Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Die Expression von fluoreszierenden Reportern in transgenen Tieren ermöglicht es, zelluläre Reaktionen auf experimentelle Manipulationen in lebenden Krankheitsmodellen zu verfolgen. Hier wird bei Zebrafischen, hochauflösenden Multicolor-Konfokalen, pharmakologisch selektiver Zellverlust pharmakologisch induziert. Bilder der Zielzellen und unmittelbaren Nachbarn werden vor und unmittelbar danach aufgenommen, und die Abstände nach der bildgebenden Behandlung zeigen die Aktivierung endogener Stammzellpopulationen und den anschließenden Ersatz der Zielzellen während der Erholungsphase.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der regenerativen Biologie zu beantworten, wie z. B. Welche zellulären und molekularen Mechanismen werden zur Regeneration diskreter Zelltypen verwendet? Beginnen Sie mit der Übertragung transgener Eier aus der Paarung in eine Petrischale mit 0,3 x Danio-Lösung 16 Stunden nach der Befruchtung. ADD PTU zur Hemmung der Tyrosin-ACE-Aktivität vor dem Nachweis einer Pigmentierung im interessierenden Gewebe. Wenn es sich bei dem Embryo nicht um einen Albino handelt, inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius.

Sobald Reporter erkennbar sind, legen Sie die Petrischale unter ein fluoreszierendes Stereo-Zoom-Mikroskop und sortieren Sie nach der gewünschten Transgenexpression. Vor der Bildgebung. Bereiten Sie eine 0,5%ige Low Melt Aeros-Einbettlösung in Embryomedium vor und lagern Sie sie bei 40 Grad Celsius.

Bei Bedarf trica und PTU hinzufügen. Vorsichtig mischen und wieder auf 40 Grad Celsius erhitzen. Betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn in ein Embryomedium legen, das Trica enthält.

Für etwa drei Minuten reagiert der Fisch nicht mehr. Zum Anfassen mit einer Mikropipette ziehen Sie einzelne Fische in eine getrimmte Pipettenspitze in einem Volumen von etwa 30 Mikrolitern Anästhesielösung. Als nächstes drehen Sie die Pipette um und lassen Sie den Fisch auf dem Boden liegen.

Berühren Sie die Spitze mit der Montagelösung und lassen Sie sie durch die Schwerkraft übertragen. Achten Sie darauf, dass das Agro nicht verdünnt wird, damit es wiederverwendet werden kann. Entsorgen Sie die restliche Anästhesielösung aus der Mikropipette.

Dann den Fisch mit der gleichen Spitze in eine Petrischale geben. Richten Sie den Fisch in etwa 30 Mikrolitern Einbettlösung vorsichtig so aus, dass der interessierende Bereich im Aeros-Tröpfchen zentriert ist. Stellen Sie sicher, dass der Fisch in der gewünschten Ausrichtung bleibt, bis sich der Aeros verfestigt.

Auf Wunsch können mehrere Fische in einer einzigen Petrischale montiert werden. Nachdem sich das Aeros verfestigt hat, transportieren Sie den Fisch zum konfokalen Mikroskoptisch und geben Sie vorsichtig Embryomedium, das Trica plus oder minus PTU enthält, in die Schale, bis die Fische vollständig untergetaucht sind. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware und fokussieren Sie sich auf den interessierenden Bereich, um eine optimale Abbildung zellulärer und/oder molekularer Details zu ermöglichen.

Verwenden Sie in der Software Objektive mit großem Arbeitsabstand und hohen numerischen Aperturen. Wählen Sie die passenden Flora Fours aus der Wählliste aus. Klicken Sie auf Spektraleinstellung und passen Sie die Emissionsbereiche an.

Um eine saubere Trennung der Reportersignale zu erreichen und das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Wählen Sie das entsprechende Ziel im Dropdown-Menü aus, um sicherzustellen, dass alle softwaredefinierten Voreinstellungen richtig angepasst werden. Um die Laser zu fokussieren und die Leistungsstufen einzustellen, wählen Sie einen Ausgang aus der Nachschlagetabelle aus, der die Pixelsättigung für jeden Kanal anzeigt.

