LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der Schrotflintenproteomik endogene Glutamin- und Asparagin-Deamidierungsprodukte in komplexen Proteomen zu charakterisieren und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Biochemie zu beantworten, wie z.B. den Einfluss eines spontanen und antimatischen Prozessors auf das isometrische Produkt gluteo von Glutamin und die Spargeldesaminierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Glutamin-Desaminierungsisomere auf einer Kapillarsäule mit langer Ionenänderung getrennt werden, wodurch die Fähigkeit maximiert wird, Peptide anhand der isomatischen Punkte zu trennen.

Um mit dem Bau der Säule zu beginnen, suspendieren Sie 50 Milligramm Packungsmaterial mit schwachem Anionenaustausch in 3,5 Millilitern 90%igem Isopropanol in Wasser. Befestigen Sie eine Buchse auf eine Buchse, ein Microferal und eine weibliche Mutter an einem Ende eines 50 Zentimeter langen Peak-Schlauchs mit einem Innendurchmesser von 200 Mikrometern. Montieren Sie ein 1/16-Zoll-Sieb mit einem Mikrometer Poren am Ende des Schlauchs im Inneren des Mikrofers.

Mit einer Druckpumpe, die auf 4.500 psi eingestellt ist, den Anionenaustausch in die Kapillare packen, bis das Material oben sichtbar ist. Befestigen Sie eine weitere Buchse-zu-Buchse-Verschraubung, Microferal und weibliche Mutter an der Oberseite der gepackten Kapillare am gegenüberliegenden Ende, um den Zusammenbau der Säule abzuschließen. Waschen Sie 50 bis 100 Milligramm Gewebe fünf Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal, und legen Sie dann das gewaschene Tuch in Röhrchen mit Sicherheitskappen. Geben Sie zu jedem Röhrchen ein Gewichtsäquivalent an Edelstahlperlen und 2,5 Volumenäquivalente einer wässrigen 100 μmolaren Lösung von Ammoniumacetat mit 1 %% Natriumdesoxycholat. Homogenisieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang bei maximaler Intensität bei vier Grad Celsius.

Anschließend zentrifugieren Sie das Homogenat zehn Minuten lang bei 10.000 x g und vier Grad Celsius. Den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Das Gewebepellet wird weiter homogenisiert und zentrifugiert, wobei die Überstände jedes Mal kombiniert werden, bis kein Pellet mehr zu beobachten ist.

Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration in den kombinierten Überständen mit einem Bicinchoninsäure-Assay. Als nächstes wird dem Homogenat eine molare Lösung von Dithiothreitol in 100 Millimolar Ammoniumacetat zugesetzt, um eine Konzentration von zehn Millimolar Dithiothreitol in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie das Homogenat in einem Wasserbad bei 60 Grad Celsius für dreißig Minuten.

Dem Homogenat wird eine molare Lösung von Iodacetamid in 100 Millimolar Ammoniumacetat zugesetzt, um eine Iodacetamidkonzentration von 20 Millimolar in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie das Homogenat bei Raumtemperatur unter Ausschluss von Licht für 45 Minuten. Dann wird das Homogenat mit zwei Volumenäquivalenten einer zehn millimolaren Lösung von Dithiothreitol in 100 millimolaren Ammoniumacetat verdünnt.

Inkubieren Sie das Homogenat 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Dem Homogenat wird ein ausreichendes Volumen modifiziertes Trypsin in 100 Millimolar Ammoniumacetat zugesetzt, um ein Enzymverhältnis von 1 bis 50 % nach Gewicht in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 30 Grad Celsius, um das Homogenat zu verdauen.

Der Aufschluss wird mit 0,5 % des Probengewichts an Ameisensäure abgekühlt und die Natriumdesoxycholatsalze ausgefällt. Wirbeln Sie die Proben, die SDC-Salze enthalten, vorsichtig vor und zentrifugieren Sie die Proben dann zehn Minuten lang bei 12.000 x g und vier Grad Celsius. Den Überstand in ein neues Rohr umfüllen, dabei darauf achten, das Pellet der SDC-Salze nicht zu stören.

Die Salze werden in einer wässrigen Lösung von Ammoniumhydroxid von 0,5 Vol.-% wieder gelöst und kräftig vortexiert. Konditionieren Sie eine Ein-Gramm-C-18-Sorptionsmittelpatrone mit 5 Millilitern Acetonitril, gefolgt von fünf Millilitern 0,1 %iger Trifluoressigsäure in Wasser. Laden Sie dann die aufgeschlossene Probe in die Kartusche.

Waschen Sie die Proben drei- bis fünfmal mit fünf Millilitern Portionen 0,1 % TFA. Verdünnen Sie dann die Peptide mit fünf Millilitern einer wässrigen Lösung aus 75 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure. Trocknen Sie die Flüssigkeit in einem Vakuumkonzentrator.

Fügen Sie dem Rückstand 200 Mikroliter 75 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure hinzu. Wirbeln Sie die Mischung mindestens zehn Minuten lang vor und beschallen Sie die Mischung dann mindestens 30 Minuten lang, um die trockenen Peptide zu rekonstituieren. Verdünnen Sie die Probe nach Bedarf, so dass die injizierte Probe ein bis drei Mikrogramm Protein enthält.

Schließen Sie die LAX-Kapillarsäule an ein Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Gerät an. Bereiten Sie 0,1%ige Ameisensäurelösungen in Wasser und Acetonitril vor. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,4 Mikroliter pro Minute ein und richten Sie einen Gradientenlauf von 1.200 Minuten ein.

Konfigurieren Sie die Scan-Ereignisse des Massenspektrometers so, dass die Datenerfassung zwischen der vollständigen Fourier-Transformations-Massenspektrometrie und der Fourier-Transformations-Tandem-Massenspektrometrie abwechselt. Führen Sie LERLIC MS/MS durch, um die Peptide zu trennen und zu charakterisieren. Verwenden Sie die resultierenden Daten und die Proteomik-Software, um eine Proteindatenbanksuche durchzuführen.

Exportieren Sie die Suchergebnisse der Datenbank in eine Tabellenkalkulationssoftware. Identifizieren und extrahieren Sie die Liste der deamidatierten Peptide und der entsprechenden nicht deamidatierten Peptide. Extrahieren Sie die Ionenchromatagramme jedes dieser Peptide mit einer Massentoleranz von fünf Teilen pro Million.

Untersuchen Sie die extrahierten Ionenchromatagramme auf die getrennte Doppelpeak-Illusion isomerer Produkte. Mit Hilfe von LERLIC MS/MS wurden deamidatierte Isoformen von Glutamin und Asparagin getrennt und aus einer Proteinprobe zu zwei verschiedenen Retentionszeiten identifiziert. Es wurden enzymatisch modifizierte intermediäre Glutaminreste der Transamidierung identifiziert, die ein invertiertes Gamma-Alpha-Glutamil-Verhältnis aufweisen.

Auch das Succinimid-Zwischenprodukt in Asparaginresten wurde mit dieser Methode identifiziert. Da die Verarbeitungsbedingungen der Probe leicht sauer sind, stabilisieren sich die Succinimid-Zwischenprodukte. Dies deutet darauf hin, dass die LERLIC MS/MS-Technik auf die proteomweite Untersuchung von Succinimid-Zwischenprodukten angewendet werden kann.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in der Biochemie, um die Proteindeamidierung in Kontexten zu charakterisieren, die von der Archäologie bis zur biomedizinischen Forschung reichen.