Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Modell einer akuten Nierenschädigung bei Zebrafischen mithilfe des AMG-Glykosids Gentamicin als Nephrotoxin zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Gentamicin in die gemeinsame Kardinalvene von zwei Tage nach der Befruchtung stammenden Zebrafischembryonen injiziert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die emus-Phänotypen bei vier Tage nach der Befruchtung stammenden injizierten Larven zu bewerten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Zebrafische vier Tage nach der Befruchtung für die Immunhistochemie mit einem Antikörper gegen das Nierentubel-Epithel am zu bearbeiten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Einbetten und Schneiden der Zebrafische, Larven, und die Visualisierung geschädigter Tubuli aufgrund des Verlusts der Zellpolarität und der Störung der Tubulusstruktur. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die geschädigte Nierentubulusabschnitte mittels Immunhistochemie mit einem Niereneplithel-Antikörper zeigen.

Hallo, ich bin Carala San Cosentino aus dem Neil Hari Labor der Abteilung für Entwicklungsbiologie an der Universität von Pittsburgh. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um das Aminoglykosid Gentamycin in zwei Tage nach der Befruchtung alte Zebrafischlarven mikroinjizieren. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um eine akute Nierenschädigung in Zebrafischlarven zu induzieren.

Beginnen wir also. Züchten Sie adulten Zebrafische drei Nächte vor dem geplanten Experiment. Um Embryonen im Stadium zwei Tage nach der Befruchtung zu erhalten, bereiten Sie E3-Medium mit fünf Millimolar Natriumchlorid, 0,17 Millimolar Kaliumchlorid, 0,33 Millimolar Calciumchlorid, 0,33 Millimolar Magnesiumsulfat vor, sammeln Sie die Embryonen und geben Sie sie in eine Petrischale mit erwärmtem E3-Wasser in einen Inkubator bei 28,5 Grad Celsius.

Entfernen Sie am Ende des ersten Tages alle toten Embryonen aus der Petrischale. Verteilen Sie die Embryonen auf mehrere Petrischalen mit jeweils 80 bis 100 Embryonen. Bereiten Sie Glasinjektionsnadeln vor, indem Sie Kapillarrohre mit einem Elektrodenzieher auf einen Enddurchmesser von etwa 10 bis 20 Mikron ziehen.

Nach dem Ziehen die Kapillare unter ein Stereomikroskop legen und mit einem Lineal ungefähr zehn Markierungen im Abstand von je einem Millimeter entlang der Nadel mit einem Permanentstift anbringen. Die Nadeln in einer großen Petrischale auf Tonrampen lagern. Als Nächstes die Haltepipette durch Anflämmen vorbereiten.

Polieren der Spitze einer dünnwandigen Borosilikatglas-Kapillare. Halten Sie die Glas-Kapillare mit einer langen Zange und erhitzen Sie die Spitze der Kapillare, indem Sie sie für ein bis zwei Sekunden senkrecht über den hellblauen inneren Kegel der Flamme halten. Drehen Sie die Kapillare, um eine gleichmäßige Schmelze zu erzielen.

Wiederholen Sie dies mehrmals, dann untersuchen Sie die Kapillare unter dem Objektmikrometer. Der Durchmesser der Kapillare sollte zwischen 0,4 und 0,5 Millimetern liegen. Nachdem die Kapillaren und Halter vorbereitet wurden, füllen Sie die manuelle Mikrospritzpumpe gemäß den Herstelleranweisungen mit Mineralöl.

Setzen Sie den Pipettenhalter in einen Joystick-Manipulator ein, der über einen Magnethalter mit einer Eisenplatte verbunden ist. Bereiten Sie 20 Mikroliter der nephrotoxischen Injektionsmischung vor. 2,4 Nanoliter Gentamicin und 17,6 Nanoliter Lucifer Yellow Dextran in der Kontroll-rva.

Das Gentamicin wird durch Kochsalzlösung ersetzt. Bereiten Sie zwei 30-Millimeter-Petri-Schalen mit jeweils zwei Millilitern Mineralöl in der Nähe des Injektionsmikroskops vor, um die nephrotoxische und die Kontrollmischung vor der Injektion abzulegen. Bereiten Sie das Anästhetikum vor, indem Sie 400 Milligramm Trica-Pulver in 97,7 Millilitern zweifach destilliertem Wasser und 2,1 Millilitern einmolarer Trisslösung lösen und auf pH 7 einstellen.

