Name: LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie die LERLIC-MS/MS-Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin- und Asparagin-Desamidierungsisoformen mittels Shotgun-Proteomics. Diese Technik ermöglicht die Trennung von Isomeren anhand ihrer isoelektrischen Punkte.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem Singapore Ministry of Education (Tier 2: Grant ARC9 / 15) unterstützt wird, National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0.003-2.016) und NTU-NHG Alternsforschung Grant ( Grant-ARG / 14017). Wir möchten unsere Dankbarkeit und aufrichtigsten Dank an Dr. Andrew Alpert und PolyLC Team zum Ausdruck bringen für haben uns freundlicherweise mit den Verpackungsmaterialien, die möglich diese Studie gemacht.

1. Packen der Lang Länge Anionen-Austausch (LAX) Kapillarsäule (Anmerkung: Obwohl die LAX Spalte in-home sein kann , verpackt , wie wir in diesem Protokoll beschreiben, LAX Spalten sind auch im Handel erhältlich, siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für weitere Details). <ol><li> Suspend 50 mg schwacher Anionenaustauschfüllmaterial in 3,5 ml Packungspuffer (Tabelle 1) , um die Aufschlämmung herzustellen. </li><li> Montieren Sie das Ende der Kapillarsäule (Länge 50 cm - 200 &amp; mgr; m Innendurchmesser (ID) Schlauch) mit einer weiblich-zu-männlich Fitting, eine ferule und eine weibliche Schraubenmutter. Platzieren eine Bildschirm 1/16&quot; OD von 1 Mikrometer Porengröße innerhalb des weiblich-zu-Negativ-Paßelement. (Anmerkung: Der Bildschirm hier verwendet wurde, haben muß kleinere Porengröße als die Partikelgröße des Füllmaterials zu verhindern, dass eine Leckage des Materials aus dem Säule). </li><li> Packen die Kapillare mit der Aufschlämmung eine Druckpumpe bei 4.500 psi betrieben wird. (Hinweis: Packen Sie die coluMn, bis das Verpackungsmaterial ist am Eingang der Säule) sichtbar. </li><li> Montieren Sie das andere Ende der Kapillarsäule wie unter Punkt 1.2 beschrieben. </li></ol> 2. Probenvorbereitung Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von LERLIC-MS / MS menschliche Hirngewebe als Modell Proteom zu analysieren. (Hinweis: Bei anderen Geweben oder proteomischer Proben zu verwenden, sollten die Probenvorbereitungsverfahren angepasst werden.) <ol><li> Gewebehomogenisierung: ein. Waschhirngewebe (50 bis 100 mg) mit 1x Phosphatpufferlösung dreimal für fünf Minuten. b. Homogenisieren des Gewebes in einer 1: 1: 2,5 Gewebe- / metallischen Perlen / SDC Homogenisierungspuffer (Tabelle 2) Verhältnis (w / w / v) für 5 min bei 4 ° C in Safe-Lock - Röhrchen bei maximaler Intensität ein Gewebe - Homogenisator. (Anmerkung: SDC Homogenisierungspuffer Proteaseinhibitoren umfassen kann , wie zuvor in 3 angegeben) c. Zentrifugiere die Gewebehomogenat, erhalten from den vorherigen Schritt, bei 10.000 × g, 4 ° C für 10 min und den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen sammeln. d. Wiederholen Sie die Schritte bc für die verbleibenden Pellets und die Überstände so oft wie nötig kombinieren , bis kein Pellet beobachtet wird. (Hinweis: Wenn Sie die Schritte bc mehr als zwei Mal wiederholen müssen, bewegen Sie die Probe und die Perlen zu einem neuen Safe-Lock - Rohr den Verlust der Probe während des Zentrifugationsschritt zu verhindern). e. Quantifizierung der Proteinkonzentration der erhaltenen Homogenate von Bicinchoninsäure (BCA) 