Name: Eine Spin-Tip-Anreicherungsstrategie zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Lernen Sie eine duale Titan-IMAC-Methode zur gleichzeitigen Anreicherung von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe. Diese Strategie verbessert die Biomarker-Entdeckung für Diabetes und Krebs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde zum Teil durch Zuschüsse des NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 und R21AG065728) und der Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B und SRA-2016-168-S-B) unterstützt. Die hier vorgestellten Daten wurden zum Teil auch durch die Unterstützung eines NIH/NCATS UL1TR002373 Award durch das Institute for Clinical and Translational Research der University of Wisconsin gewonnen. Die Orbitrap-Instrumente wurden durch die Unterstützung eines NIH Shared Instrument Grant (NIH-NCRR S10RR029531) und des Office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education an der University of Wisconsin-Madison erworben. Wir möchten auch die großzügige Unterstützung der Organ- und Gewebespendeorganisation der University of Wisconsin anerkennen, die die menschliche Bauchspeicheldrüse für die Forschung zur Verfügung gestellt hat, und die Hilfe von Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett und Prof. Jon Odorico für die Bereitstellung der Proben für unser Labor. Unser Forschungsteam möchte sich besonders bei den Familien bedanken, die für diese Studie Taschentücher gespendet haben. L.L. würdigt den NIH-Zuschuss S10OD025084, einen Pankreaskrebs-Pilotzuschuss des Carbone Cancer Center der University of Wisconsin (233-AAI9632) sowie eine Vilas Distinguished Achievement Professorship und die Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship mit Mitteln der Wisconsin Alumni Research Foundation und der University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Es wurde die Zustimmung für die Verwendung von Pankreasgewebe für die Forschung von den nächsten Angehörigen des Verstorbenen eingeholt und eine Genehmigung des University of Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board eingeholt. Eine IRB-Aufsicht ist nicht erforderlich, da sie keine menschlichen Probanden betrifft, wie in 45 CFR 46.102 (f) anerkannt.
VORSICHT: Beim Umgang mit den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, zu denen Säuren (Ameisen, Essigsäure, Trifluoressigsäure), Basen (Ammoniumhydroxid) und Kryogene (flüssiger Stickstoff) gehören, ist Vorsicht geboten. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter für die verwendeten Reagenzien, um sich mit den damit verbundenen Gefahren und erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen vertraut zu machen. Prozentual angegebene Konzentrationen sind Volumen/Gesamtvolumen (v/v) und werden mit Wasser verdünnt.
1. Kryopulverisierung, Lyse und Proteinextraktion von Geweben
<ol><li>Füllen Sie einen Dewar mit flüssigem Stickstoff. Kühlen Sie die Teile des Gewebepulverisierers, die mit dem Pankreasgewebe in Kontakt kommen, nämlich die Kammer, der Pulverisierer und der Erholungslöffel, in einem Styroporbehälter vor.</li>
	<li>Die gefrorenen Gewebestücke in den vorgekühlten Probenhalter geben und einen Löffel flüssigen Stickstoff in das Gewebe geben.</li>
	<li>Legen Sie den Pulverisierer in die Kammer und schlagen Sie ihn fünf- bis zehnmal mit einem Schlägel an, um die Probe zu zerkleinern. Entfernen Sie den Pulverisierer aus der Kammer und kratzen Sie anhaftendes Gewebepulver und Stücke ab.</li>
	<li>Fügen Sie einen Löffel flüssigen Stickstoff in die Kammer hinzu, wenn das Gewebe zu schmelzen beginnt. Wiederholen Sie den Pulverisierungsprozess, bis die Probe ein feines Pulver ohne große Gewebebrocken ist. Portionieren Sie die Proben in ca. 100 mg Aliquots in vorgekühlte Röhrchen.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Lysepuffer vor, der 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 150 mM NaCl und 25 mM Tris (pH = 7,4) enthält. Lösen Sie jeweils eine Tablette Protease und Phosphatase-Inhibitor in 500 μL Wasser auf, um jeweils einen 20-fachen Vorrat zu erhalten. Fügen Sie das erforderliche Volumen von 20x Vorrat jedes Inhibitors zum Lysepuffer hinzu, um eine endgültige 1x-Konzentration zu erhalten.</li>
	<li>600 μL Lysepuffer pro 100 mg Gewebe in die Tube geben und bei 95 °C in einem Heizblock für 10 min mit Schütteln bei 800 U/min inkubieren. Nehmen Sie die Proben aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.</li>
	<li>Beschallen Sie die Proben mit 60 W Energie (20 kHz) für 45 s mit 15 s Impulsen mit einer Pause von 30 s dazwischen. Pelletieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
	<li>Fügen Sie den Überstand zu einem 5x Fällungslösungsmittel, 300 μL Lysepuffer zu 1,5 ml Fällungslösungsmittel hinzu, das 50% Aceton, 49,9% Ethanol und 0,1% Essigsäure enthält. Über Nacht bei -20 °C kühlen.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Proben erneut bei 3.000 x g für 15 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet, indem Sie es mit einem Spatel aufbrechen und mit der gleichen Menge an Fällungslösungsmittel mischen. Pellet erneut und wiederholen Sie den Waschschritt 2x.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das Probenpellet 15 min in einem Abzug an der Luft trocknen und bei -80 °C lagern, bis es fahrbereit ist.</li>
</ol>2. Proteinverdauung und Entsalzung
<ol><li>Resuspendiert das Proteinpellet in 300 μL frisch hergestelltem Verdauungspuffer, der 50 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) und 8 M Harnstoff enthält.</li>
	<li>Schätzen Sie die Proteinkonzentration der Lösung mit einem Proteinassay gemäß dem Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Zu dem Protein in der Lösung Dithiothreitol (DTT) zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzufügen, mischen und bei Raumtemperatur für 1 h reduzieren. Dann fügen Sie Iodacetamid (IAA) zu einer Endkonzentration von 15 mM hinzu, mischen und alkylieren Sie bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln. Quench-Alkylierung durch Wiederholung der Zugabe von DVB-T im gleichen Volumen wie zuvor und Mischen.</li>
	<li>LysC/Trypsin im Enzym:Protein-Verhältnis 1:100 zugeben und bei 37 °C für 4 h inkubieren. Dann fügen Sie 50 mM TEAB hinzu, um den 8 M Harnstoff zu verdünnen, der zur < von 1 M verwendet wird. Trypsin im Enzym:Protein-Verhältnis 1:100 hinzufügen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Quen Sie den Aufschluss unter Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) auf 0,3% v/v. Für jedes 1 mg Startprotein eine Entsalzungskartusche (1 cc, 10 mg) mit 1 ml Acetonitril (ACN) und 3x mit 1 ml 0,1% TFA konditionieren.</li>
	<li>Die verdaute Mischung auf die Entsalzungskartusche geben. Waschen Sie die Mischung 3x mit 1 ml 0,1% TFA. Wenn die Elution langsam ist, üben Sie Überdruck aus, vermeiden Sie jedoch eine Durchflussrate > einem Tropfen pro Sekunde.</li>
	<li>Eluierte Peptide mit 1 ml 60% ACN und 0,1% Ameisensäure (FA) Lösung. Trocken eluierte Peptide bei ca. 35 °C mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator, bis das Lösungsmittel vollständig verdampft ist.</li>
	<li>Resuspendieren Sie Peptide in 300 μL Wasser und schätzen Sie die Peptidkonzentrationen mit einem Peptidassay gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die Peptide in 500 μg Aliquots portionieren und vollständig trocknen.</li>
</ol>3. ERLIC N-Glykopeptid-Anreicherung
HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.
<ol><li>Wiegen Sie ca. 3 mg Watte und verpacken Sie sie in eine leere 200 μL Pipettenspitze (Schleuderspitze; siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Starkes Anionenaustausch-Anreicherungsmaterial in ein Röhrchen überführen und 200 μL 0,1% TFA pro 10 mg Material hinzufügen. Zur Anreicherung von 500 μg Peptiden verwenden Sie 15 mg des Materials. Aktivieren Sie das Material durch Schütteln für 15 min.</li>
	<li>Legen Sie die Spinspitze mit einem Schlauchadapter über ein 2-ml-Röhrchen und fügen Sie der Spitze genügend Aufschlämmung für 15 mg Material hinzu. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie sie in einer Tischzentrifuge drehen.</li>
	<li>Konditionieren Sie das Material, indem Sie 3x mit 200 μL ACN zentrifugieren. Wiederholen Sie die dreifache Konditionierung mit 100 mM Ammoniumacetat (NH4Ac), 1% TFA und 80% ACN/0,1% TFA (Ladepuffer).</li>
	<li>Resuspendieren Sie 500 μg Peptidproben in etwa 200 μL Ladepuffer und fließen Sie durch die Spinspitze. Laden Sie den Durchfluss 2x nach, um eine vollständige Bindung zu gewährleisten.</li>
	<li>Waschen Sie das Material, indem Sie 5x mit 200 μL 80% ACN/0,1% TFA zentrifugieren und dann 2x mit 200 μL 80% ACN/0,1% FA.</li>
