Hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie: Eine Technik zur Trennung hydrophiler polarer Analyten mit Hilfe von hydrophilen Kügelchen

Die Hydrophile Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie, HILIC, ist eine Technik zur Trennung hydrophiler polarer Verbindungen auf der Grundlage ihres Polaritätsgrades. Beginnen Sie mit der Einrichtung einer HILIC-Säule, die mit hydrophilen Kügelchen gefüllt ist, die polare funktionelle Gruppen tragen.

Konditionieren Sie zunächst die Säule mit einem Äquilibrierungspuffer und einer mobilen Phase - einer Mischung aus organischem Lösungsmittel und Wasser. Die Puffermoleküle stabilisieren den pH-Wert, während organisches Lösungsmittel die Säule sättigt. Die Wassermoleküle immobilisieren sich und bilden eine wässrige Schicht über den hydrophilen Kügelchen.

Laden Sie die Probe, die eine Mischung aus Glykanen - hydrophilen polaren Verbindungen - enthält, die mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert sind. Führen Sie die Probe mit einem mobilen Phasengradienten mit optimaler Flussrate durch die Säule.

Während sich die Probe durch die hydrophobe mobile Phase bewegt, wandern die Glykane in die wässrige Schicht und hinterlassen die Verunreinigungen. Anschließend bewegen sich die Glykane in Richtung der polaren funktionellen Gruppen auf den Kügelchen. Hier binden mehr polare Glykane stark, während weniger polare Glykane locker binden.

Wenn die Hydrophobizität der mobilen Phase abnimmt, eluieren zuerst schwach gebundene Glykane mit geringerer Polarität und kürzerer Retentionszeit. Dagegen eluieren stark gebundene Glykane mit höherer Polarität und längerer Retentionszeit zuletzt.

Schließlich detektiert ein Detektor das Fluoreszenzsignal der eluierten Fraktionen, das den Standard-Glykan-Peaks im Chromatogramm entspricht.