12. </li><li> Natriumdeoxycholat (SDC) -Assistierte in-Lösung Trypsinverdauung 13 Gehirnhomogenaten. ein. Fügen eine Endkonzentration von 10 mM Dithiothreitol (DTT) (unter Verwendung der Stammlösung in Lösung 5 von Tabelle 3 angegeben) auf das erhaltene Homogenisat die Reduktion von Protein - Disulfid - Bindungen zu initiieren. b. Inkubieren des Homogenisats während 30 Minuten in einem Badbei 60 ° C voreingestellt. c. In das Homogenat zu einer Endkonzentration von 20 mM Iodacetamid (IAA) unter Verwendung der Stammlösung in Lösung 7 von Tabelle 4 angegeben. d. Inkubieren des Homogenats IAA bei Raumtemperatur im Dunkeln während 45 min enthält. e. Verdünne das Hirnhomogenat zwei Faltungen unter Verwendung Verdünnungspuffer (Lösung 6 von Tabelle 3). f. Inkubieren der Probe für eine zweite Reduktionsstufe während 30 Minuten bei 37 ° C. G. Hinzufügen Sequenzierungs-grade-modifiziertes Trypsin , gelöst in Lösung 2 von Tabelle 2 bei Protein-zu-Enzyme Verhältnis 1:50 (w / w). h. Digest des Homogenats mit Trypsin durch Inkubation über Nacht bei 30 ° C. ich. Quenche die enzymatische Verdauung am nächsten Tag um 0,5% Endkonzentration Ameisensäure (FA) Zugabe. (Hinweis: Die Zugabe von FA Fällung der SDC Salz unter sauren Bedingungen führen.) j. Sanft vortexen die Proben SDC precipi enthälttates. k. Pellet die SDC Salze nach unten, indem die Proben bei 12.000 × g, 4 ° C während 10 min zentrifugiert. l. Die überstehende Flüssigkeit und dann die Flüssigkeit in ein sauberes neues Röhrchen. (Anmerkung: während der Pipettieren dieses Schrittes Achten Sie darauf, nicht erneut zu suspendieren und / oder sammeln Salze aus dem SDC-Pellet.) Meter Das SDC - Pellet in SDC Wiederauflösepuffer (Tabelle 5) unter kräftigem Vortexen für 1 min wieder aufzulösen. n. Wiederholen Sie die Schritte Jl zweimal , um ausgefallenes Peptide zu erholen und die Überstände kombinieren. (Anmerkung:. Siehe Serra et al 2016 13 für weitere Einzelheiten über die SDC-assistierte in-Lösung Trypsinverdauung Protokoll hier angepasst.) </li><li> Die Entsalzung von tryptischen verdauten Proben. ein. Perform Entsalzen der verdauten Proben, die eine 1 g C-18-Patrone. (Anmerkung: Die Verwendung einer großen Volumen Patrone (5 ml), unabhängig von der Menge an Protein, erhielt garantiert korrekte Reinigung der verbleibenden SDC Salze in den Proben vorLC-MS / MS-Injektion.) b. Führen Konditionierung der 1g C-18 Kartusche mit 5 ml Acetonitril (ACN). c. Übergeben von 5 ml clean-up - Puffer (Tabelle 6) durch die konditionierte 1 g C-18 Kartusche verbliebener organische Lösungsmittel zu entfernen. d. Legen Sie die Probe auf die 1 g C-18-Patrone. e. Führen von 3 bis 5 Reinigungsschritten auf die Probe in der 1 g C-18 - Säule unter Verwendung von 5 ml clean-up - Puffer jeden Schritt. f. Eluieren der entsalzten Peptide aus dem 1 g C-18 Kartusche unter Verwendung von 5 ml Elutionspuffer (Tabelle 7). G. Trocknen Sie die eluierten Peptide in einem Vakuum-Konzentrator. c. Rekonstituieren die getrocknete Probe in einem Endvolumen von 200 &amp; mgr; l Elutionspuffer. . (Anmerkung: Verwenden kräftig und lange (&gt; 10 min) gefolgt von Vortexen anschließende Beschallung in einem Ultraschallbad während 30 min vollständig resuspendieren die getrockneten Peptide in Injektionspuffer) d. Stellen Sie das Injektionsvolumen der Probe für LERLIC-MS / MS zu analysieren zwischen 1 bis 3 &amp; mgr; g Protein. </li></ol> 