Bewahren Sie diese Stammlösung im Gefrierschrank in Eloqua von 4,2 Milliliter auf. Um Trica als Anästhetikum zu verwenden, verdünnen Sie die 4,2-Milliliter-Trica-Stammlösung in 100 Milliliter E drei und lassen Sie sie bei Raumtemperatur stehen, um Larven für die Injektion unter einem Stereomikroskop vorzubereiten; entfernen Sie manuell die Coons mit feinen Pinzetten. Betäuben Sie die Zebrafischembryonen, indem Sie sie in eine Petrischale mit bei Raumtemperatur erwärmtem Trica überführen.

Zebrafischembryos sollten mindestens 15 Minuten lang Trica ausgesetzt werden. Öffnen Sie vor Beginn der Mikroinjektionen die Spitze der Injektionsnadel mit einem Rasiermesser. Halten Sie die Klinge unter leichtem Winkel, um eine Schräge zu erzeugen, und schneiden Sie die Spitze so ab, dass eine Öffnung von etwa 10 bis 20 Mikrometern Durchmesser entsteht.

Schalten Sie die Strom- und Luftzufuhr für die Mikroinjektionsapparatur ein. Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein. Füllen Sie die Nadel, indem Sie einen 10 µL-Tropfen der Injektionslösung in die mit Öl gefüllte Petrischale geben.

Unter dem Mikroskop die manuelle Piko-Pumpe einschalten und die Nadelspitze unter die Flüssigkeitsoberfläche bringen. Die Piko-Pumpe auf Vent stellen, um die Nadel im Tropfen zu füllen. Dieser Vorgang dauert einige Minuten.

Wenn sich die Lösung zu schnell in die Nadel hineinbewegt, ist der Durchmesser der Spitze zu groß und die Injektionen werden nicht genau sein. Nachdem die Nadel gefüllt wurde, stellen Sie die Piko-Pumpe auf Halteposition, um die Nadel zu kalibrieren, und schalten Sie den Piko-Pumpenschalter auf „gated“. Drücken Sie das Fußpedal, um die Nadel zu entladen, und notieren Sie die Zeit in Sekunden, die der Meniskus benötigt, um von einer Millimetermarkierung zur nächsten zu wandern. Wiederholen Sie dies dreimal, teilen Sie die durchschnittliche Zeit durch 30 – dies entspricht dem Volumen in Nanolitern, das einer linearen Strecke von einem Millimeter entspricht – und ermitteln Sie so die Anzahl der Millisekunden, die erforderlich sind, um ein Nanoliter Lösung abzugeben.

Stellen Sie den Bereichsperiodenregler auf diese Zahl ein und schalten Sie den getakteten Zeitumschalter auf „timed“. Nun ist die Peal-Pumpe so eingestellt, dass sie einen Ein-Nanoliter-Tropfen der Lösung abgibt. Platzieren Sie als Nächstes die Petrischale mit den Larven unter dem Mikroskop.

Gruppieren Sie die Larven in der Mitte der Petrischale und stellen Sie das Mikroskop scharf. Platzieren Sie die Haltepipette in der manuellen Mikrospritzenpumpe auf der gegenüberliegenden Seite des Mikroinjektors und führen Sie deren Spitze in die Petrischale in die Fokusebene des Mikroskops ein. Biegen Sie sie mit einem ziemlich flachen Winkel so, dass die äußerste Spitze der Haltepipette den Boden der Petrischale berührt und nahezu horizontal ausgerichtet ist.

Wechseln Sie zu einer höheren Vergrößerung am Mikroskop und verwenden Sie einen superfeinen Wimpernhaken mit Griff. Positionieren Sie den Larvenzebrafisch mit der dorsalen Seite nach unten, sodass der Dott nahe der Haltepipette liegt. Drehen Sie den Mikrometertreibzug, der die manuelle Mikrospritzenpumpe steuert, gegen den Uhrzeigersinn, um den Larvenzebrafisch zu fixieren, indem Sie den Dott in die Haltepipette ansaugen.

Achten Sie darauf, den Mikrometer nicht zu weit zu drehen, da das Eigelb platzen kann. Wenn es zu tief in die Haltepipette gezogen wird, fokussieren Sie auf die sich bildende gemeinsame Kardinalvene, die über dem Eigelb direkt unterhalb des Periderms liegt und eine Region mit hohem Blutfluss darstellt. Mit dem Mikromanipulator der Injektionsvorrichtung.

Führen Sie die Nadel in die sich entwickelnde gemeinsame Kardinalvene ein. Nach der Einführung muss die Nadel in der Regel etwas zurückgezogen werden, da die gemeinsame Kardinalvene sehr oberflächlich liegt. Wenn der Dott des Larvenstücks mit der Haltepipette richtig gehalten wird, rollt es nicht, während die Nadel eindringt.