	<li>Eluieren Sie die Peptide durch Zentrifugieren mit jeweils 200 μL: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).</li>
	<li>Waschen Sie das Material, indem Sie 2x mit 200 μL 80% ACN/5% NH4OH zentrifugieren. Eluieren Sie die restlichen Peptide mit 200 μL 10% NH4OH (E5).</li>
	<li>Trocknen Sie alle Elutien vollständig mit einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator bei ca. 35 °C.</li>
	<li>Entsalzen Sie die Grundelution (E5) mit einer Entsalzungsspitze gemäß dem Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Die Elution von der Entsalzungsspitze mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator bei ca. 35 °C bis zur Vollständigkeit trocknen.</li>
</ol>4. Ti(IV)-IMAC Phosphopeptid-Anreicherung
HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.
<ol><li>Wiegen Sie ca. 3 mg Watte und packen Sie sie in eine leere 200 μL Pipettenspitze (Spin-Tip).</li>
	<li>Ti-IMAC Phosphopeptid-Anreicherungsmaterial in ein Röhrchen überführen und 200 μL 0,1% TFA pro 10 mg Material hinzufügen. Zur Anreicherung von 500 μg Peptiden verwenden Sie 10 mg Material.</li>
	<li>Legen Sie die Schleuderspitze mit einem Röhrchenadapter über ein 2-ml-Röhrchen und fügen Sie der Spitze genügend Aufschlämmung für 10 mg Material hinzu. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie sie in einer Tischzentrifuge drehen.</li>
	<li>Konditionieren Sie das Material mit 200 μL 40% ACN/3% TFA unter Verwendung der gleichen Zentrifugeneinstellungen wie oben beschrieben. Resuspendieren Sie Peptidproben in 200 μL von 40% ACN / 3% TFA und fließen Sie durch die Spin-Spitze. Laden Sie den Durchfluss zweimal nach, um eine vollständigere Bindung zu gewährleisten.</li>
	<li>Waschen Sie das Material durch Zentrifugieren mit 200 μL 50% ACN, 6% TFA und 200 mM NaCl-Lösung, gefolgt von 2x in 200 μL 30% ACN und 0,1% TFA-Lösung.</li>
	<li>Elute Peptide mit 200 μL von 10% NH 4 OH. Trocknen Sie die Elution vollständig unter Vakuum. Führen Sie die Entsalzung mit einer Entsalzungsspitze gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Trocknen Sie die Elution von der Entsalzungsspitze unter Vakuum bis zur Vollständigkeit.</li>
</ol>5. Dual-funktionelle Ti(IV)-Simultananreicherung
HINWEIS: Die genauen Zentrifugengeschwindigkeiten und -zeiten können je nach Probe variieren und müssen optimiert werden. Im Allgemeinen sind 300 x g für 2 min für die Konditionierung und das Waschen des Materials und 100 x g für 5 min für die Elutierung geeignet.
<ol><li>Wiegen Sie etwa 3 mg Watte und packen Sie sie in eine leere Schleuderspitze.</li>
	<li>Übertragen Sie ca. 1 g Ti(IV)-IMAC-Material in ein Röhrchen. Zugabe von 0,1 % TFA zu einer bekannten Materialkonzentration, z. B. 20 mg/200 μL (Material kann in dieser Suspension bei 4 °C gelagert werden).</li>
	<li>Für die Anreicherung von 500 μg Peptiden fügen Sie genügend Aufschlämmung zu einer Spin-Spitze hinzu, um 20 mg Material zu übertragen. Waschen Sie die Schleuderspitze durch Zentrifugieren mit 200 μL 0,1% TFA.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Proben in 200 μL Lade-/Waschlösungsmittel (80% ACN und 3% TFA) und fließen Sie durch die Schleuderspitze. Laden Sie den Durchfluss 2x neu.</li>
	<li>Waschen Sie die Schleuderspitze 6x durch Zentrifugieren mit 200 μL Lade-/Waschlösungsmittel. Waschen Sie die Schleuderspitze mit 200 μL 80% ACN/0,1% FA-Lösung.</li>
	<li>Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL von den folgenden: 60% ACN/0,1% FA (E1) und 40% ACN/0,1% FA (E2). Analysieren Sie jede Elution separat.</li>
	<li>Eluten Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden Punkte: 20% ACN/0,1% FA und 0,1% FA. Kombinieren Sie die beiden Elutionen und analysieren Sie sie als eine Probe (E3).</li>
	<li>Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden: 40% ACN/3% TFA; 50 % ACN/6 % TFA, 200 mM NaCl; und 30 % ACN/0,1 % TFA. Kombinieren Sie diese Elionen und analysieren Sie sie nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze als eine (E4).</li>
	<li>Konditionieren Sie das Material auf den basischen pH-Wert mit 200 μL 90% ACN/2,5% NH4OH für 3x. Entsorgen Sie diese Wäschen.</li>
	<li>Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL: 60% ACN/10% NH 4 OH (E5) und 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analysieren Sie diese Elutien separat nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze.</li>
	<li>Eluieren Sie die Peptide mit jeweils 200 μL der folgenden: 20% ACN/10% NH4OH; 10 % ACN/10 % NH4OH; und 10% NH4 OH. Kombinieren Sie diese Elutien und analysieren Sie sie nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze als eine (E7).</li>
	<li>Trocknen Sie alle Elutien vollständig unter Vakuum.</li>
</ol>6. Nano-Flow-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (nRPLC-MS)
HINWEIS: MS-Datenerfassungs- und Analysemethoden sind vielfältig, und daher wird hier in den folgenden Schritten nur eine vorgeschlagene LC-MS-Pipeline (und die damit verbundenen Parameter) beschrieben. Proben, die unter Verwendung der zuvor beschriebenen Probenvorbereitungs- und Anreicherungsschritte erzeugt wurden, können mit anderen instrumentellen Aufbauten, einschließlich der Verwendung kommerziell erhältlicher chromatographischer Säulen, bei ausreichender Datenqualität analysiert werden.
<ol><li>Ziehen und verpacken Sie eine 15 cm lange Kapillare (75 μm Innendurchmesser) mit C18-Material, wie in19 beschrieben. Bereiten Sie die mobile Phase A (0,1% FA in Wasser) und die mobile Phase B (0,1% FA in ACN) vor.</li>
	<li>Rekonstituieren Sie angereicherte Peptidproben in 15 μL von 3% mobiler Phase B. Laden Sie 2 μL der Probe (~13% Probenvolumen) direkt auf die Säule. Analysieren Sie jede Probe im technischen Duplikat.</li>
	<li>Elute Peptide mit einem Gradienten von 3% bis 30% mobiler Phase B über 90 min bei einer Durchflussrate von 0,3 μL/min. Waschen Sie die Säule mit 75% B für 8 Minuten, gefolgt von 95% B für 8 min, und beenden Sie die Methode mit einer Gleichgewichtung bei 3% B für 12 min.</li>
	<li>Betrieb des Massenspektrometers im positiven Ionenmodus durch datenabhängige Erfassung der Top-20-Peaks mit folgenden Parametern: Sprühspannung 2 kV; MS1-Erkennung in LC/MS von 400-2.000 m/z bei 120.000 Auflösung, 2E5 Automatic Gain Control (AGC) Target, 100 ms maximale Einspritzzeit, 30% HF-Linse, Quadrupolisolierung mit 1,6 m/z Fenster, für Ladezustände 2-8 und unbestimmt und 30 s dynamischer Ausschluss; MS2-Detektion im LC/MS unter Verwendung einer abgestuften HCD-Fragmentierung bei 22 %, 30 % und 38 %, einer festen ersten Masse von 120 m/z bei einer Auflösung von 30.000, einem 5E4-AGC-Ziel und einer Mindestintensität von 2,5E4.</li>
</ol>7. MS-Datenanalyse
HINWEIS: Eine Datenanalyse-Pipeline mit zwei verschiedenen Softwares zur Analyse desselben Datensatzes wird hier vorgestellt. Phosphorylierung und Glykosylierung können gleichzeitig mit einer einzigen Software anstelle von zwei separaten Software, wie hier beschrieben, durchsucht werden, obwohl im Allgemeinen die Softwaresuchzeit proportional zum Suchraum ist, d. H. Anzahl der betrachteten PTMs. Aus diesem Grund werden parallel zur Suche nach Glykopeptiden und Phosphopeptiden zwei verschiedene Software eingesetzt.
<ol><li>Verarbeiten Sie Rohdatendateien mit der entsprechenden Software (siehe Materialverzeichnis).<ol>
<li>Suche nach Spektren in der UniProt Humandatenbank (oder einer geeigneten artspezifischen) Datenbank. Setzen Sie die Carbamidomethylierung von Cys als feste Modifikation. Legen Sie die maximale Anzahl der verpassten enzymatischen Spaltungen auf zwei fest.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suchen Sie in den Rohdatendateien mit einer kommerziellen Software (siehe Tabelle der Materialien) nach Glykopeptiden, dieanalysiert werden sollen 20. Verwenden Sie eine Vorläufermassentoleranz von 10 ppm und eine Fragmentmassentoleranz von 0,01 Da mit einer minimalen Peptidlänge von vier Resten.<ol>
<li>Suchen Sie mit der in die Software eingebetteten N-Glykan-Datenbank, die um typische Mannose-6-phosphat(M6P)-Glykane erweitert wurde, einschließlich HexNAc(2)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Phospho(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Phospho(1) und HexNAc(3)Hex(3-4)Phospho(1).</li>
		<li>Setzen Sie die N-Glykosylierung als übliche Modifikation. Legen Sie die maximalen Gesamtmodifikationen pro Peptid-Spektralübereinstimmung (PSM) als eine häufige und zwei seltene fest.</li>
		<li>Legen Sie die folgenden variablen Modifikationen fest: Oxidation von Met (selten), Deamidation bei Asn und Gln (selten) und Phosphorylierung bei Ser, Thr und Tyr (häufig). Legen Sie die folgenden Identifikationsfilter fest: Score-Cutoff-> 150, |Log-Prob| > 1 und Delta Mod > 10.</li>
