Name: Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Erfahren Sie mehrfarbige Zeitraffer-Imaging-Methoden zur Untersuchung neuronaler Regeneration in transgenen Zebrafischen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von Stammzellaktivierung und Zellersatz in vivo.

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Wir möchten Drs danken. Meera Saxena und Jonathan Mathias für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Wir danken Drs. Michael Parsons, Pamela Raymond, und Rachel Wong für die Bereitstellung von transgenen Linien. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die MCG IACUC genehmigten Protokoll durchgeführt 07-12-003 * B. Diese Arbeit wurde vom NIH R21 MH083614 und March of Dimes Basil O Conner Starter Scholar Award an JSM unterstützt

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 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

JSM hat ein Patent auf die Verwendung des Nitroreduktase-basierte System von Zellablation im Zebrafisch (Mumm JS, und Schroeter, EH Gezielte und Regional Ablation Cellular Ablation im Zebrafisch &quot;US-Patent 7514595. 7. April 2009) ausgezeichnet. Diese Technik ist verwendet als allgemeine Plattform für ein Tools und Services Biotechnologie-Unternehmen, Luminomics, Inc., dass JSM gegründet und ist ein Stakeholder in.

In diesem Video wird ein Überblick über die Techniken, die wir für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Wir beschäftigen Zeitraffer-Imaging um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses in vivo beobachten, während Zielzelle Ablation wird verwendet, um neuronale Schaltkreis Funktion und Zell-spezifische neuronale Regeneration Paradigmen zu studieren. Die gezeigten Beispiele hervorheben mehrere Vorteile, die sich aus diesen Ansätzen entnommen werden kann. Vielleicht am wichtigsten ist, bietet Zeitraffer-Bildgebung eine intern gesteuert Paradigma; sämtliche Phänomene beobachtet werden können zurück zur vorherigen Zustände bezogen werden. Dies ermöglicht den direkten anstatt abgeleitet Vergleiche zwischen experimentellen Zeitpunkten vorgenommen werden, so dass relative Veränderungen leichter zu quantifizieren und zu reduzieren experimentellen &quot;Rauschen&quot; mit Variationen innerhalb einer Population assoziiert. Ein Vorteil der multicolor Bildgebung ist die Fähigkeit, Veränderungen im Umgang und / oder benachbarten Zelltypen zu visualisieren. Zum Beispiel mit Hilfe einer transgenen Linie, die Müller Glia-Etiketten, sind wir nun die Charakterisierung der Reaktion dieser möglichen Verletzung induzierten Stammzellen, um den Verlust von diskreten retinalen Zell-Subpopulationen. Wir haben auch diesen Ansatz verwendet, um neuartige Mechanismen der neuronalen Schaltkreis Bildung 2 zu definieren. Schließlich wird neben dem Studium der Zellregeneration, haben wir vor kurzem begonnen mit der NTR-basierte Ablation System der funktionalen Rolle neuronaler Subtypen damit diskrete neuronale Schaltungen mit verschiedenen Verhaltens-Paradigmen und elektrophysiologische Tests zu untersuchen. Der einzigartige Vorteil der Verwendung der Zebrafisch für solche Untersuchungen ist, dass aufgrund ihrer Regenerationsfähigkeit, induzierte Defizite vorübergehend sind. So kann durch die Korrelation mit Zeitraffer-Imaging-Assays können wir verkörpern Reinnervation Mechanismen, die zu führen, sowie das Ausmaß der Reinnervation für, funktionelle Wiederherstellung erforderlich sind. Die Methoden bereitgestellt werden, um viele verschiedene Fragestellungen angepasst werden. So können ähnliche Analysen der Ablation und Regeneration keine transgen definierbare zellulären Subtyp angewendet werden. Gemeinsam haben solche Studien Potenzial für unser Verständnis der Wiedergeburt auf der Ebene der einzelnen Zelltypen und in diskreter Stammzellnischen erweitern.

