Tol2-Transposon-vermittelte Zebrafisch-Transgenese: Ein Verfahren zur Erzeugung transgener Zebrafische nach Co-Injektion des Tol2-Systems in befruchtete Zebrafischembryonen

Beginnen Sie mit lebensfähigen, einzelligen Zebrafischembryonen, die in die Vertiefungen einer Mikroinjektionsform gelegt werden.

Beladen Sie eine Mikroinjektionsnadel mit einer Lösung, die Tol2-Transposase-kodierende mRNA und Transposon-Donor-Plasmide enthält. Die Plasmide bestehen aus einem ubiquitären Zebrafisch-Promotor und einem fluoreszierenden Protein-kodierenden Gen, das von Tol2-Transposon-Armen flankiert wird.

Injizieren Sie die Mikroinjektionslösung vorsichtig in das Zytoplasma des Zebrafischembryos. Innerhalb der Zelle werden Tol2-Transposase-mRNAs in Tol2-Transposase-Proteine übersetzt und aktiv in den Zellkern transportiert.

Tol2-Stellen auf dem Donorplasmid bestehen aus spezifischen invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs), die das Reportergen flankieren. Die ITRs werden von kurzen, direkten Rapporten flankiert. Transposase-Proteine erkennen und binden an die ITR-Stellen, wobei sie eine Haarnadel auf der flankierenden DNA bilden. Transposasen spalten das Transposon-Konstrukt weiter von der flankierenden DNA, lösen es aus dem Plasmid und hinterlassen kurze, direkte Wiederholungen.

Transposasen erzeugen einen gestaffelten Doppelstrangbruch im somatischen Zellgenom und fügen das Transposon-Konstrukt in die Genomstelle ein. Die Lückenfüllung der versetzten Enden durch DNA-Polymerase und die anschließende Ligation der Kerben erzeugen kurze, direkte Wiederholungen.

Die Ligation bewirkt eine stabile Integration des Transposon-Konstrukts in das somatische Zellgenom, und der Promotor erleichtert die Expression fluoreszierender Proteine. Inkubieren Sie die injizierten Embryonen. Während der Embryonalentwicklung entstehen aus somatischen Zellen verschiedene Zelltypen und es entstehen transgene Zebrafische.