transversalen Querschnitt des Nierentubulus zu erhalten. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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JoVE Journal

Biology

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