3. One-Dimension LERLIC-MS / MS-Trennung <ol><li> Flüssigchromatographie Bedingungen: Mobile Phasen: A: 0,1% FA in Wasser (Tabelle 8). B: 0,1% FA in ACN (Tabelle 9) Fließgeschwindigkeit: 0,4 ml / min Säule: LAX Kapillarsäule (50 cm Länge - 200 um ID) ein. Verwenden Sie das folgende 1200 min-Gradient: 95% B für 40 min, 95-85% B während 434 min, 85-70% B während 522 min, 70-35% B während 124 min, 35-3% B für 45 min , isokratisch bei 3% B für 5 Minuten, 3-95% B über 7 min gehalten und bei 95% B für 23 min isokratisch. b. Führen Trennung der Peptide , die die Kapillar - LAX , wie in Serra &amp; Gallart-Palau et al angegeben. 3 unter Verwendung von Ultrahochdruck - Flüssigkeitschromatographie. </li><li> Massenspektrometer-Konfiguration: ein. Konfigurieren Sie die Scan-Ereignisdetails Datenerfassung Wechsel betwe ausführenen vollständige Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FT-MS) und Fourier-Transformations-Tandem-Massenspektrometrie (FT-MS / MS) mit den folgenden Parametern: a.1. Datenerfassungsmodus: positiv a.2 FT-MS Parameter: Massenbereich: 350 - 2000 m / z Auflösung: 60.000 Microscans: 1 pro Spektrum Automatische Verstärkungsregelung: 1 × 10 6 a.3 FT-MS / MS-Parameter: Fragmentierungsmodus: Hochenergie-Kollisions-Dissoziation (HCD) A.4 Massenbereich: 150 - 2000 m / z A.5 Auflösung: 30.000 A.6 Top N-Ionen: 10 Microscans: 1 pro Spektrum Ladezustand:&gt; 2+ Isolationsbreite: 2 Da A.7 Automatische Verstärkungsregelung: 1 × 10 6 b. Führt Massenspektrometrie Nachweis von Peptiden , wie in 3 unter Verwendung eines Orbitrap - Massenspektrometer mit einer Nanoelektrospray - Ionenquelle ausgerüstet angegeben bei 1,5 kV arbeitet. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Führen Sie protein Datenbanksuche auf den LERLIC-MS / MS erhaltenen Daten der folgenden Parameter unter Verwendung einer spezifische Proteom - Software: (Hinweis: Siehe 3 für weitere Details.) ein. Ionen-Toleranz: 10 ppm b. Fragmention Toleranz: 0,05 Da c. False Discovery Rate (FDR): 1% d. Datenbank: UniProt Menschliche Datenbank e. Feste Modifikationen: Carbamydomethylation bei Cys f. Variable Modifikationen (wenn von der Software erforderlich): Oxidation (Met), Deamidierung (Asn und Gln). </li><li> Überzeugte Charakterisierung und Quantifizierung von isomeren deamidiertes Produkten in LERLIC-MS / MS-Daten: ein. Export-Datenbank Sucher von LERLIC-MS / MS zu einer spreedsheet Software für die Analyse. b. Suchen und extrahieren Sie die ganze Liste von deamidiertem Peptide und deren nichtdeamidierter Pendants. c. Unter Verwendung die Liste des erhaltenen Peptide als Referenz, extrahiert die Ionenchromatogramme (XICS) diese Peptide, die eine sachgemäße Software bei 5 ppm Massentoleranz verwendet wird. (Hinweis:Siehe 3 für weitere Details über die Software für die Extraktion von XICS verwendet.) d. Eine Sichtkontrolle des erhaltenen XICS der separierten Doppelpeak Elution der isomeren Produkte zu identifizieren , wie 3 angegeben. (Anmerkung: isomere Produkte dieser Peptide bei MS / MS-Ebene identifiziert wird, kann leicht durch das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Retentionszeiten in dem Datenbank Suchergebnis geführt zu finden.) e. Relative Quantifizierung der isomeren Produkte aus jeder deamidierten site / Peptid auf der Basis der Peakfläche von jedem identifizierten Isomer in den erhaltenen XICS durchgeführt werden. </li></ol>