		<li>Exportieren und analysieren Sie Suchergebnisse auf den Registerkarten Proteine und Peptidgruppe.</li>
		<li>Scannen Sie die Identifikationen, die M6P-Glykane enthalten, manuell auf das Vorhandensein des PhosphoHex-Oxoniumions (243 m/z) in den MS/MS-Spektren und entfernen Sie falsch positive Identifikationen, die dieses diagnostische Ion nicht enthalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suchen Sie in den Rohdatendateien mit einer Open-Source-Software (siehe Materialverzeichnis) nach Phosphopeptiden, die analysiert werdensollen 21. Verwenden Sie eine Peptidtoleranz von 20 ppm für die erste Suche und eine Peptidtoleranz von 4,5 ppm für die Hauptsuche.<ol>
<li>Setzen Sie die maximale Anzahl von Modifikationen pro Peptid auf 5. Setzen Sie die PSM- und Protein-False-Discovery-Rate (FDR) auf 1% und die minimale Peptidlänge auf 7 Reste.</li>
		<li>Legen Sie variable Modifikationen wie Oxidation bei Met, N-terminale Proteinacetylierung und Phosphorylierung bei Ser, Thr und Tyr fest. Analysieren Sie Suchergebnisse mit den modificationSpecificPeptides-Dateien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die Anzahl der Identifizierungen von PTMs auf Protein-, Peptid- und Modifikationsstellenebene.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, L. M., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteoform%3A+a+single+term+describing+protein+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteoform: a single term describing protein complexity.</a> Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).</li>
<li>Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+and+glycoproteomics+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).</li>
<li>Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mass+spectrometry-based+glycomic+and+glycoproteomic+studies+of+pancreatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases.</a> Frontiers in Chemistry. 9, 707387(2021).</li>
<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+post-translational+modification+statistics%3A+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90(2011).</li>
<li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic-interaction+chromatography+for+the+separation+of+peptides%2C+nucleic+acids+and+other+polar+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds.</a> Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).</li>
<li>Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pragmatic+guide+to+enrichment+strategies+for+mass+spectrometry-based+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029(2020).</li>
<li>Low, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widening+the+bottleneck+of+phosphoproteomics%3A+Evolving+strategies+for+phosphopeptide+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment.</a> Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).</li>
<li>Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+workflow+for+simultaneous+analyses+of+phosphopeptides+and+glycopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides.</a> ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+workflow+for+global%2C+glyco-%2C+and+phospho-proteomic+analysis+of+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).</li>
<li>Tang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+preparation+of+bifunctional+adsorbents+for+efficiently+enriching+N-glycopeptides+and+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides.</a> Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).</li>
<li>Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promising+nanoprobe+based+on+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+and+immobilized+metal+affinity+chromatography+for+capture+of+glycopeptides+and+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides.</a> Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).</li>
<li>Glover, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intact+sialylated+glycopeptides+and+phosphorylated+glycopeptides+from+IMAC+enriched+samples+by+EThcD+fragmentation%3A+Toward+combining+phosphoproteomics+and+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).</li>
<li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+repulsion+hydrophilic+interaction+chromatography+for+isocratic+separation+of+charged+solutes+and+selective+isolation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterion+optimization+dramatically+improves+selectivity+for+phosphopeptides+and+glycopeptides+in+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography.</a> Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sweet+spot+in+ERLIC+mobile+phase+for+simultaneous+enrichment+of+N-Glyco+and+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).</li>
<li>Tabang, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+extracellular+matrix+protein+post-translational+modifications+via+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry.</a> Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+Titanium%28IV%29+immobilized+metal+affinity+chromatography+approach+for+enabling+large-scale+profiling+of+protein+Mannose-6-Phosphate+glycosylation+and+revealing+its+predominant+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+Ti%28IV%29-IMAC+material+enables+simultaneous+enrichment+and+separation+of+diverse+glycopeptides+and+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).</li>
<li>Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+packing+high+resolution+C18+RP-nano-HPLC+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380(2021).</li>
<li>Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Byonic%3A+advanced+peptide+and+protein+identification+software%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Byonic: advanced peptide and protein identification software.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Perez-Riverol, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PRIDE+database+and+related+tools+and+resources+in+2019%3A+improving+support+for+quantification+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data.</a> Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metascape+provides+a+biologist-oriented+resource+for+the+analysis+of+systems-level+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets.</a> Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).</li>
<li>Zacharias, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HILIC+and+ERLIC+enrichment+of+glycopeptides+derived+from+breast+and+brain+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+enrichment+methods+for+intact+N-+and+O-linked+glycopeptides+using+strong+anion+exchange+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography.</a> Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).</li>
<li>Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPQuest%3A+A+spectral+library+matching+algorithm+for+site-specific+assignment+of+tandem+mass+spectra+to+intact+N-glycopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides.</a> Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).</li>
<li>Liu, M. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGlyco+2.0+enables+precision+N-glycoproteomics+with+comprehensive+quality+control+and+one-step+mass+spectrometry+for+intact+glycopeptide+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification.</a> Nature Communications. 8 (1), 438(2017).</li>
<li>Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-Pair+Search+with+MetaMorpheus+for+O-glycopeptide+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization.</a> Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).</li>
<li>Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-heterogeneity%3A+Evaluating+and+describing+the+diversity+in+glycosylation+between+sites+on+the+same+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010(2021).</li>
<li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+histone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The language of histone crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+post-translational+modification+crosstalk+with+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129(2021).</li>
<li>Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+O-GlcNAcylation+and+phosphorylation%3A+Roles+in+signaling%2C+transcription%2C+and+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Die dual-funktionelle Ti(IV)-IMAC-Strategie ist nützlich für die gleichzeitige Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus derselben Probe in einem einzigen Probenvorbereitungs-Workflow. Es wurde auch gezeigt, dass ERLIC-basierte Methoden eine gleichzeitige Anreicherung von PTMs durchführen. Beide Strategien wurden zuvor für Deep Coverage in PTM-Analyseneingesetzt 14,18. Durch die Anpassung der dualen Ti-Methode an die Verkürzung der Probeninkubationszeit...

