LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Shotgun-Proteomik endogene Deamidierungsprodukte von Glutamin und Asparagin in komplexen Proteomen zu charakterisieren und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Biochemie zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss spontane und enzymatische Prozesse auf die isometrischen Produkte der Deamidierung von Glutamin und Asparagin haben. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Glutamin-Deamidierungs-Isomere an einer langen ionenaustauschenden Kapillarsäule getrennt werden, wodurch die Trennfähigkeit von Peptiden anhand ihrer isoelektrischen Punkte maximiert wird.

Um mit dem Säulenaufbau zu beginnen, suspendieren Sie 50 Milligramm schwachen anionenaustauschenden Packungsmaterials in 3,5 Milliliter 90%igem Isopropanol in Wasser. Befestigen Sie ein weibliches Verbindungsstück, einen Microferal und eine weibliche Mutter an einem Ende eines 50 Zentimeter langen Peak-Rohrs mit einem Innendurchmesser von 200 Mikrometern. Bringen Sie ein 1/16-Zoll-Sieb mit einmikrigen Poren am Ende des Rohrs innerhalb des Microferals an.

Unter Verwendung einer Druckpumpe, die auf 4.500 psi eingestellt ist, das Anionenaustauschmaterial in die Kapillare einpressen, bis das Material an der Oberseite sichtbar ist. Ein weiteres weibliches Verbindungsstück, Microferal und eine weibliche Mutter an der Oberseite der befüllten Kapillare am gegenüberliegenden Ende anbringen, um die Säule fertig zu montieren. 50 bis 100 Milligramm Gewebe fünf Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal und geben Sie das gewaschene Gewebe anschließend in Röhrchen mit Sicherheitsverschlüssen. Geben Sie jedem Röhrchen ein Gewichtsäquivalent an Edelstahlkugeln sowie 2,5 Volumenäquivalente einer wässrigen 100-Millimolar-Lösung von Ammoniumacetat mit 1 % Natriumdeoxycholat hinzu. Homogenisieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang bei maximaler Intensität und vier Grad Celsius.

Anschließend das Homogenat zehn Minuten bei 10.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Das Homogenisieren und Zentrifugieren des Gewebepellets fortführen und die Überstände jedes Mal vereinigen, bis kein Pellet mehr sichtbar ist.

Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in den vereinigten Überständen mittels Bicinchoninsäure-Assay. Geben Sie anschließend zum Homogenat eine einmolare Lösung von Dithiothreitol in 100 Millimolar Ammoniumacetat, um eine Dithiothreitol-Konzentration von zehn Millimolar in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie das Homogenat für dreißig Minuten in einem Wasserbad bei 60 Grad Celsius.

Geben Sie zum Homogenat eine einmolarige Lösung von Iodoacetamid in 100 Millimolar Ammoniumacetat, um eine Iodoacetamid-Konzentration von 20 Millimolar in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie das Homogenat 45 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Verdünnen Sie anschließend das Homogenat mit dem zweifachen Volumenäquivalent einer zehn Millimolar Lösung von Dithiothreitol in 100 Millimolar Ammoniumacetat.

Inkubieren Sie das Homogenat bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Geben Sie zum Homogenat ein ausreichendes Volumen an sequenzierungsreinem, modifiziertem Trypsin in 100 Millimolar Ammoniumacetat hinzu, um ein Protein-Enzym-Verhältnis von 1 zu 50 nach Gewicht in der Probe zu erreichen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 30 Grad Celsius, um das Homogenat zu verdauen.

Stoppen Sie die Verdauung mit 0,5 % des Proben­gewichts an Ameisensäure, wodurch die Natrium-Deoxycholat-Salze ausgefällt werden. Vortexen Sie die Proben mit SDC-Salzen vorsichtig und zentrifugieren Sie anschließend zehn Minuten bei 12.000 × g und vier Grad Celsius. Gießen Sie das Überstand in ein neues Röhrchen ab, wobei darauf zu achten ist, den Pellet der SDC-Salze nicht aufzuwirbeln.

Lösen Sie die Salze erneut in einer 0,5 %igen wässrigen Lösung von Ammoniumhydroxid unter starkem Wirbeln auf. Bedingen Sie eine C-18-Sorbent-Kartusche mit einer Masse von einem Gramm mit 5 Millilitern Acetonitril, gefolgt von fünf Millilitern 0,1 %iger Trifluoressigsäure in Wasser. Anschließend geben Sie die verdauten Probe auf die Kartusche.

Die Proben drei bis fünfmal mit jeweils fünf Milliliter 0,1 %iger TFA waschen. Anschließend die Peptide mit fünf Milliliter einer wässrigen Lösung aus 75 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure verdünnen. Die Flüssigkeit in einem Vakuumkonzentrator trocknen.

Fügen Sie 200 Mikroliter 75%iger Acetonitril-Lösung mit 0,1% Ameisensäure zum Rückstand hinzu. Wirbeln Sie die Mischung mindestens zehn Minuten lang und anschließend werden die trockenen Peptide durch Ultraschallbehandlung mindestens 30 Minuten lang rekonstituiert. Verdünnen Sie die Probe nach Bedarf, sodass die injizierte Probe ein bis drei Mikrogramm Protein enthält.

Schließen Sie die LAX-Kapillarsäule an ein Instrument der Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie an. Bereiten Sie 0,1 %ige Ameisensäurelösungen in Wasser und Acetonitril vor. Stellen Sie die Flussrate auf 0,4 Mikroliter pro Minute ein und richten Sie einen 1.200-minütigen Gradientenlauf ein.

Konfigurieren Sie die Massenspektrometer-Scanevents so, dass sich die Datenerfassung zwischen vollständiger Fourier-Transform-Massenspektrometrie und Fourier-Transform-Tandem-Massenspektrometrie abwechselt. Führen Sie LERLIC-MS/MS durch, um die Peptide zu trennen und zu charakterisieren. Verwenden Sie die gewonnenen Daten und proteomische Software, um eine Proteindatenbanksuche durchzuführen.

Exportieren Sie die Datenbanksuchergebnisse in eine Tabellenkalkulationssoftware. Identifizieren und extrahieren Sie die Liste der deamidierten Peptide sowie der entsprechenden nicht-deamidierten Peptide. Extrahieren Sie die Ionen-Chromatogramme jedes dieser Peptide mit einer Massentoleranz von fünf Teilen pro Million.

Überprüfen Sie die extrahierten Ionen-Chromatogramme auf die getrennte Doppelpeak-Illusion isomerer Produkte. Mithilfe von LERLIC-MS/MS wurden deamidierte Isoformen von Glutamin und Asparagin aus einer Proteinprobe bei zwei unterschiedlichen Retentionszeiten getrennt und identifiziert. Enzymatisch modifizierte intermediäre Glutamin-Reste der Transamidierung, die ein invertiertes Gamma-Alpha-Glutamyl-Verhältnis aufwiesen, wurden identifiziert.

Das Succinimid-Intermediat in Asparagin-Resten wurde ebenfalls mit dieser Methode identifiziert. Da die leicht sauren Bedingungen bei der Probenvorbereitung das Succinimid-Intermediat stabilisieren, deutet dies darauf hin, dass die LERLIC-MS/MS-Technik für proteomweite Untersuchungen von Succinimid-Intermediaten eingesetzt werden kann.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern in der Biochemie den Weg, um Protein-Deamidierung in Kontexten von der Archäologie bis zur biomedizinischen Forschung zu charakterisieren.