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</ol>

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In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Schritt- für -Schritt - Protokoll von LERLIC-MS / MS 3 wird ein Verfahren in dem Tiefen gehende Charakterisierung durchzuführen , und um genau das Ausmaß des Protein Desamidierung und die enzymatischen Prozesse auf dieser Proteinmodifikation beteiligt zu bestimmen. LERLIC-MS / MS basiert auf der Verwendung einer langen Länge (50 cm) LAX nach dem Prinzip der elektrostatischen Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung - Chromatographie (Erlić) <sup class="xre...

Desamidierung ist ein Protein posttranslationale Modifikation (PTM) , die eine negative Ladung an das Proteinrückgrat durch Modifikation von Asparagin (Asn) und / oder Glutamin (Gln) die Reste 1 einführt. Diese Modifikation während Asn - Reste beeinflussen erzeugt das isomeren Produkte Isoasparaginsäure (Isoasp) und n -Asparaginsäure (Asp) an einem gemeinsamen Verhältnis 3: 1 2. Dessen ungeachtet kann dieses Verhältnis durch das Eingreifen des Reparaturenzym L-Isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4 verändert werden. In ähnlicher Weise erzeugt Deamidierung von Gln - Reste die isomeren gamma-Glutaminsäure (γ-Glu) und alpha-glutaminsäure - Isoformen (α-Glu) bei einem erwarteten 1: 7 Verhältnis 3, 5, aber dieses Verhältnis kann durch die Wirkung der verschoben werden das ubiquitäre Enzym Transglutaminase 2 und andere Transglutaminasen, einschließlich Transglutaminase 1, wird eine Enzyme kürzlich mit extrazellulären Vesikeln im Gehirn 6 als assoziiert identifiziert. Der Ursprung der Desamidierung kann entweder spontan oder enzymatisch sein, ist das erstere besonders häufig auf Gln - Resten , bei denen Transglutaminasen und anderen Enzyme vermitteln inter / intramolekulare Vernetzung über Umamidierung (siehe 3 für weitere Details über Gln Umamidierung und ihre Auswirkungen in einigen chronischen und tödliche Krankheiten beim Menschen). Daher ist Desamidierung ein PTM , die eine entscheidende Auswirkung auf die Struktur und Funktion der betroffenen Moleküle 4, 7, 8 und erfordert eine eingehende chemische Charakterisierung 3 im Lichte ihrer unterschiedlichen biochemischen Konsequenzen einschließlich der Dienst als molekulare Uhr hat 9 des Alterns . Obwohl Deamidierung von Asn-Reste hat<html> relativ gut charakterisierte von unten nach oben shotgun Proteomics 1, 10, Deamidierung von Gln - Resten immer noch nicht eine geeignete Charakterisierungsmethode über die anspruchsvolle Analyse von Modellverbindungen , die durch elektronen basierend hat radikale Fragmentierungs 11. Wir haben vor kurzem eine neue eindimensional Shotgun Proteomics Strategie (LERLIC-MS / MS) 3 , die Trennung von Gln und Asn Desamidierung Isoformen von komplexen biologischen Proben und Modellverbindungen in einer einzigen Analyse ermöglicht. LERLIC-MS / MS basiert auf der Trennung von tryptischen Peptiden verdaute eine lange Länge (50 cm) Ionenaustauschersäule (LAX) arbeitet auf elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie (Erlić) Modus und mit dem Tandem-Massenspektrometrie (LC- MS / MS). Diese neue analytische Strategie wurde verwendet, um das Ausmaß jeder deamidiertes Rückstand in menschlichen Hirngewebe zu charakterisieren und relativ zu Quantifizierenf &quot;&gt; 3. Dennoch skizzierte das Protokoll hier wird Video - Imaging von LERLIC-MS / MS abzielen , die Besonderheiten von Protein Desamidierung im biochemischen Zusammenhang von Interesse zu studieren. ETHIK STATEMENT Alle Verfahren dieses Protokolls wurden von der Institutional Review Board der Nanyang Technological University in Singapur und wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts genehmigt.