Injizieren Sie ein Nanoliter Lösung, indem Sie das Fußpedal betätigen. Danach lösen Sie die Larven aus der Haltepipette und führen sie ins Larvenwasser zurück. Um den Erfolg der Mikroinjektion zu überprüfen, überwachen Sie das Vorhandensein von Lucifer Yellow Dextran im Herzen der Zebrafischlarven.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop bleibt Lucifer Yellow im Kreislaufsystem etwa 20 Minuten lang sichtbar; kehren Sie die Larven vier Tage nach der Befruchtung in frisches E3-Medium zurück. Geben Sie zwischen 10 und 15 Zebrafischlarven in 4-Milliliter-Glasfläschchen und fixieren Sie sie vier Stunden bei Raumtemperatur in einem Milliliter Dent's Lösung. Rehydrieren Sie die Larven in einer abgestuften Methanol-P-B-T-P-B-S-Lösung mit 0,5 %, von 20 über 75 zu 25, 50 zu 50, 25 zu 75, bis 100 % PBT, wobei Sie die Lösung abpipettieren und eine neue Lösung zum selben Fläschchen hinzufügen.

Ein Milliliter Lösung pro Gefäß. 20 Minuten in jeder Lösung. Die Larven dürfen niemals Luft ausgesetzt werden.

Stets etwas Lösung über den Larven belassen. Beim Wechseln der Lösungen das PBT entfernen und durch ein Milliliter Blockierungslösung PBS mit 1 % DMSO und 0,5 % zwischen 20 und 10 % normalem Ziehenserum für drei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Mutaschüttler ersetzen. Die Larven in ein zwei-Milliliter-Eppendorf-Gefäß überführen.

Entfernen Sie das blockierende Serum und ersetzen Sie es durch 300 Mikroliter Primärantikörper. Ein monoklonaler Natrium-Kalium-Antikörper bei TPS in einer Verdünnung von 1:25, Alpha-sechs-F-Supernatant, und 300 Mikroliter Inkubationslösung PBS mit 1 % DMSO, 0,5 % Tween 22 und 2 % normalem Zieuserserum über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Mutaschüttler. Entfernen Sie den Primärantikörper und waschen Sie dreimal je 30 Minuten mit je einem Milliliter Inkubationslösung bei Raumtemperatur, wobei jede Waschung auf einem Mutaschüttler erfolgt.

Dann inkubieren Sie mit sekundärem Antikörper, der im Inkubationspuffer im Verhältnis 1:500 verdünnt ist, zwei Stunden bei Raumtemperatur. Danach waschen Sie dreimal für jeweils 30 Minuten mit PBT, dehydrieren die Larven anschließend durch eine abgestufte Ethanolreihe, wobei jede Stufe 10 Minuten dauert. Bereiten Sie die Infiltrationslösung vor, indem Sie 25 Milliliter JB-4-Einbettungslösung A und 0,24 Gramm Katalysator verwenden und 20 bis 30 Minuten auflösen. Die Lösung kann bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Entfernen Sie das 100 % Ethanol und ersetzen Sie es durch Plastikinfiltrationslösung. Stellen Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius auf einen Rotator und lassen Sie die Infiltration etwa 30 Minuten lang andauern, bis die Larven auf den Boden des Röhrchens sinken. Um die Larven einzubetten, stellen Sie die Kunststoffformierschalen unter ein Stereomikroskop.

Überführen Sie die Larven zusammen mit ausreichend Infiltrationslösung, um die Larven in den Bechern zu bedecken. Das plastische Einbettungsmaterial wird in einem kleinen Plastikröhrchen vorbereitet. Normalerweise betten wir vier bis fünf Larven gleichzeitig ein, wobei eine Larve pro Becher verwendet wird, und bereiten fünf Milliliter Einbettungskunststoff vor.

Fügen Sie 35 µL JB vier, Einbettlösung B, zu jedem Milliliter Infiltrationslösung hinzu und mischen Sie die Lösung mehrmals gründlich durch Auf- und Abpipettieren mit einer Plastikpipette oder Pasteurpipette, um sicherzustellen, dass JB vier ordnungsgemäß polymerisiert. Nachdem fünf Milliliter Einbettkunststoff vorbereitet wurden, entfernen Sie die Infiltrationslösung mit einer Pasteurpipette von den runden Proben. Füllen Sie die Mulde mit Einbettkunststoff; der Kunststoff muss aus der Mulde austreten, um eine gute Haftung des Blockhalters an der Probe sicherzustellen.

Zur Detektion von Nierentubuli bei Zebrafischen eignen sich Querschnitte am besten für diesen Zweck. Die Larven müssen vertikal eingebettet werden, mit dem Kopf nach unten, wobei eine Wimper mit Griff oder feine Pinzette hilfreich ist.