Protein-posttranslationale Modifikationen (PTMs) spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation von Proteinstrukturen und damit ihrer Funktionen und nachgelagerten biologischen Prozesse. Die Vielfalt des menschlichen Proteoms nimmt aufgrund der kombinatorischen Variabilität verschiedener PTMs exponentiell zu. Verschiedene Varianten von Proteinen aus ihren kanonischen Sequenzen, wie sie vom Genom vorhergesagt werden, werden als Proteoformen bezeichnet, und viele Proteoformen entstehen ausPTMs 1. Die Untersuchung der proteoformen Vielfalt in Gesundheit und Krankheit ist in den letzten Jahren zu einem Forschungsgebiet von großem Interessegeworden 2,3.
Das Studium von Proteoformen und insbesondere von PTMs mit großer Tiefe ist durch die Entwicklung von auf Massenspektrometrie (MS) basierenden Proteomikmethoden einfacher geworden. Mit MS werden Analyten ionisiert, fragmentiert und basierend auf dem m/z von Fragmenten identifiziert. Anreicherungsmethoden sind aufgrund der geringen relativen Häufigkeit von PTMs im Vergleich zu nicht modifizierten Formen von Proteinen oft notwendig. Obwohl die Analyse intakter Proteine und ihrer PTMs, die sogenannten Top-Down-Analysen, routinemäßiger geworden sind, ist die enzymatische Verdauung von Proteinen und die Analyse ihrer Komponentenpeptide in Bottom-up-Analysen immer noch der am weitesten verbreitete Weg für die PTM-Analyse. Die beiden am häufigsten untersuchten PTMs und die beiden häufigsten PTMs in vivo sind Glykosylierung und Phosphorylierung4. Diese beiden PTMs spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und -erkennung und sind daher wichtige Modifikationen, die in der Krankheitsforschung charakterisiert werden müssen.
Die chemischen Eigenschaften verschiedener PTMs bieten oft Wege zur Anreicherung dieser PTMs auf Protein- und Peptidebene vor der Analyse. Die Glykosylierung ist ein hydrophiles PTM aufgrund der Häufigkeit von Hydroxylgruppen auf jedem Monosaccharid. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um Glykopeptide in der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) anzureichern, die mehr hydrophile Glykopeptide von den hydrophoben, nicht modifizierten Peptidentrennen können 5. Die Phosphorylierung fügt den Phosphatanteil hinzu, der außer bei saurem pH-Wert negativ geladen ist. Aufgrund dieser Ladung können verschiedene Metallkationen, einschließlich Titan, verwendet werden, um Phosphopeptide anzuziehen und zu binden, während nicht phosphorylierte Spezies weggespült werden. Dies ist das Prinzip der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC). Weitere Erörterungen dieser und anderer Anreicherungsstrategien für Glykosylierung und Phosphorylierung finden sich in den letzten Reviews 6,7.
Vergleichsweise große Mengen an Ausgangspeptidmaterial (0,5 mg oder mehr) werden aufgrund der geringen Stöchiometrie von PTMs an Peptiden häufig für Anreicherungsprotokolle benötigt. In Szenarien, in denen diese Probenmenge möglicherweise nicht leicht gewonnen werden kann, wie z. B. Tumorkernbiopsie oder Liquoranalysen, ist es vorteilhaft, einfache Arbeitsabläufe zu verwenden, die zu maximalen biomolekularen Informationen führen. Jüngste Strategien, die von unserem Labor und anderen entwickelt wurden, haben die gleichzeitige und parallele Analyse von Glykosylierung und Phosphorylierung unter Verwendung desselben PTM-Anreicherungsworkflows 8,9,10,11,12 hervorgehoben. Obwohl sich die chemischen Eigenschaften dieser beiden PTMs unterscheiden können, können diese PTMs aufgrund der innovativen Trenntechniken und verwendeten Materialien in mehreren Schritten analysiert werden. Zum Beispiel überlagert die elektrostatische Abstoßungs-hydrophile Wechselwirkungschromatographie (ERLIC) Trennungen basierend auf hydrophilen Wechselwirkungen zwischen Analyten und der mobilen Phase mit Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen zwischen Analyten und dem stationären Phasenmaterial13,14,15,16. Bei saurem pH-Wert kann die Anziehung phosphorylierter Peptide in die stationäre Phase ihre Retention und Trennung von nicht modifizierten Peptiden verbessern. Material, das aus Ti(IV) besteht, das auf hydrophilen Mikrosphären immobilisiert ist, kann für HILIC- und IMAC-basierte Elution verwendet werden, um Phosphopeptide und neutrale, saure und Mannose-6-phosphorylierte Glykopeptide17,18 zu trennen. Diese Strategie wird als dual-funktionales Ti(IV)-IMAC bezeichnet. Die Verwendung dieser Strategien zur Anreicherung mehrerer PTMs in einem einzigen Workflow kann Analysen potenzieller PTM-Crosstalk-Interaktionen zugänglicher machen. Darüber hinaus sind die Gesamtprobenmenge und der Zeitaufwand geringer als bei den herkömmlichen Anreicherungsmethoden, wenn sie parallel durchgeführt werden (d. h. HILIC und IMAC auf separaten Probenaliquoten).
Um die dual-funktionelle Ti(IV)-IMAC-Strategie für die gleichzeitige Analyse von Proteinglykosylierung und Phosphorylierung zu demonstrieren, haben wir sie zur Analyse von postmortalem menschlichem Pankreasgewebe angewendet. Die Bauchspeicheldrüse produziert sowohl Verdauungsenzyme als auch regulatorische Hormone, einschließlich Insulin und Glucagon. Die Pankreasfunktion ist bei Bauchspeicheldrüsenerkrankungen beeinträchtigt. Bei Diabetes ist die Regulierung des Blutzuckers betroffen, was zu höheren Glukosespiegeln im Blut führt. Bei Pankreatitis resultiert eine Entzündung aus der Autoverdauung desOrgans 3. Veränderungen der PTM-Profile, einschließlich Glykosylierung und Phosphorylierung, können, wie es oft der Fall ist, bei anderen Krankheiten auftreten.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine Spin-Tip-basierte simultane Anreicherungsmethode, basierend auf einer dual-funktionellen Ti(IV)-IMAC-Strategie, für N-Glykopeptide und Phosphopeptide, die aus Proteinen gewonnen werden, die aus Pankreasgewebe extrahiert werden. Das Protokoll umfasst Proteinextraktion und -verdauung, Anreicherung, MS-Datenerfassung und Datenverarbeitung, wie in Abbildung 1 dargestellt. Repräsentative Daten aus dieser Studie sind über das ProteomeXchange-Konsortium mit der Kennung PXD033065 verfügbar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63735/63735fig01.jpg"> Abbildung 1: Workflow zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus humanem Pankreasgewebe. Gewebe werden zunächst vor der Proteinextraktion mit dem Waschmittel Natriumdodecylsulfat (SDS) zu einem feinen Pulver pulverisiert. Proteine werden dann einer enzymatischen Verdauung unterzogen. Die resultierenden Peptide werden vor der Anreicherung mit dual-funktionellem Ti(IV)-IMAC aliquotiert. Die Rohdaten werden mittels nanoskaliger Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (nRPLC-MS) gesammelt