1. Reagenzien: Danieau-Lösung: <ul><li> Natriumchlorid (Fisher, S271 1) </li><li> Kaliumchlorid (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> Magnesiumsulfat (Fisher, M65 500) </li><li> Calciumnitrat (Fisher, C109500) </li><li> Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Andere Reagenzien: <ul><li> Low Melt Agarose (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane Methansulfonat (Fisher, NC9435281) </li><li> N-Phenylthioharnstoff (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazol (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Zubehör: <ul><li> Tief Petrischalen (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont Nr. 5 feinen Pinzette (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Ausstattung: <ul><li> Zoom Stereoskop (Olympus, SZ51) </li><li> Fluoreszenz-Zoom Stereoskop (Olympus, SZX16) </li><li> Konfokalen Mikroskop (Olympus FV1000) </li><li> Digitale Motorvorwärmung - Isotemp (Fisher, 11 bis 715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Benchtop Inkubator (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor zeitraffer-imaging transgener zebrafische: visualisierung von retinal stammzellen durch gezielte nervenzellen ablation activated

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging lebender Zebrafischlarven kann genutzt werden, um zu visualisieren, wie biologische Prozesse entfalten (für eine Übersicht siehe 1). Compound transgene Fische, die verschiedenen fluoreszierenden Reporter Express in benachbarten Zelltypen bieten eine Möglichkeit, folgende zellulären Interaktionen 2 und / oder Gewebe-Ebene Antworten auf experimentelle Manipulationen im Laufe der Zeit. In diesem Video zeigen wir Methoden, die für die Bildgebung mehrere transgen bezeichnet Zelltypen verwendet werden können seriell in den einzelnen Fisch im Laufe der Zeit Kurse, die von einigen Minuten bis zu mehreren Tagen erstrecken kann. Die beschriebenen Techniken gelten für alle Studie versucht, das &quot;Verhalten&quot; der benachbarten Zellen-Typen im Laufe der Zeit zu korrelieren, darunter: 1) Serie &quot;catch and release&quot;-Methoden für die Bildgebung eine große Anzahl von Fischen über mehrere aufeinander folgende Tage, 2) vereinfachte Ansätze zur Trennung Fluorophore mit überlappenden Anregungs-/ Emissions-Profile (zB GFP und YFP), 3) Verwendung von hypopigmentierte Mutantenlinien zu erweitern das Zeitfenster für hochauflösende Bildgebung in den späten Larvenstadien der Entwicklung, 4) Einsatz von Membran gezielt fluoreszierenden Reporter zu offenbaren feine morphologische Details der einzelnen Zellen sowie zelluläre Details in größeren Populationen von Zellen, und 5) eine zuvor beschriebene Verfahren zum chemisch-induzierte Ablation von transgen gezielte Zelltypen, dh Nitroreduktase (NTR) vermittelte Umwandlung von Prodrug Substrate, wie Metronidazol (MTZ), um zytotoxische Derivate 3,5. Als ein Beispiel dieser Ansätze werden wir visualisieren die Ablation und Regeneration ein Subtyp der Netzhaut bipolaren Neuronen innerhalb der einzelnen Fische über mehrere Tage. Gleichzeitig werden wir überwachen mehrere andere retinale Zelltypen, einschließlich benachbarten Nicht-Ziel bipolaren Zellen und potenziellen Degeneration der Netzhaut-stimulierten Stammzellen (dh Mϋller Glia). Diese Strategie wird in unserem Labor angewendet, Zell-und Gewebe-Ebene (zB Stammzellnische) Antworten auf die selektive Verlust und Regeneration von gezielten neuronalen Zelltypen zu charakterisieren.

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu überwachen<em&gt; In vivo</em&gt;. Gezielte Zellablation erleichtert die Studie neuronalen Schaltkreis Funktion und Zell-spezifische neuronale Regeneration Paradigmen.

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Hochauflösende Zeitrafferaufnahmen lebender Zebrafischlarven können genutzt werden, um die Entfaltung biologischer Prozesse zu visualisieren (siehe Übersicht 1). Verbindung ...

