All-in-One-CRISPR-Genom-Editing: Eine Methode für den homologiegesteuerten reparaturbasierten Gen-Knock-in in kultivierten Zellen mit dem CRISPR-Cas9-System

Beginnen Sie mit der Zugabe von All-in-One-CRISPR-Plasmid zu Immunzellen, die in einem Röhrchen vorhanden sind. Dieses Plasmid enthält ein Cas9-Gen in Kombination mit der sgRNA- oder Single-Guide-RNA-kodierenden Sequenz, komplementär zur Zielsequenz im Wirtsgenom.

Fügen Sie ein linearisiertes Donorplasmid hinzu, das ein Transgen enthält, das zwischen Homologiearmen oder HAs eingebettet ist - die DNA-Wiederholungen, die für die homologe Rekombination erforderlich sind. Führen Sie eine Elektroporation durch, bei der elektrischer Strom verwendet wird, um das Plasmidgemisch in die Zelle zu injizieren. Im Inneren bildet die prozessierte sgRNA einen Komplex mit der exprimierten Cas9-Nuklease.

Die sgRNA bindet an die Zielstelle, so dass die Cas9-Nuklease die spezifische Erkennungssequenz, die als Protospacer-Nachbarmotiv oder PAM bekannt ist, identifizieren und die Wirts-DNA in der Nähe spalten kann. Dies führt zu einem stumpfen Doppelstrangbruch, bei dem die zelluläre Maschinerie die DNA reseziert und 3'-Überhänge erzeugt. Das Vorhandensein von HA-Flankierungsstellen löst den homologiegesteuerten Reparaturmechanismus aus, bei dem sich die geschnittene DNA mit der HA-Sequenz verbindet und eine Heteroduplex-Struktur bildet - die D-Schleife.

DNA-Synthese setzt sich fort und bildet einen Strang, der zur Transgensequenz komplementär ist, bis er sich wieder mit dem ursprünglichen DNA-Strang verbindet. Die Oberseite der D-Schleife dient als Vorlage für die Synthese des fehlenden Teils der DNA, wodurch die doppelten Holliday-Verbindungen erzeugt werden - Strukturen, in denen vier DNA-Stränge interagieren. Diese Verbindungen lösen sich auf und die Lücken reparieren sich, was die Insertion des Zielgens erleichtert.