<table><tbody><tr><td>PolyCAT 3 und Mikro; m 100-& Aring; (Schüttgut)</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Sonderbestellung</td><td></td></tr><tr><td>Lange Ionenaustauscher-Kapillarsäule 50 cm - 200 & Mikro; m ID</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Sonderbestellung</td><td></td></tr><tr><td>PEEKsil Schlauch 1/16" AD x 200 & Mikro; m ID x 50 cm Länge</td><td>SGE Analytical Science unter Trajan Scientific Australia&nbsp;</td><td>620050</td><td></td></tr><tr><td>Buchse zu Buchse Verschraubung für 1/16" OD Schlauch</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-125</td><td></td></tr><tr><td>Innenmutter für Mikroferule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHP-416</td><td></td></tr><tr><td>Mikroferule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-132</td><td></td></tr><tr><td>Druckbombe NanoBaume</td><td>Western Fluids Engineering</td><td>SP-400</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Prominence UFLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Prominence UFLC</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Röhren</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlperlen. 0,9 &ndash; 2,0 mm. 1 lb. Unsteril.</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge&nbsp;</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>Rotina 380 R</td><td></td></tr><tr><td>Standard Digital beheiztes Umwälzbad, 120VAC</td><td>PolyScience 8006 6L</td><td>8006A11B</td><td></td></tr><tr><td>Sep-pack c18 Entsalzungskartusche 50 mg</td><td>Wasser</td><td>WAT020805</td><td></td></tr><tr><td>Vacumm Konzentrator</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Konzentrator Plus System</td><td></td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td>Dionex</td><td>UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>ORBITRAP ELITE</td><td></td></tr><tr><td>Michrom Thermo CaptiveSpray</td><td>Michrom-Bruker Inc.</td><td>TCSI-SS2</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator INCUCELL</td><td>MMM Group</td><td>INCUCELL111</td><td></td></tr><tr><td>Modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktailtabletten</td><td>Roche</td><td>11836170001 (ROCHE)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpufferlösung 10x (verdünnt auf 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>i6125</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril HPLC-Qualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675415</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol HPLC Typ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675431</td><td></td></tr><tr><td>Wasser HPLC Typ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14263</td><td></td></tr></tbody></table>

lerlic-ms / ms für eingehende charakterisierung und quantifizierung von glutamin und asparagin desamidierung in shotgun proteomics

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Charakterisierung von Protein Deamidierung ist zwingend notwendig, die Rolle (n) und Möglichkeiten dieses Proteins posttranslationalen Modifikation (PTM) in der menschlichen Pathologie und anderen biochemischen Zusammenhänge zu entschlüsseln. Um Charakterisierung von Protein Deamidierung durchzuführen, haben wir vor kurzem eine neue lange Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode, die den Glutamin (Gln) und Asparagin (Asn) Isoform trennen kann Produkte der Desamidierung von Modellverbindungen zu sehr komplexen biologischen Proben. LERLIC-MS / MS ist daher die erste Schrotflinte Proteomik Strategie für die Trennung und Quantifizierung von Gln Desamidierung Isoformen. Wir zeigen auch, wie ein Novum, dass die Probenverarbeitungsprotokoll skizziert hier stabilisiert das Succinimid zwischen dessen Charakterisierung ermöglicht durch LERLIC-MS / MS. Die Anwendung von LERLIC-MS / MS, wie in diesem Video-Artikel gezeigt kann helfen, die derzeit unknow aufzuklärenn molekulare Arrays von Protein Desamidierung. Darüber hinaus bietet LERLIC-MS / MS weitergehendes Verständnis der enzymatischen Reaktionen, die Desamidierung in verschiedenen biologischen Hintergründen umfassen.