Stellen Sie anschließend die Empfindlichkeit des Detektors ein, um die gewünschte Bildqualität zu erhalten, und erhöhen Sie die Laserleistung allmählich, bis die Bildintensität akzeptabel ist. Vermeiden Sie Pixelsättigung im interessierenden Bereich und halten Sie die Laserpegel so gering wie möglich. Zur Reduzierung von Photobleich- und Phototoxizitätsproblemen.

Stellen Sie sicher, dass jede Laserlinie nur im entsprechenden Kanal ein erkennbares Signal erzeugt, indem Sie die Laser manuell ein- und ausschalten, während Sie alle Bildgebungskanäle überwachen. Ist kein Übersprechen erkennbar, können alle Kanäle gleichzeitig erfasst werden. Als Nächstes rahmen Sie den Interessenbereich mit den Zoom- und Rotationsfunktionen ein.

Stellen Sie dann die Scangeschwindigkeit und die Bildgröße mit schnelleren Scangeschwindigkeiten ein, minimieren Sie die Verweilzeit des Lasers und erhöhen Sie die zeitliche Auflösung. Legen Sie die Schrittgröße für die Z-Dimension entsprechend den experimentellen Anforderungen fest. Hier wird eine Schrittweite von 10 Mikrometern verwendet, um sieben optische Schnitte von Netzhautgewebe abzubilden.

Sobald die entsprechenden Einstellungen festgelegt wurden, erfassen Sie Zack-Bilder und speichern Sie. Gehen Sie dann zum nächsten Fisch über. Serielle Catch-and-Release-Bildgebung kann durchgeführt werden, um zelluläre Veränderungen über aufeinanderfolgende Tage gemäß den Anweisungen im begleitenden schriftlichen Dokument zu verfolgen.

Bei der Durchführung eines Multi-Reporter-Imaging-Experiments ist es am besten, Bodenböden zu verwenden, die gut voneinander getrennt sind, was jedoch spektral nicht immer praktikabel ist. Hier zeigen wir eine einfache Bildsubtraktionsmethode mit der Open-Source-Software image J, um Bodengeschosse mit überlappenden Anregungs- und Emissionsprofilen zu trennen. In unserem Fall GFP und YFP.

Die in diesem Video beschriebenen Timelines-Bildgebungsverfahren wurden verwendet, um GFP-markierte retinale Stammzellen während der Ablation und Regeneration von retinalen bipolaren Neuronen zu überwachen. Um eine spektrale Trennung durchzuführen, sammeln Sie Bilder mit sequentiellen Bildgebungsmodi und variablen Barrierefiltereinstellungen, die es ermöglichen, überlappende Geschosse unabhängig voneinander bzw. teilweise getrennt zu erfassen. Nachdem die Bilder erfasst wurden, verwenden Sie den ImageJ loci bio formas Import, um die Bilddateien zu öffnen und das Importwerkzeug zu starten. Ziehen Sie die gewünschte Datei in das Bild J-Fenster.

Teilen Sie die Kanäle in einzelne Stacks auf, indem Sie das Kontrollkästchen "Kanäle teilen" im Importfenster verwenden, um das Plugin "Drei TP ausrichten" zu starten. Klicken Sie auf Plugins und dann auf Stacks ausrichten. Richten Sie dann drei tp aus.

Die Stapel müssen so ausgerichtet sein, dass eine korrekte Subtraktion gewährleistet ist. Wählen Sie in der ersten Dropdown-Box den Referenz-Stack und in der zweiten den falsch ausgerichteten Stack aus. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen XY-relativen Ursprung verwenden und Z-relativen Ursprung verwenden und klicken Sie auf OK.

Um den Ausrichtungsprozess zu starten, klicken Sie auf die Schaltfläche zur Lautstärkeregistrierung. Es wird ein neues Fenster mit den Ausrichtungsparametern angezeigt. Klicken Sie auf OK.

Dieser Abschnitt wurde vom Distributor des Plugins optimiert, so dass keine Änderungen erforderlich sind. Wenn Sie fertig sind, wird ein Fenster mit ausgerichteten Stapeln angezeigt. Wählen Sie die Ausgabe aus dem ausgerichteten Fenster aus, um das Ausgabefenster zu öffnen.