Die Expression fluoreszierender Reporter in transgenen Tieren ermöglicht es, zelluläre Reaktionen auf experimentelle Manipulationen in lebenden Krankheitsmodellen zu verfolgen. Hier wird ein selektiver Zellverlust pharmakologisch in Zebrafischen induziert, wobei hochauflösende mehrfarbige konfokale Aufnahmen der gezielten Zellen und ihrer unmittelbaren Nachbarn vor, unmittelbar nach und in zeitlichem Abstand nach der Behandlung mit dem Wirkstoff angefertigt werden. Die Bildanalyse zeigt die Aktivierung endogener Stammzellpopulationen und die anschließende Ersetzung der betroffenen Zellen während der Regenerationsphase auf.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Regenerationsbiologie zu beantworten, beispielsweise: Welche zellulären und molekularen Mechanismen werden zur Regeneration spezifischer Zelltypen genutzt? Beginnen Sie damit, transgene Eier, die aus Kreuzungen gewonnen wurden, in eine Petrischale mit 0,3 x Danio-Lösung zu überführen, 16 Stunden nach der Befruchtung. Fügen Sie PTU hinzu, um die Tyrosin-ACE-Aktivität zu hemmen, bevor irgendwelche Anzeichen von Pigmentierung im betreffenden Gewebe sichtbar werden. Falls das Embryo nicht albino ist, inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius.Sobald Reporter sichtbar sind, stellen Sie die Petrischale unter ein fluoreszierendes Stereozoommikroskop und sortieren Sie nach gewünschter Transgenexpression. Vor der Bildaufnahme bereiten Sie eine 0,5 %ige Low-Melt-Agarose-Einbettungslösung in Embryomedium vor und lagern Sie diese bei 40 Grad Celsius.Fügen Sie Trica und PTU gegebenenfalls hinzu. Vorsichtig mischen und auf 40 Grad Celsius zurückbringen. Betäuben Sie die Fische, indem Sie sie in Embryomedium mit Trica geben.Etwa drei Minuten lang wird der Fisch nicht ansprechbar sein. Berühren Sie den Fisch mit einer Mikropipette und saugen Sie einzelne Fische in eine gekürzte Pipettenspitze mit einem Volumen von etwa 30 Mikrolitern Anästhetikumlösung. Danach drehen Sie die Pipette um und lassen Sie den Fisch auf den Boden absinken.Berühren Sie die Spitze mit der Montagelösung und lassen Sie die Proben durch Schwerkraft übergehen. Achten Sie darauf, das Agar nicht zu verdünnen, damit es wiederverwendet werden kann. Entsorgen Sie die restliche Anästhetiklösung aus der Mikropipette.Überführen Sie den Fisch anschließend mit derselben Pipettenspitze in eine Petrischale. Orientieren Sie den Fisch in etwa 30 Mikrolitern Einbettlösung vorsichtig so, dass der interessierende Bereich in der Mitte des Aeros-Tropfens liegt. Achten Sie darauf, dass der Fisch in der gewünschten Orientierung verbleibt, bis das Aeros erstarrt ist.Mehrere Fische können bei Bedarf in einer einzigen Petrischale montiert werden. Nachdem das Agar erstarrt ist, transportieren Sie die Fische auf die Objektbühne des konfokalen Mikroskops und geben Sie vorsichtig Embryomedium mit Trica mit oder ohne PTU in die Schale, bis die Fische vollständig bedeckt sind. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware und fokussieren Sie den Bereich von Interesse, um eine optimale Abbildung zellulärer und/oder molekularer Details zu erzielen.Verwenden Sie Objektive mit großer Arbeitsdistanz und hohen numerischen Aperturen in der Software. Wählen Sie die geeigneten Flora-Viersche aus der Wahlliste aus. Klicken Sie auf „Spektraleinstellung“ und nehmen Sie Anpassungen an den Emissionsbereichen vor.Um eine saubere Trennung der Reporter-Signale zu erzielen und die Signal-Rausch-Verhältnisse zu maximieren, wählen Sie das geeignete Objektiv im Dropdown-Menü aus, um sicherzustellen, dass alle softwaredefinierten Voreinstellungen korrekt angepasst werden. Um die Laser zu fokussieren und die Leistungsstufen einzustellen, wählen Sie eine Ausgabe aus der Nachschlagetabelle, die die Pixel-Sättigung für jeden Kanal anzeigt.Als Nächstes stellen Sie die Detektor­empfindlichkeit ein, um die gewünschte Bildqualität zu erzielen, und erhöhen schrittweise die Laserleistung, bis die Bildintensität akzeptabel ist. Vermeiden Sie eine Sättigung der Pixel im interessierenden Bereich und halten Sie die Laserintensität so niedrig wie möglich, um Probleme durch Photobleichen und Phototoxizität zu verringern.Stellen Sie sicher, dass jede Laserlinie nur im entsprechenden Kanal ein nachweisbares Signal erzeugt, indem Sie die Laser manuell ein- und ausschalten und dabei alle Bildgebungskanäle überwachen. Falls keine Übersprecher erkennbar sind, können alle Kanäle gleichzeitig aufgenommen werden. Schließen Sie als Nächstes den interessierenden Bereich mit Hilfe der Zoom- und Drehfunktionen ein. Danach die Abtastgeschwindigkeit und Bildgröße einstellen; schnellere Abtastgeschwindigkeiten minimieren die Laser-Belichtungszeit und erhöhen die zeitliche Auflösung. Die Schrittweite in Z-Richtung gemäß den experimentellen Anforderungen festlegen. Hier wird eine Schrittweite von 10 Mikrometern verwendet, um sieben optische Schnitte von Netzhautgewebe abzubilden.Nachdem die geeigneten Einstellungen festgelegt wurden, erfassen Sie die Zack-Bilder und speichern Sie sie. Danach wechseln Sie zum nächsten Fisch. Eine serielle Schnapp-und-Freilass-Aufnahme kann durchgeführt werden, um zelluläre Veränderungen an aufeinanderfolgenden Tagen gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Dokument zu verfolgen.Bei der Durchführung eines Multireporter-Imaging-Experiments ist es am besten, Fluorophore