Deamidierung von Gln und Asn - Resten ist eine degenerative Proteinmodifikation (DPM) 14 in mehreren chronischen und tödlichen Krankheiten verwickelt angesehen. Es hat sich gezeigt , dass diese PTM die 1 - Halbwertszeit und Abbau Staaten von Antikörpern und anderen Molekülen im menschlichen Körper und ähnliche biologische Hintergründe vorhersagen können, 15. Die Bedeutung von Protein Desamidierung in der T...

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der langen Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophile Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode. Dies ist eine neue Methode, die zum ersten Mal die Quantifizierung und Charakterisierung der Glutamin und Asparagin Desamidierung Isoformen von Shotgun Proteomics ermöglicht.

LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Shotgun-Proteomik endogene Deamidierungsprodukte von Glutamin und Asparagin in komplexen Proteomen zu charakterisieren und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Biochemie zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss spontane und enzymatische Prozesse auf die isometrischen Produkte der Deamidierung von Glutamin und Asparagin haben. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Glutamin-Deamidierungs-Isomere an einer langen ionenaustauschenden Kapillarsäule getrennt werden, wodurch die Trennfähigkeit von Peptiden anhand ihrer isoelektrischen Punkte maximiert wird.Um mit dem Säulenaufbau zu beginnen, suspendieren Sie 50 Milligramm schwachen anionenaustauschenden Packungsmaterials in 3,5 Milliliter 90%igem Isopropanol in Wasser. Befestigen Sie ein weibliches Verbindungsstück, einen Microferal und eine weibliche Mutter an einem Ende eines 50 Zentimeter langen Peak-Rohrs mit einem Innendurchmesser von 200 Mikrometern. Bringen Sie ein 1/16-Zoll-Sieb mit einmikrigen Poren am Ende des Rohrs innerhalb des Microferals an.Unter Verwendung einer Druckpumpe, die auf 4.500 psi eingestellt ist, das Anionenaustauschmaterial in die Kapillare einpressen, bis das Material an der Oberseite sichtbar ist. Ein weiteres weibliches Verbindungsstück, Microferal und eine weibliche Mutter an der Oberseite der befüllten Kapillare am gegenüberliegenden Ende anbringen, um die Säule fertig zu montieren. 50 bis 100 Milligramm Gewebe fünf Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen.Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal und geben Sie das gewaschene Gewebe anschließend in Röhrchen mit Sicherheitsverschlüssen. Geben Sie jedem Röhrchen ein Gewichtsäquivalent an Edelstahlkugeln sowie 2,5 Volumenäquivalente einer wässrigen 100-Millimolar-Lösung von Ammoniumacetat mit 1 % Natriumdeoxycholat hinzu. Homogenisieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang bei maximaler Intensität und vier Grad Celsius.Anschließend das Homogenat zehn Minuten bei 10.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Das Homogenisieren und Zentrifugieren des Gewebepellets fortführen und die Überstände jedes Mal vereinigen, bis kein Pellet mehr sichtbar ist.Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in den vereinigten Überständen mittels Bicinchoninsäure-Assay. Geben Sie anschließend zum Homogenat eine einmolare Lösung von Dithiothreitol in 100 Millimolar Ammoniumacetat, um eine Dithiothreitol-Konzentration von zehn Millimolar in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie das Homogenat für dreißig Minuten in einem Wasserbad bei 60 Grad Celsius.Geben Sie zum Homogenat eine einmolarige Lösung von Iodoacetamid in 100 Millimolar Ammoniumacetat, um eine Iodoacetamid-Konzentration von 20 Millimolar in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie das Homogenat 45 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Verdünnen Sie anschließend das Homogenat mit dem zweifachen Volumenäquivalent einer zehn Millimolar Lösung von