und mit Hilfe einer Datenbanksuchsoftware analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63735/63735fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Dieses Protokoll soll PTM-Analysen zugänglicher machen und eine umfassendere Analyse mehrerer PTMs im selben Workflow ermöglichen. Dieses Protokoll kann auf andere komplexe biologische Matrizen, einschließlich Zellen und Bioflüssigkeiten, angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure, Eissäure (ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Aceton (ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, Optima LC/MS-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat (kristallin/ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid (ACS Plus-zertifiziert))</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669-212</td><td></td></tr><tr><td>Byonic Software</td><td>Protein Metrics</td><td>n/a</td><td>Kommerzielle Software für die glykoproteomische Analyse (https://proteinmetrics.com/byos/)</td></tr><tr><td>C18 BEH-Material</td><td>Wasser</td><td>186002353 Material,</td><td>das aus der Säule entnommen und zum Verpacken von Nanokapillaren verwendet wird (gezogen, um die Spitze zu integrieren, die direkt in einer Linie mit dem Instrumenteneingang verwendet wird)</td></tr><tr><td>CAE-Ti-IMAC, 100%</td><td>J& K Scientific</td><td>2749380-1G</td><td>Material für dual-funktionelles Ti(IV)-IMAC; kann auch für konventionelle IMAC/konventionelle Phosphopeptid-Anreicherung verwendet</td></tr><tr><td>werden Cellcrusher-Kit</td><td>Cellcrusher n</td><td>/a</td><td>Wird zum Mahlen von Gewebeproben zu Pulver vor der Extraktion verwendet</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R Mikrozentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-205</td><td>Für temperaturkontrollierte Zentrifugation</td></tr><tr><td>cOmplete Proteasehemmer Cocktailtabletten</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Molekulare Qualität (DL-Dithiothreitol)</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td>Proteinreduktionsmittel</td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof (100%), USP</td><td>Fisher</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Analoger Vortex-Mischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Retention (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Retention (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Modell 120 Schalldämpfer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Für die Probenanalyse mittels Ultraschall</td></tr><tr><td>Ameisensäure, 99,0+%, Optima LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Quarzglaskapillare (75 &mu; m Innendurchmesser, 360 &mu; m Außendurchmesser)</td><td>Polymicro Technologies LLC</td><td>100 m TSP075375</td><td>Für hauseigene gezogene und gepackte Säulen mit integriertem Emitter</td></tr><tr><td>Flusssäure (48 Gew.-% in H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339261-100ML</td><td>Wird zum Öffnen des Emitters einer gezogenen Kapillarsäule</td></tr><tr><td>verwendet Iodacetamid, BioUltra</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td>Proteinreduktionsreagenz</td></tr><tr><td>MaxQuant software</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Kostenlose Software für die phosphoproteomische Analyse (https://www.maxquant.org/)</td></tr><tr><td>Multithermer Shaker mit Heizung und Kühlung</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td>Heizblock</td></tr><tr><td>Oasis HLB 1 cc Vac Kartusche, 10 mg Sorptionsmittel pro Kartusche, 30 & Mikro; m, 100/pk</td><td>Wasser</td><td>186000383</td><td>Großflächige Kartuschenentsalzung für tryptische Aufschlüsse (Ladekapazität ca. bis zu 1 mg pro Stück)</td></tr><tr><td>OMIX C18 Pipettenspitzen, 100 & Mikro; L-Spitze, 10 - 100 &mu; L-Elutionsvolumen, 1 x 96</td><td>Spitzen Agilent</td><td>A57003100</td><td>Kleinere gepackte Pipettenspitze zum Entsalzen für Anreicherungselutionen</td></tr><tr><td>P-2000 Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000/F</td><td>Zum Ziehen von Nanokapillarsäulen für LC-MS</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase-Inhibitor-Tabletten</td><td>Sigma</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Quantitativer kolorimetrischer Peptid-Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>PolySAX LP (12 &mu; m, Porengröße 300 & Aring;)</td><td>PolyLC</td><td>BMSX1203</td><td>Material für die Stark-Anionenaustausch-Chromatographie zur Anreicherung von ERLIC/konventionellen Glykopeptiden</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Monobasisch (kristallin/ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Druckinjektionszelle mit integrierter magnetischer Rührplatte</td><td>Next Advance</td><td>PC77-MAG</td><td>Zum Verpacken von Nanokapillarsäulen mit stationärer Phase bis zu einem Grenzwert</td></tr> <tr><td>von 2500 psiProteome Discoverer-Software</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Kommerzielle Software für die Proteomik-Analyse (mit integrierten Datenbank-Suchsoftware-Knoten) und Datenvisualisierung (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)</td></tr><tr><td>SpeedVac SC110 Vakuumkonzentrator Modell SC110-120</td><td>Savant</td><td>n/a</td><td>Zentrifugal-Vakuumkonzentrator zum Trocknen von Proben (unter Hitze)</td></tr><tr><td>SDS-Lösung, 10%ige Natriumdodecylsulfatlösung, Molekularbiologie/Elektrophorese</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2436200</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzierqualität modifiziertes Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (kristallin/ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>TopTip, Leer, 10-200 & Mikro; L, Packung mit 96</td><td>Stück Glygen Corporation</td><td>TT2EMT.96</td><td>Leere Pipettenspitze mit mikrometergroßem Loch, die zum Verpacken von chromatographischem Material für Anreicherungen verwendet werden kann, gebündelt mit Röhrchenadaptern</td></tr><tr><td>Triethylammoniumbicarbonat-Puffer (TEAB, 1 M, pH 8,5 (flüchtig))Sigma</td><td></td> <td>90360-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure, Reagenzqualität, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>60-017-61</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base (weiße Kristalle oder kristallines Pulver/Molekularbiologie)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C-Mix, Massenspektrometrie</td><td>Promega</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff (ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-500</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, Optima LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>W64</td><td></td></tr></tbody></table>