zu verwenden, deren Spektren gut getrennt sind. Dies ist jedoch nicht immer praktikabel. Hier zeigen wir eine einfache Bild-Subtraktionsmethode unter Verwendung der Open-Source-Software ImageJ, um Fluorophore mit überlappenden Anregungs- und Emissionsprofilen zu trennen. In unserem Fall GFP und YFP.Die in diesem Video beschriebenen Zeitrafferaufnahmetechniken wurden verwendet, um GFP-markierte retinale Stammzellen während der Ablation und Regeneration retinaler bipolaren Neuronen zu verfolgen. Führen Sie zur spektralen Trennung die Bildaufnahme mithilfe sequenzieller Aufnahmemodi und variabler Sperrfiltereinstellungen durch, wodurch überlappende Fluoreszenzsignale unabhängig und teilweise getrennt erfasst werden können. Sobald die Bilder aufgenommen wurden, verwenden Sie den ImageJ-Loci-Bio-Formas-Import, um die Bilddateien zu öffnen und das Import-Tool zu starten. Ziehen Sie die gewünschte Datei in das ImageJ-Fenster.Teilen Sie die Kanäle mithilfe des Kontrollkästchens „Kanäle aufteilen“ im Importfenster in einzelne Stapel auf, um das Plugin „Drei TP ausrichten“ zu starten. Klicken Sie auf „Plugins“, dann auf „Stapel ausrichten“. Danach „Drei TP ausrichten“.Die Stapel müssen ausgerichtet werden, um eine korrekte Subtraktion sicherzustellen. Wählen Sie den Referenzstapel im ersten Dropdown-Feld und den nicht ausgerichteten Stapel im zweiten aus. Aktivieren Sie die Optionen „Verwende XY-relativen Ursprung“ und „Verwende Z-relativen Ursprung“ und klicken Sie auf „OK“.Um den Ausrichtungsprozess zu starten, klicken Sie auf die Schaltfläche „Volumenregistrierung“. Ein neues Fenster mit den Ausrichtungsparametern wird angezeigt. Klicken Sie auf „Okay“.Dieser Abschnitt wurde vom Anbieter des Plugins optimiert, sodass keine Änderungen erforderlich sind. Nach Abschluss erscheint ein Fenster mit ausgerichteten Stapeln. Wählen Sie die Ausgabe aus dem ausgerichteten Fenster, um das Ausgabefenster zu öffnen.Dieses Fenster ist ebenfalls optimiert und benötigt keine Änderungen. Klicken Sie auf „Okay“. Ein neuer Stapel erscheint im Arbeitsbereich, wobei an den Dateititel „aligned“ angehängt wird.Um Übersprechen mit dem Bildrechner zu entfernen, klicken Sie auf „Prozess“ und dann auf „Bildrechner“. Wählen Sie im Dropdown-Feld „Bild 1“ den Stapel aus, der subtrahiert werden soll, und den Stapel, der für die Subtraktion verwendet wird. Im Dropdown-Feld „Bild 2“ wählen Sie im Dropdown-Feld „Operation“ die Option „Subtrahieren“ und klicken Sie auf „OK“.Image J fragt, ob der Stack verarbeitet werden soll. Wählen Sie Ja. Ein neuer Stack sollte erscheinen, der die Crosstalk-Effekte zwischen überlappenden Kanälen entfernt hat.Die Stapel zusammenführen, um die gleiche Bildstruktur vor der Ausrichtung und Subtraktion wiederherzustellen. Durch die Auswahl der zusammengeführten Kanäle im Kanalwerkzeugfenster ermöglicht das Werkzeug die Fusion von bis zu vier Stapeln zu einem Hyperstapel. Abschließend werden die Kanäle eingefärbt, Helligkeit und Kontrast angepasst und die Dateien als TIFFs gespeichert, um den gezielten Verlust und die Regeneration der Nitroreduktase zu untersuchen.M-Cherry-exprimierende retinale Bipolarzellen. Eine Zeitreihe von konfokalen Bildern wurde an einzelnen Zebrafischen vor der Behandlung aufgenommen. Es zeigt sich eine mosaikartige Expression des membrangebundenen YFP-Reporters in kontrollierten Bipolarzellen, dargestellt in Gelb, und des Nitroreduktase-Cherry-Fusionsproteins in gezielten Bipolarzellen, dargestellt in Rot.Das membrangebundene CFP-Transgen, dargestellt in Cyan, liefert zusätzliche Kontextinformationen über die meisten anderen Netzhautzellen zur besseren Veranschaulichung. Das gleiche Bild ohne das CFP-Signal ist nach Behandlung mit Metronidazol dargestellt. Die roten, Nitroreduktase-exprimierenden Bipolarzellen gehen verloren, während die gelben, kontrollierten Bipolarzellen erhalten bleiben.Dies verdeutlicht die äußerst spezifische Natur dieser Ablationsmethodik. Erneut wird das gleiche Bild ohne CFP zur Verdeutlichung gezeigt. Wenn metro NIAZ entfernt wird, kehren die NTR-exprimierenden Zellen an diese Stelle zurück.Ein Beispiel für die G-F-P-Y-F-P-Subtraktionsmethode ist in dieser Abbildung dargestellt: GFP-markierte Mueller-GL-Zellen sind in Gr&uuml;n dargestellt und YFP-markierte bipolare Zellen in Lila. Die &Uuml;berlagerung beider ergibt Wei&szlig;, um die Subtraktion durchzuf&uuml;hren.Die GFP- und YFP-Bilder müssen zunächst ausgerichtet werden. Mithilfe des Subtraktionsverfahrens können anschließend die mit YFP markierten bipolaren Zellen aus dem GFP-Bild entfernt werden, wodurch die mit GFP markierten Müller-ggl klar dargestellt und schwächer leuchtende Müller-Zellen detektiert werden können. Die Überlappung zwischen schwach leuchtenden Müller-Zellen, ggl und mit M-cherry markierten bipolaren Zellen, die in Rot dargestellt sind, kann nun überprüft werden.Die hier gezeigten Daten legen nahe, dass die Ablation bipolarer Zellen mullare Ggl auslöst, um die verlorenen Zellen zu ersetzen. Diese Interpretation steht im Einklang mit jüngsten Studien zur Netzhautregeneration, die Mueller-Ggl als verletzungsinduzierte Vorläuferzellen sowohl bei Säugetieren als auch bei Fischen identifizieren. Mit dieser Technik können Forscher die Mechanismen untersuchen, die die Regeneration spezifischer Zelltypen regulieren, indem sie Stammzellen im Zebrafisch visualisieren.

