Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Heutzutage stellt die kapillare Zellelektrophorese eine der auflösendsten und empfindlichsten Methoden für die Analyse von Biomolekülen wie monoklonalen Antikörpern dar. Die erfolgreiche Anwendung dieser Technik hängt jedoch vom Wissen und den Fähigkeiten des Analysten in kritischen Schritten während der Probenvorbereitung und Systemvorbereitung ab. Dieses Tutorial zielt darauf ab, detailliert zu erläutern, wie eine erfolgreiche Analyse durchgeführt wird, einschließlich der genauen Vorbereitung von Lösungen und Proben, der Vorbereitung des Kapillarelektrophorese-Systems, der Instrumentenmethode, sowie der Datenbewertung und -verarbeitung.

Insgesamt kann dieses Protokoll zur Entwicklung und Verbesserung der Fähigkeiten des Personals, das an der Vorbereitung analytischer Chemielabore beteiligt ist, verwendet werden. Wiegen Sie die Menge an HPMC ab, um eine Endkonzentration von 0,05 Prozent in 100 Milliliter zu erhalten. Da HPMC ein grundlegender elastischer Polymer ist, gießen Sie als ersten Schritt den Bindemittelstoff in ein Glasbecherglas und fügen Sie langsam 80 Milliliter Wasser hinzu, um das Pulver zu desaggregieren.

Danach spülen Sie die Befeuchtungsschale mit Wasser, um Puderspuren zu entfernen. Geben Sie die restlichen Reagenzien wie üblich hinzu und rühren Sie die Lösung um. Stellen Sie den pH-Wert mit 50 Prozent Essigsäure auf 4,8 ein.

Und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang stabilisieren. Danach den pH gegebenenfalls einstellen. Wasser hinzufügen, um das Endvolumen von 100 Milliliter zu erreichen.

Filtern Sie die hergestellte BG-Lösung durch eine neutrophile Membran und gießen Sie sie in eine Glasflasche. Beschriften Sie abschließend die Glasflasche entsprechend und lagern Sie sie gekühlt. Um die Probe vorzubereiten, geben Sie als ersten Schritt 162 µL Pufferpufferlösung in ein 1,5-mL-Röhrchen.

Dann 18 Mikroliter einer zuvor hergestellten Map-Probe mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter hinzufügen. Als dritten Schritt 20 Mikroliter einer zuvor hergestellten einprozentigen Histaminlösung hinzufügen, um ein Endvolumen der Probe von 200 Mikrolitern zu erhalten. Nächster Schritt: Eine Probe fünf Sekunden lang vorbereiten.

Und zentrifugieren Sie fünf Sekunden lang. Aspirieren Sie das gesamte Probenvolumen. Geben Sie die Probe dann nach oben in ein Mikrovial, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.

Schließen Sie schließlich das Gefäß mit einem Deckel und lagern Sie es gekühlt. Schalten Sie das CE-Gerät aus, indem Sie den Netzschalter drücken. Und öffnen Sie die Fronttür.

Legen Sie ein neues Bewegungstuch unter den Interface-Block. Spülen Sie die Elektroden durch den Interface-Block mit Wasser unter Verwendung einer Sprühflasche. Lassen Sie das Wasser durch die Löcher tropfen und trocknen Sie den Interface-Block gründlich ab.

Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser von den Elektroden mit dem Tuch. Achten Sie darauf, während dieses Vorgangs nicht in den Elektroden zu sein. Entfernen Sie das Tuch aus dem Probenträgersystem.

Reinigen Sie die Oberfläche der Probenschalen mit einem neuen, mit Wasser angefeuchteten, nicht fuselnden Tuch. Und die Oberfläche der Puffergefäße. Schieben Sie die Puffergefäße nach oben, heben Sie das Probenträgersystem an und reinigen Sie deren Oberfläche mit dem Tuch.

Bewegen Sie die Pufferbehälter wieder an ihre Position. Danach reinigen Sie den Schnittstellenblock gründlich. Reinigen Sie den Klemmstab und das Gehäuse der UV-Lampe.

Am Ende sollten Sie das System vor der Verwendung unbedingt testen. Spülen Sie die Öffnungshebel mit Wasser unter Verwendung einer Sprühflasche ab. Reinigen Sie ihre Oberfläche gründlich mit einem neuen, fusselfreien Tuch, um Staub und angesammelte Salze zu entfernen.