Positionieren Sie die Larven periodisch vertikal, bis der Kunststoff fest genug ist, sodass sie ihre Position nicht mehr verändern. Dies dauert etwa 20 bis 30 Minuten. Danach platzieren Sie den EVH-Zweiblockhalter über die Vertiefungen und lassen das Tablett über Nacht bei vier Grad Celsius stehen, bis die Polymerisation vollständig ist.

Platzieren Sie die Probe in der Spannvorrichtung des Mikrotoms und stellen Sie den Objektträgerwärmer auf 45 Grad Celsius ein. Füllen Sie deionisiertes Wasser in ein Becherglas und stellen Sie es vor dem Schneiden in die Nähe des Mikrotoms. Achten Sie darauf, dass der Block so ausgerichtet ist, dass perfekte transversale Schnitte der Larven entstehen.

Die Einstellhebel für die Kopforientierung können gedreht werden und die Hintergrundbeleuchtung bei der Positionierung der Probe. Schneiden Sie dicke Schnitte durch den Kopf. Orientieren Sie die Gewebeproben so, dass für jedes Larvenexemplar äquivalente Augenabschnitte entnommen werden.

Wenn die Brustflossen in den Schnitten erscheinen, beginnen die Pronephrostubuli. Ab diesem Punkt schneiden Sie etwa 32 vier Mikrometer dicke Schnitte aus den Blocken. Sammeln Sie die Schnitte mit einer Pinzette und lassen Sie sie in das Becherglas mit Wasser fallen, ohne dass die Pinzette das Wasser berührt.

Der Schnitt wird sich sofort ausdehnen, sobald er die Wasseroberfläche berührt. Nun können Sie ihn auf einem Objektträger auffangen. Führen Sie den Objektträger unter einem Winkel von 45 Grad ins Wasser ein und nähern Sie sich dem Schnitt mit Hilfe einer Wimper mit Griff, wobei Sie nur die Ränder des Schnitts berühren. Inkubieren Sie die Objektträger auf einer Warmluftplattform, bis sie vollständig trocken sind, und nehmen Sie die Schnitte mittels Epi-Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie auf.

Wenn die Injektion korrekt durchgeführt wird, erscheint die injizierte Larve wie hier im oberen Bild gezeigt, wobei der fluoreszierende Luciferase-gelbe Dextran im Gefäßsystem der Larven sichtbar ist. Wenn die Injektion zu tief erfolgt, wie im unteren Bild dargestellt, kann das injizierte Material im Dottersack gesehen werden oder das Herz kann verletzt werden, was zu starkem Bluten führt. Die Larven entwickelten ein perikardiales Ödem als Folge der Gentamicin-Nephrotoxizität, wie hier zu sehen ist.

Die Kontrolllarven oben zeigen kein Perikardödem. Nach Injektion von Gentamycin weisen jedoch 80 % der Zebrafischlarven ein mäßiges oder schweres Ödem auf, wie durch die Pfeile in den mittleren und unteren Bildern angezeigt. Wir verwenden ein phänotypbasiertes Klassifizierungssystem, bei dem Larven mit mäßigem Ödem ein deutliches Perikardödem aufweisen, jedoch keine weiteren beobachtbaren Phänotypen zeigen.

Während schwere ödematöse Larven Perikard- und Rumpfödeme, fehlende Durchblutung des Rumpfes sowie eine leichte bis mäßige Krümmung des Zugangs zeigen, wird ein Nierentubulus-Antikörper gegen Natrium-Kalium-ATPase verwendet. Die geschädigten Tubuli werden in Querschnitten dargestellt, wobei in den Panel C und D ein deutlicher Verlust der Zellpolarität sowie eine tubuläre Disruption in den geschädigten Tubuli im Vergleich zu den Kontrollen in den Panel A und B erkennbar ist. Dieses Muster bleibt bei mehreren Querschnitten konsistent, wenn die Abschnitte verglichen werden. Faktorielle Flossen und proximale gewundene Tubuli dienen als anatomische Marker.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine akute Nierenschädigung bei Zebrafischembryonen induziert. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, Injektionsnadeln mit einem Durchmesser von 10–20 Mikrometern zu verwenden. Es kann notwendig sein, einige Haltepipetten nachzupolieren, um die geeigneten Spitzen zu erhalten; jedoch kann man diese anschließend weiterverwenden, da sie für mehrere Injektionsdurchgänge geeignet sind.

Außerdem ist es wichtig sicherzustellen, dass keine Luftblase im Mikroserien-JA-Gerät vorhanden ist, da dies die Position des Systems verringern würde. Schließlich sollte der Fisch während der Einbettung vertikal positioniert werden, um einen perfekten transversalen Querschnitt des Nierentubulus zu erhalten. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.