Kapillarelektrophorese: Eine Technik zur Analyse von fluoreszenzmarkierten Polymerase-Kettenreaktionsamplikons

Um die Größe von DNA-Fragmenten mittels Kapillarelektrophorese zu bestimmen, beginnen Sie mit der Entnahme einer Multi-Well-Assay-Platte. Jede Vertiefung enthält fluoreszenzmarkierte, unterschiedlich große PCR-Amplikons - doppelsträngige DNA-Oligonukleotide, die nach einem PCR-Zyklus gewonnen werden.

Geben Sie ein paar unterschiedlich große, doppelsträngige DNA-Fragmente in die Vertiefung, die als Größenstandard dienen. Jedes dieser DNA-Moleküle trägt zur einfachen Identifizierung eine Fluoreszenzmarkierung.

Ergänzen Sie die Mulde mit Formamid, einem starken Vergällungsmittel, und erhitzen Sie sie bei hoher Temperatur. Dieser Schritt denaturiert die DNA und bildet einzelsträngige Fragmente, die leicht durch die Gelporen wandern können.

Legen Sie die Platte in eine Fragmentanalysatoreinheit, die vorinjiziertes Polymergel in ihrem Kapillarsystem enthält.

Legen Sie eine hohe Spannung an, um die DNA aus dem Well elektrokinetisch in die Kapillare mit dünnem Durchmesser an der Kathode - dem negativen Terminus - einzuführen. Die negativ geladenen DNA-Moleküle wandern auf die positiv geladene Anode zu. Die kürzeren DNA-Stränge sind weniger Reibungskräften ausgesetzt und bewegen sich schneller durch das Gel als die längeren DNA-Stränge.

Bei der Elektromigration kreuzt die DNA den Weg des Laserstrahls, wodurch der Farbstoff fluoresziert. Die Emissionssignale des Farbstoffs werden von einem Detektor erfasst und später in ein Elektropherogramm übersetzt - ein Diagramm, das jede fluoreszierende DNA als unterschiedlich gefärbten, individuellen Peak darstellt.

Vergleichen Sie den Peak des unbekannten DNA-Fragments mit den Referenzpeaks, um seine Größe zu analysieren.