eine spin-tip-anreicherungsstrategie zur simultanen analyse von n-glykopeptiden und phosphopeptiden aus menschlichem bauchspeicheldrüsengewebe

A Spin-Tip Enrichment Strategy for Simultaneous Analysis of N-Glycopeptides and Phosphopeptides from Human Pancreatic Tissues

Die Massenspektrometrie kann eine tiefe Abdeckung der posttranslationalen Modifikationen (PTMs) liefern, obwohl eine Anreicherung dieser Modifikationen aus komplexen biologischen Matrizen aufgrund ihrer geringen Stöchiometrie im Vergleich zu nicht modifizierten Analyten oft erforderlich ist. Die meisten Anreicherungs-Workflows von PTMs auf Peptiden in Bottom-up-Proteomik-Workflows, bei denen Proteine enzymatisch verdaut werden, bevor die resultierenden Peptide analysiert werden, reichern nur eine Art von Modifikation an. Es ist jedoch das gesamte Komplement von PTMs, das zu biologischen Funktionen führt, und die Anreicherung einer einzigen Art von PTM kann ein solches Übersprechen von PTMs übersehen. PTM-Übersprechen wurde zwischen Proteinglykosylierung und Phosphorylierung beobachtet, den beiden häufigsten PTMs in menschlichen Proteinen und auch den beiden am meisten untersuchten PTMs unter Verwendung von Massenspektrometrie-Workflows. Unter Verwendung der hier beschriebenen simultanen Anreicherungsstrategie werden beide PTMs aus postmortalem menschlichem Pankreasgewebe, einer komplexen biologischen Matrix, angereichert. Die dual-funktionelle Ti(IV)-immobilisierte Metallaffinitätschromatographie wird verwendet, um verschiedene Formen der Glykosylierung und Phosphorylierung gleichzeitig in mehreren Fraktionen in einer bequemen Spinspitzen-basierten Methode zu trennen, die nachgelagerte Analysen potenzieller PTM-Crosstalk-Wechselwirkungen ermöglicht. Dieser Anreicherungs-Workflow für Glyko- und Phosphopeptide kann auf verschiedene Probentypen angewendet werden, um eine tiefe Profilierung mehrerer PTMs zu erreichen und potenzielle Zielmoleküle für zukünftige Studien zu identifizieren.