Dithiothreitol in 100 Millimolar Ammoniumacetat.Inkubieren Sie das Homogenat bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Geben Sie zum Homogenat ein ausreichendes Volumen an sequenzierungsreinem, modifiziertem Trypsin in 100 Millimolar Ammoniumacetat hinzu, um ein Protein-Enzym-Verhältnis von 1 zu 50 nach Gewicht in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 30 Grad Celsius, um das Homogenat zu verdauen.Stoppen Sie die Verdauung mit 0,5 % des Proben­gewichts an Ameisensäure, wodurch die Natrium-Deoxycholat-Salze ausgefällt werden. Vortexen Sie die Proben mit SDC-Salzen vorsichtig und zentrifugieren Sie anschließend zehn Minuten bei 12.000 × g und vier Grad Celsius. Gießen Sie das Überstand in ein neues Röhrchen ab, wobei darauf zu achten ist, den Pellet der SDC-Salze nicht aufzuwirbeln.Lösen Sie die Salze erneut in einer 0,5 %igen wässrigen Lösung von Ammoniumhydroxid unter starkem Wirbeln auf. Bedingen Sie eine C-18-Sorbent-Kartusche mit einer Masse von einem Gramm mit 5 Millilitern Acetonitril, gefolgt von fünf Millilitern 0,1 %iger Trifluoressigsäure in Wasser. Anschließend geben Sie die verdauten Probe auf die Kartusche.Die Proben drei bis fünfmal mit jeweils fünf Milliliter 0,1 %iger TFA waschen. Anschließend die Peptide mit fünf Milliliter einer wässrigen Lösung aus 75 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure verdünnen. Die Flüssigkeit in einem Vakuumkonzentrator trocknen.Fügen Sie 200 Mikroliter 75%iger Acetonitril-Lösung mit 0,1% Ameisensäure zum Rückstand hinzu. Wirbeln Sie die Mischung mindestens zehn Minuten lang und anschließend werden die trockenen Peptide durch Ultraschallbehandlung mindestens 30 Minuten lang rekonstituiert. Verdünnen Sie die Probe nach Bedarf, sodass die injizierte Probe ein bis drei Mikrogramm Protein enthält.Schließen Sie die LAX-Kapillarsäule an ein Instrument der Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an. Bereiten Sie 0,1 %ige Ameisensäurelösungen in Wasser und Acetonitril vor. Stellen Sie die Flussrate auf 0,4 Mikroliter pro Minute ein und richten Sie einen 1.200-minütigen Gradientenlauf ein.Konfigurieren Sie die Massenspektrometer-Scanevents so, dass sich die Datenerfassung zwischen vollständiger Fourier-Transform-Massenspektrometrie und Fourier-Transform-Tandem-Massenspektrometrie abwechselt. Führen Sie LERLIC-MS/MS durch, um die Peptide zu trennen und zu charakterisieren. Verwenden Sie die gewonnenen Daten und proteomische Software, um eine Proteindatenbanksuche durchzuführen.Exportieren Sie die Datenbanksuchergebnisse in eine Tabellenkalkulationssoftware. Identifizieren und extrahieren Sie die Liste der deamidierten Peptide sowie der entsprechenden nicht-deamidierten Peptide. Extrahieren Sie die Ionen-Chromatogramme jedes dieser Peptide mit einer Massentoleranz von fünf Teilen pro Million.Überprüfen Sie die extrahierten Ionen-Chromatogramme auf die getrennte Doppelpeak-Illusion isomerer Produkte. Mithilfe von LERLIC-MS/MS wurden deamidierte Isoformen von Glutamin und Asparagin aus einer Proteinprobe bei zwei unterschiedlichen Retentionszeiten getrennt und identifiziert. Enzymatisch modifizierte intermediäre Glutamin-Reste der Transamidierung, die ein invertiertes Gamma-Alpha-Glutamyl-Verhältnis aufwiesen, wurden identifiziert.Das Succinimid-Intermediat in Asparagin-Resten wurde ebenfalls mit dieser Methode identifiziert. Da die leicht sauren Bedingungen bei der Probenvorbereitung das Succinimid-Intermediat stabilisieren, deutet dies darauf hin, dass die LERLIC-MS/MS-Technik für proteomweite Untersuchungen von Succinimid-Intermediaten eingesetzt werden kann.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern in der Biochemie den Weg, um Protein-Deamidierung in Kontexten von der Archäologie bis zur biomedizinischen Forschung zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound...