multicolor-time-lapse-imaging-transgenic-zebrafish-visualizing

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Quelle: Muto, A., et al. Ablation einer neuronalen Population mit einem Zwei-Photonen-Laser und deren Beurteilung mittels Calcium-Bildgebung und Verhaltensaufzeichnung bei Zebrafischlarven. J. Vis. exp. (2018){{}} In diesem Video,  Es wird ein Zwei-Photonen-Laserablationsverfahren demonstriert, das die selektive Zerstörung von fluoreszierenden Neuronen in Agarose-immobilisierten Zebrafischlarven ermöglicht. Die hochauflösende Bildgebung vor und nach dem Eingriff bestätigt eine effiziente...

Gezielte neuronale Ablation mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einer Zebrafisch-Larve

Quelle: Lahne, M., et.al. Kultur von adulten transgenen Zebrafisch-Netzhaut-Explantaten für die Bildgebung lebender Zellen mittels Multiphotonenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Live-Zell-Bildgebung der Kernmigration von Müller-Gliazellen in Agarose-eingebetteten Zebrafisch-Netzhautexplantaten nach lichtinduzierter Photorezeptorschädigung. Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), der von geschädigten Photorezeptoren freigesetzt wird, aktiviert Müller-Gliazellen und löst die...

Lebendzell-Bildgebung der Müller-Gliakernmigration während der Netzhautregeneration von Zebrafischen

Quelle: Williams, A. L., et al. Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung zur Visualisierung der Entwicklung in Echtzeit: Visualisierung von wandernden Neuralleistenzellen in Zebrafischembryonen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt ein Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebungsprotokoll, um die Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo in Echtzeit mit hoher Auflösung zu visualisieren.

Visualisierung der Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffer-Bildgebung

Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Erfahren Sie mehrfarbige Zeitraffer-Imaging-Methoden zur Untersuchung neuronaler Regeneration in transgenen Zebrafischen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von Stammzellaktivierung und Zellersatz in vivo.

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated (Video) | JoVE Journal

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

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