Repräsentative Massenspektrometriedaten, einschließlich Rohdateien und Suchergebnisse, wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD03306522 an das ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.
In dieser Arbeit wurden doppelte Injektionsreplikate für jede Anreicherungselution analysiert. Identifikationen aus beiden technischen Replikaten wurden in der Endanalyse zusammengetragen. Aufgrund der semi-stochastischen Natur der datenabhängigen Erfass...

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) verändern Proteinstrukturen und -funktionen. Methoden zur gleichzeitigen Anreicherung mehrerer PTM-Typen können die Abdeckung in Analysen maximieren. Wir präsentieren ein Protokoll mit dual-funktioneller Ti(IV)-immobilisierter Metallaffinitätschromatographie, gefolgt von Massenspektrometrie zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse der Protein-N-Glykosylierung und Phosphorylierung in Pankreasgeweben.

Eine Spin-Tip-Anreicherungsstrategie zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological ...

Die dual-funktionelle Titan-immobilisierte Metallaffinitätschromatographie-Strategie kann sowohl N-Glykopeptide als auch Phosphopeptide im selben Workflow anreichern und die biomolekularen Informationen aus derselben Analyse erhöhen. Der Hauptvorteil dieser Anreicherung sind zwei Trennmechanismen, die die gleichzeitige Trennung von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden in getrennten Fraktionen für die nachgeschaltete Massenspektrometrieanalyse ermöglichen. Die Verwendung dieser Anreicherungsmethode kann den Nachweis von Glykosylierung und Phosphorylierung in komplexen biologischen Proben wie Bauchspeicheldrüsengewebe für die Entdeckung von Krankheitsbiomarkern wie Diabetes und Krebs verbessern.Da diese Methode auf Spinspitzen und Zentrifugation beruht, ist es wichtig, die Zentrifugationsgeschwindigkeit zu kontrollieren und sicherzustellen, dass die Proben frei von Partikeln sind, um Verstopfungen zu vermeiden. Um zu beginnen, kühlen Sie die Teile des Gewebepulverisierers, die mit dem Pankreasgewebe in Kontakt kommen, nämlich die Kammer, der Pulverisierer und der Erholungslöffel, zusammen mit allen Spateln, in einem Styroporbehälter vor. Als nächstes geben Sie Gewebestücke in den vorgekühlten Probenhalter und fügen dem Gewebe einen flüssigen Stickstoff hinzu, bis sie gefroren sind.Nachdem Sie den Pulverisierer in die Kammer gelegt haben, schlagen Sie ihn fünf- bis zehnmal mit einem Hammer, um die Probe zu zerkleinern, entfernen Sie dann den Pulverisierer aus der Kammer und kratzen Sie anhaftendes Gewebepulver und Stücke ab. Als nächstes fügen Sie einen Löffel flüssigen Stickstoff in die Kammer hinzu, wenn das Gewebe zu schmelzen beginnt, und wiederholen Sie den Pulverisierungsprozess, bis ein feines Pulver erhalten ist, und portionieren Sie die Proben in etwa 100-Milligramm-Aliquots in vorgekühlte Röhrchen. Nach der Herstellung des Lysepuffers lösen Sie je eine Tablette Protease- und Phosphataseinhibitor in 500 Mikrolitern Wasser auf, um einen Vorrat von 20 Mal der gewünschten Endkonzentration zu erhalten, und fügen Sie dem Lysepuffer das erforderliche Volumen jedes Inhibitors hinzu, um die endgültigen Inhibitorkonzentrationen zu erreichen.Nach Zugabe von 600 Mikrolitern Lysepuffer in das Röhrchen bei 95 Grad Celsius im Heizblock 10 Minuten lang mit Schütteln bei 800 U/min inkubieren, dann die Proben aus dem Heizblock nehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Als nächstes beschallen Sie die Proben mit 60-Watt-Energie für 45 Sekunden, verwenden Sie 15-Sekunden-Impulse mit einer 30-Sekunden-Pause dazwischen, und pelletieren Sie die Proben bei 3000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Fügen Sie den Überstand dem Fünffachen seines Volumens an Fällungslösungsmittel hinzu.Zum Beispiel werden 300 Mikroliter Lysepuffer auf 1,5 Milliliter Fällungslösungsmittel mit 50% Aceton, 49,9% Ethanol und 0,1% Essigsäure gepuffert und dann über Nacht bei 80 Grad Celsius gekühlt. Pelletieren Sie die Proben erneut bei 3000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand, dann waschen Sie das Pellet, indem Sie es mit einem Spatel aufbrechen und mit der gleichen Menge an Fällungslösungsmittel mischen. Nach dem Zentrifugieren das Probenpellet 15 Minuten lang in einem Abzug an der Luft trocknen und bei 80 Grad Celsius lagern, bis es fertig ist.Zuerst suspendieren Sie das Proteinpellet in 300 Mikrolitern frisch hergestelltem Verdauungspuffer, der 50 Millimolar Triethylammoniumbicarbonatpuffer und acht molaren Harnstoff enthält. Fügen Sie dem Protein in Lösung Dithiothreitol zu einer Endkonzentration von fünf Millimolaren hinzu, mischen und reduzieren Sie es bei Raumtemperatur für eine Stunde, dann fügen Sie Jodoacetamid zu einer Endkonzentration bei 15 Millimolaren hinzu. Mischen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln alkylieren.Als nächstes fügen Sie Lys-C / Trypsin bei einem Enzym-zu-Protein-Verhältnis von 1 zu 100 hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator für vier Stunden, dann fügen Sie 50 millimolaren Triethylammonium-Bicarbonat-Puffer hinzu, um den acht molaren Harnstoff, der verwendet wird, auf weniger als einen Molar zu verdünnen. Nach Zugabe von Trypsin bei einem Enzym-zu-Protein-Verhältnis von 1 zu 100 über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator inkubieren und anschließend die Verdauung unter Zugabe von Trifluoressigsäure abschrecken. Für jedes Milligramm Startprotein eine Entsalzungskartusche mit einem Milliliter Acetonitril und dreimal mit einem Milliliter 0,1% Trifluoressigsäure konditionieren, dann die verdaute Mischung auf die Entsalzungskartusche laden und die Mischung dreimal mit einem Milliliter 0,1% Trifluoressigsäure waschen.Als nächstes eluieren Peptide mit einem Milliliter 60% Acetonitril und 0,1% Ameisensäurelösung, dann trocknen Sie elutierte Peptide bei etwa 35 Grad Celsius mit einem zentrifugalen Vakuumkonzentrator, bis das Lösungsmittel vollständig verdampft ist. Nachdem Sie die Peptide in Wasser wieder suspendiert haben, schätzen Sie die Peptidkonzentrationen mit einem Peptidassay gemäß dem Protokoll des Herstellers, portionieren Sie die Peptide dann in 500-Mikrogramm-Aliquots und trocknen Sie sie vollständig ab. Wiegen Sie etwa drei Milligramm Watte und packen Sie sie in eine leere Schleuderspitze.Nachdem Sie ein Gramm Titan-immobilisiertes Metallaffinitätschromatographie-Material in ein Röhrchen übertragen haben, fügen Sie 0,1% Trifluoressigsäure zu einer bekannten Materialkonzentration hinzu. Nachdem Sie genügend Schlämme zu einer Schleuderspitze gegeben haben, um 20 Milligramm Material zu übertragen, waschen Sie die Schleuderspitze durch Zentrifugieren mit 200 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure. Suspendieren Sie die Proben in 200 Mikrolitern Lade-/Waschlösungsmittel und fließen Sie durch die Schleuderspitze.Nachdem Sie die Schleuderspitze durch Zentrifugation mit Lade-/Waschlösungsmittel gewaschen haben, waschen Sie die Schleuderspitze mit 200 Mikrolitern 80%iger Acetonitril-0,1-Ameisensäurelösung, eluieren Sie dann die Peptide mit 200 Mikrolitern E1 und E2 und analysieren Sie jede Elution separat. Wiederholen Sie den Elutionsprozess mit E3- und E4-Lösungsmitteln und kombinieren Sie die entsprechenden Elutionsfraktionen vor der nachgelagerten Analyse. Bevor Sie die Elutien bei basischem pH-Wert durchführen, konditionieren Sie das Material dreimal mit 200 Mikrolitern 90% Acetonitril in 2,5% Ammoniumhydroxid, eluieren Sie dann die Peptide mit 200 Mikrolitern E5- und E6-Lösungsmitteln und analysieren Sie diese Elutien separat nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze.Als nächstes eluieren Sie die Peptide mit 200 Mikrolitern verschiedener Konzentrationen von Acetonitril und Ammoniumhydroxid. Anschließend kombinieren Sie diese Elutions und analysieren Sie sie als eine Probe, E7, nach dem Entsalzen mit einer verpackten Spitze. Annotierte MS/MS-Spektren mit hoher Zuverlässigkeit aus N-glykosylierten und phosphorylierten Peptiden wurden mit reicher Fragmentierung der Vorläufer erhalten, was das Vertrauen in die Identifizierung erhöhte, wie sie von der Datenbanksuchsoftware zugewiesen wurde.Peptididentifikationen wurden aus Proben gefunden, die mit der dual-funktionellen Titan-immobilisierten Metallaffinitätschromatographie-Spin-Tip-Methode über jede Elutionsfraktion angereichert wurden. Die Mehrheit der Glykopeptide eluiert in den ersten vier Fraktionen, während die Mehrheit der Phosphopeptide in den letzten drei Fraktionen eluiert, wodurch potenzielle Interferenzen bei der Ionisation verringert werden. Die glykoproteomischen Ergebnisse der dualen Titanmethode wurden mit einer reinen Ehrlich-Glykopeptid-Anreicherung verglichen, was zeigt, dass die Anteile jeder Glykanart nach dem Binning in sechs Kategorien basierend auf ihrer Zusammensetzung zwischen beiden Methoden ähnlich sind.Phosphoproteomics-Ergebnisse aus der Dual-Titan-Methode wurden mit einer konventionellen immobilisierten Metallaffinitätschromatographie-Phosphopeptid-Nur-Anreicherung oder unter Verwendung beider Methoden verglichen. Die Mehrheit der phosphorylierten Aminosäuren wurde als Serin und Threonin identifiziert, mit etwa 1% phosphoryliertem Tyrosin. Die richtige Konstruktion der Spinspitze ist wichtig, um eine reibungslose Elution zu gewährleisten.Stecken Sie die Baumwolle fest in die Spitze, damit das Anreicherungsmaterial auf der Baumwolle verpackt werden kann. Wir haben die dual-funktionelle Titan-IMAC-Methode zur gleichzeitigen Charakterisierung der Glykosylierung und Phosphorylierung in den meisten Geweben und des SARS-CoV-2-Spike-Proteins verwendet.