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Quelle: Wulf, M., et.al.  Lasermikrodissektionsbasiertes Protokoll für die LC-MS/MS-Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granula. J. Vis. Exp. (2021). Dieses Video zeigt die Analyse von Peptidproben aus Neuromelanin-Granula (NMGs), die aus menschlichem postmortalem Hirngewebe isoliert wurden. Die Peptide werden zunächst mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) getrennt und anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert, um ihr Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) zu...

LC-MS/MS Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granulaten, die aus menschlichem Hirngewebe isoliert wurden

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Dieses Protokoll beschreibt, wie absolute Quantifizierungsassays von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben unter Verwendung ausgewählter Reaktionsüberwachung durchgeführt werden. Es wurde verwendet, um Proteine des Chemotaxis-Signalwegs von Mausmakrophagen genau zu quantifizieren. Die Auswahl des Zielpeptids, die Assay-Entwicklung sowie qualitative und quantitative Assays werden ausführlich beschrieben.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Es wurde ein Hochdurchsatzprotokoll für die kombinierte Proteomik- und Glykomik-Aufreinigung und die LC-MS/MS-Quantifizierung im Plasma entwickelt. Die Deamidierungsanalyse von N-verknüpften Glykosylierungsmotiven war spezifisch für deglykosylierte Stellen. Eine genaue Quantifizierung der N-Glykane wurde durch die Kopplung der filtergestützten N-Glykan-Trennung an die Individualitätsnormalisierung bei der Markierung mit der Glykanhydrazid-Tag-Strategie erreicht.

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Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Das beschriebene Protokoll bietet eine optimierte quantitative Proteomik-Analyse von Gewebeproben mit zwei Ansätzen: markierungsbasierte und markierungsfreie Quantifizierung. Markierungsbasierte Ansätze haben den Vorteil einer genaueren Quantifizierung von Proteinen, während ein markierungsfreier Ansatz kostengünstiger ist und zur Analyse von Hunderten von Proben einer Kohorte verwendet wird.

Umfassender Workflow der massenspektrometrischen Schrotflintenproteomik von Gewebeproben

Die Protein-Arginin (R)-Methylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation, die mehrere biologische Signalwege reguliert. Die Massenspektrometrie ist die beste Technologie, um das R-Methylproteom global zu profilieren, wenn es mit biochemischen Ansätzen zur modifizierten Peptidanreicherung gekoppelt ist. Der Arbeitsablauf für die hochzuverlässige Identifizierung der globalen R-Methylierung in menschlichen Zellen wird hier beschrieben.

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Hier wird ein robustes Protokoll zur Isolierung von Neuromelanin-Granulaten aus humanem postmortalem Substantia nigra pars compacta-Gewebe mittels Lasermikrodissektion vorgestellt. Dieses überarbeitete und optimierte Protokoll minimiert massiv die benötigte Zeit für die Probenentnahme, reduziert die erforderliche Probenmenge und verbessert die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen durch LC-MS/MS-Analyse.

Laser-Mikrodissektions-basiertes Protokoll für die LC-MS/MS-Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granulaten

Ein neuronales Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Protokoll wird hier beschrieben, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen zu charakterisieren. Lysosomale Membranproteine und Proteine, die mit Lysosomen interagieren (stabil oder vorübergehend), können in dieser Methode mit hervorragender intrazellulärer räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen genau quantifiziert werden.

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Erfahren Sie die LERLIC-MS/MS-Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin- und Asparagin-Desamidierungsisoformen mittels Shotgun-Proteomics. Diese Technik ermöglicht die Trennung von Isomeren anhand ihrer isoelektrischen Punkte.

LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics (Video) | JoVE Journal

LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

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