Testen Sie diese schließlich, bevor Sie sie installieren. Reinigen Sie die beiden Enden des Glasfaserkabels mit einem mit Wasser angefeuchteten Mikrofasertuch und überprüfen Sie das Licht zwischen den Enden. Entnehmen Sie eine neue neutrale Kapillare ihrer Verpackung.

Nehmen Sie nun ein Ende des Schutzschlauchs der Kapillare auf die Arbeitsfläche. Entrollen und richten Sie den Kunststoffschlauch und ziehen Sie die Kapillare vorsichtig aus dem Schlauch heraus. Befestigen Sie ein Stück Papier auf der Arbeitsfläche mit den folgenden Maßstabsmarkierungen.

Richten Sie das Kapillarfenster an den Zentimeter-Maßmarken am Nullpunkt aus, wie folgt: Befestigen Sie danach die Kapillarenden mit Klebeband auf der Arbeitsfläche. Markieren Sie die Kapillarenden zwei Millimeter außerhalb der Messmarkierungen. Schneiden Sie die Schutzkappe am kapillaren Ende, das am weitesten vom Fenster entfernt ist, ab.

Und tauchen Sie das Kapillarendstück in ein CE-Gefäß, das mit Wasser gefüllt ist, um eine dauerhafte Beschädigung der inneren Beschichtung der Kapillare zu vermeiden. Entfernen Sie die Kapillare aus dem Gefäß und setzen Sie dieses Ende vorsichtig in die Auslassseite der Kartusche ein. Sobald die Kapillare auf der anderen Seite erscheint, ziehen Sie so weit nötig, bis das Kapillarfenster mittig zum Fenster der Kartusche ausgerichtet ist, wie folgt.

Danach das Kartusche umdrehen und den Abdeckstopfen in das Kartuschenfenster einsetzen, indem man andrückt, bis er einrastet. Achten Sie darauf, das Kapillarfenster während dieses Vorgangs nicht zu beschädigen. Überprüfen Sie, ob Licht durch das Fenster hindurchtritt, wenn es einer breiten Lichtquelle ausgesetzt wird.

Führen Sie die Kapillare in die vorgefertigte Kühlmittelleitung mit vorinstallierter Leitung nicht feral und O-Ring ein. Schieben Sie die Kapillare durch die Leitung, bis die Kapillare an der anderen Seite erscheint. Stecken Sie dann das Ende der Leitung an der Auslassseite der Kartusche ein und ziehen Sie die Leitungsverschraubungen fest.

Führen Sie das Einlassende der Kapillare in die Einlassseite der Kartusche ein. Sobald die Kapillare auf der anderen Seite erscheint, ziehen Sie sie entsprechend heraus. Danach führen Sie das Ende des Schlauchs in die Einlassseite der Kartusche ein und ziehen die Schlauchmuttern fest.

Schneiden Sie die Schutzkappe am kapillaren Ende, das am weitesten vom Fenster entfernt ist, ab. Bringen Sie die Halteklammern für die Kapillare an den kapillaren Enden an, indem Sie sie wie folgt eindrücken, bis sie einrasten. Schneiden Sie die kapillaren Enden unterhalb der Bezugsstriche auf den verlängerten Kapillarplatten ab.

Überprüfen Sie die Kapillarenden unbedingt mit einer Lupe. Falls die Kapillarenden nicht glatt sind, glätten Sie sie mit dem Cleveland-Stein. Setzen Sie den Dichtungsring in die blaue Öffnung ein.

Und setzen Sie es vorsichtig mit dem O-Ring-Einbautool ein. Bringen Sie schließlich CE-Fläschchen, die mit Wasser gefüllt sind, in das Kartuschengehäuse an, und setzen Sie die Kartusche unverzüglich ein, wobei die Kapillarenden in die Fläschchen eingeführt werden, und lagern Sie sie gekühlt. Stellen Sie das Pipettenvolumen ein.