a-spin-tip-enrichment-strategy-for-simultaneous-analysis-n

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Video demonstrieren wir die Antikörper-basierte Immunpräzipitation von Phosphopeptiden aus einer Peptidmischung. Die angereicherten Phosphopeptide werden vakuumkonzentriert und für die nachgelagerte Analyse gelagert.

Phosphopeptid-Anreicherung: Eine Antikörper-basierte Immunpräzipitationstechnik zur Trennung spezifischer phosphorylierter Peptide aus komplexen Peptidmischungen

Zelloberflächen-Proteine ​​sind biologisch wichtige und weithin glykosyliert. Wir stellen hier eine Glykopeptid-Capture-Ansatz für einfache LC-MS basierte Proteomanalysen löslich zu machen, zu bereichern, und deglycosylieren diese Proteine.

Glycopeptid-Capture für Zelloberflächen Proteomics

Es wurde ein Hochdurchsatzprotokoll für die kombinierte Proteomik- und Glykomik-Aufreinigung und die LC-MS/MS-Quantifizierung im Plasma entwickelt. Die Deamidierungsanalyse von N-verknüpften Glykosylierungsmotiven war spezifisch für deglykosylierte Stellen. Eine genaue Quantifizierung der N-Glykane wurde durch die Kopplung der filtergestützten N-Glykan-Trennung an die Individualitätsnormalisierung bei der Markierung mit der Glykanhydrazid-Tag-Strategie erreicht.

Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Extrahieren und Phosphopeptides von Prostatakrebs-Zelllinien oder Gewebe für eine Analyse der Phosphoproteome per Massenspektrometrie-basierte Proteomics zu bereichern.

Phosphopeptide Bereicherung gepaart mit quantitativen markierungsfreie Massenspektrometrie zu untersuchen, die Phosphoproteome bei Prostatakrebs

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Präsentiert wird hier ein phosphoprotemischer Ansatz, nämlich Stop-and-Go-Extraktionsspitze Phosphoproteomic, die hohen Durchsatz und tiefe Abdeckung von Arabidopsis phosphoproteome bietet. Dieser Ansatz beschreibt den Überblick über osmotische Stresssignale in Arabidopsis.

Phosphoproteomic Strategie zur Profilierung osmotischer Stresssignalisierung bei Arabidopsis

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.

Chemische affinitätsbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Bioflüssigkeiten für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

Dieses Protokoll beschreibt die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomics-Methode, eine integrierte Omics-Technologie, die umfassende Einblicke in das heterogene Glykoproteom in komplexen Tumormikroumgebungen bietet, die für ein besseres Verständnis der Glykobiologie von Krebserkrankungen erforderlich sind.

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen 

Hier etablieren wir eine massenspektrometrische proteomische Methode unter Verwendung isolierter Regionen von Interesse in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Dieses Protokoll wird verwendet, um Proteome aus bestimmten Gewebebereichen in archivierten formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten zu analysieren.

Ein optimierter Ansatz für die massenspektrometrische Proteomik unter Verwendung ausgewählter Geweberegionen

Lernen Sie eine duale Titan-IMAC-Methode zur gleichzeitigen Anreicherung von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe. Diese Strategie verbessert die Biomarker-Entdeckung für Diabetes und Krebs.

Eine Spin-Tip-Anreicherungsstrategie zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe (Video) | JoVE Journal

Eine Spin-Tip-Anreicherungsstrategie zur simultanen Analyse von N-Glykopeptiden und Phosphopeptiden aus menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe

Weitere Videos entdecken