Dieses Fenster ist ebenfalls optimiert und muss nicht geändert werden. Klicken Sie auf OK. Im Arbeitsbereich wird ein neuer Stapel angezeigt, an dessen Ausrichtung am Ende des Dateititels angehängt ist.

Um das Übersprechen mit dem Bildrechner zu entfernen, klicken Sie auf Prozess und dann auf Bildrechner. Wählen Sie in der Dropdown-Box des Bildes den Stapel aus, der subtrahiert werden soll, und den Stapel, der für die Subtraktion verwendet werden soll. Wählen Sie im Dropdown-Feld Bild zwei die Option Subtrahieren im Dropdown-Feld Operation aus und klicken Sie auf OK.

Image J fordert Sie auf, den Stack zu verarbeiten. Wählen Sie Ja aus. Es sollte ein neuer Stack erscheinen, der das Übersprechen zwischen überlappenden Kanälen entfernt hat.

Führen Sie die Stapel zusammen, um die gleiche Bildstruktur vor dem Ausrichten und Subtrahieren wiederherzustellen. Durch die Auswahl zusammengeführter Kanäle im Fenster der Kanalwerkzeuge ermöglicht das Werkzeug das Zusammenführen von bis zu vier Stapeln zu einem Hyper-Stapel. Zum Schluss färben Sie die Kanäle ein, passen Sie Helligkeit und Kontrast an und speichern Sie die Dateien als TIFFs, um den gezielten Verlust und die Regeneration der Nitroreduktase zu untersuchen.

M Kirsche exprimierende retinale bipolare Zellen. Vor der Behandlung wurde eine Zeitreihe von konfokalen Bildern bei einzelnen Zebrafischen aufgenommen. Es gibt eine Mosaikexpression des membranmarkierten YFP-Reporters in kontrollierten Bipolarzellen, die in Gelb dargestellt sind, und des Nitroreduktase-Kirschfusionsproteins in den Zielbipolaren, die in Rot dargestellt sind.

Das membranmarkierte CFP-Transgen, das in Cyan dargestellt ist, liefert Kontextinformationen über die meisten anderen Netzhautzellen für zusätzliche Klarheit. Das gleiche Bild ohne das CFP-Signal wird nach der Behandlung mit Metronidazol gezeigt. Die rote Nitroreduktase, die bipolare Zellen exprimiert, gehen verloren, während die gelb kontrollierten Bipolarzellen verschont bleiben.

Dies zeigt die hohe Spezifität dieser Ablationsmethode. Auch hier wird aus Gründen der Übersichtlichkeit das gleiche Bild ohne CFP gezeigt. Wenn Metro NIAZ entfernt wird, kehren NTR-exprimierende Zellen hierher zurück.

Ein Beispiel für die Subtraktionsmethode G-F-P-Y-F-P ist in dieser Abbildung GFP mit der Bezeichnung Mueller dargestellt. GL-Zellen sind grün und YFP-markierte bipolare Zellen sind violett dargestellt. Die Überlappung zwischen den beiden erzeugt Weiß, um die Subtraktion durchzuführen.

Die GFP- und YFP-Bilder müssen zunächst ausgerichtet werden. Der Subtraktionsprozess ermöglicht es dann, YFP-markierte Bipolarzellen aus dem GFP-Bild zu entfernen, wodurch GFP-markierte Mueller-GGL-Zellen sauber dargestellt und dunklere Mueller-Zellen nachgewiesen werden können. Die Überlappung zwischen den mit dunkler Mueller-, GGL- und M-Kirsche markierten bipolaren Zellen, die rot dargestellt sind, kann nun verifiziert werden.

Die hier gezeigten Daten deuten darauf hin, dass die Ablation von bipolaren Zellen die Mull-ggl auslöst, um die verlorenen Zellen zu ersetzen. Diese Interpretation steht im Einklang mit neueren Studien zur Netzhautregeneration, die Mueller Ggl als verletzungsinduzierte Vorläuferzellen sowohl bei Säugetieren als auch bei Fischen implizieren. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, Mechanismen zu erforschen, die die Regeneration bestimmter Zelltypen durch die Visualisierung von Stammzellen im Zebrafisch regulieren.