Fügen Sie die korrekte Wassermenge in den Pufferzulauf an den Tray-Koordinaten A1, B1 und F6 sowie in den Pufferablauf an den Tray-Koordinaten A1, B1, C1, E6 und F6 hinzu. Geben Sie 0,1 normales HCl zu den Pufferzulauf-Koordinaten C1 und E6. Fügen Sie außerdem BGE den Pufferzulauf-Koordinaten D1 und E6 sowie der Pufferablauf-Koordinate D1 hinzu. Verschließen Sie abschließend alle CE-Fläschchen in den Pufferzulauf- und -ablauf-Trays. Vermeiden Sie während des Vorgangs, die Fläschchenverschlüsse zu benetzen, um Kohlenstoffleckage zu verhindern. Öffnen Sie die Fronttür des CE-Geräts.

Installieren Sie zuerst den UV-Detektor und befestigen Sie ihn, indem Sie die Schraube im Uhrzeigersinn drehen. Heben Sie die Innentür an und installieren Sie die Öffnungshebel, indem Sie sie nach oben in den Schnittstellenblock drücken. Führen Sie das Glasfaserkabel in die Klemme ein und drehen Sie es im Uhrzeigersinn.

Und verbinden Sie das andere Ende mit dem Detektor. Handhaben Sie das Glasfaserkabel sorgfältig, da Biegungen zu dessen Bruch führen können. Setzen Sie das Probenfach in das Probenträgersystem ein und rasten Sie es ein.

Befolgen Sie denselben Vorgang, um die Pufferschalen in das Probenhaltesystem einzusetzen. Heben Sie die Klemmleiste an und setzen Sie die Kapillarkassette in den Anschlussblock ein. Drücken Sie die Klemmleiste an beiden Enden herunter und ziehen Sie die Knäufe durch Drehen im Uhrzeigersinn fest.

Schließen Sie die Innentür und anschließend die Fronttür. Schalten Sie abschließend das CE-Instrument durch Drücken des Netzschalters ein. Erstellen Sie die Instrumentenmethode für die Konditionierung.

Konfigurieren Sie die Parameter in der Anfangsbedingungsspalte, einschließlich der Spannung, der Kartusche sowie der Probenspeichertemperatur und der Auslöseeinstellungen. Wählen Sie zweitausendvierzehn als Erfassungs-Wellenlänge. Legen Sie die vom Instrument durchzuführenden Aktionen fest, indem Sie die Parameter in zeitprogrammierte Zellen konfigurieren.

Unter Einbeziehung der spezifischen Einstellungen für jeden Spül-, Injektions- und Trennungsschritt. Führen Sie diesen Vorgang durch, um die Instrumentenmethoden für die Bedingungsfahrt sowie für das Herunterfahren zu erstellen. Der nächste Schritt besteht darin, eine neue Sequenz anzulegen.

Programmieren Sie die Kapillare für die Konditionierung unter Verwendung der Konditionierungsmethode. Wenn die Kapillare zum ersten Mal verwendet wird, programmieren Sie vier Wiederholungen. Andernfalls programmieren Sie zwei Wiederholungen.

Programmieren Sie anschließend die zu analysierenden Proben mithilfe der Laufmethode. Schließlich programmieren Sie die Kapillare zur Lagerung mit der Herunterfahrmethode. Die Kapillarelektrophorese-Analyse ist innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen.

Das erste Ergebnis entspricht dem Histamin-Internalisierungsstandard als Maß für die Leistungsfähigkeit des Adeque-Systems. Anschließend folgen die charakteristischen basischen, Haupt- und sauren Eislformen des Ebaluadith-Monoklonalen Anthiberi. Die gesamte Trennung erfolgt bei einem konstanten Strom von etwa 30 Mikroampere.

Nach Durchführung des Experiments rohe Daten aus der Grab-Software exportieren und zur Verarbeitung über die Empower-Software importieren. Der prozentuale Gehalt jeder Eisform wird nach vertikaler Drop-Line-Integration des Elektropherogrammprofils ermittelt. Hier stellen wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Analyse monoklonaler Aktivitäten bereit, die mittels kapillarer Zellelektrophorese erzeugt wurden.

Zusammen mit mehreren Empfehlungen zur Minderung potenzieller Probleme bietet das vorliegende Protokoll zusätzlich den Vorteil, dass es leicht für die Analyse anderer Proteine angepasst werden kann, indem kurze Modifikationen an den Leitfähigkeits- und pH-Parametern vorgenommen werden.