Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Heutzutage stellt die Kapillarzellelektrophoresetechnik eine der auflösendsten und empfindlichsten Methoden für die Analyse von Biomolekülen wie monokolonalen Antikörpern dar. Die erfolgreiche Implementierung dieser Technik hängt jedoch von den Kenntnissen und Fähigkeiten des Analytikers in den kritischen Schritten während der Proben- und Systemvorbereitung ab. Dieses Tutorial zielt darauf ab, wie man eine erfolgreiche Analyse durchführt, eine wirklich detaillierte Erklärung der Vorbereitung von Lösung und Proben, die Vorbereitung des Kapillarelektrophoresesystems, die Einrichtung der Instrumentenmethode sowie die Datenentscheidung und -verarbeitung.

Insgesamt kann dieses Protokoll für die Entwicklung und Verbesserung der Fähigkeiten des Personals verwendet werden, das an der Vorbereitung von Laboratorien für analytische Chemie beteiligt ist. Wiegen Sie die Menge an HPMC, um eine Endkonzentration von 0,05 Prozent in 100 Milliliter zu erhalten. Da HPMC ein basisches elastisches Polymer ist, gießen Sie den Bounder in einen Glasbecher und fügen Sie langsam 80 Milliliter Wasser hinzu, um die Entmischung des Pulvers aufzuheben.

Spülen Sie dann die Benetzungsschale mit Wasser aus, um Pulverspuren zu entfernen. Die restlichen Regenten wie gewohnt dazugeben und die Lösung verrühren. Passen Sie den PH-Wert mit 50 Prozent saurer Säure auf 4,8 an.

Und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang einwirken. Passen Sie danach den PH-Wert nach Bedarf an. Fügen Sie Wasser hinzu, um das endgültige Volumen von 100 Millilitern zu erhalten.

Die vorbereitete BG-Lösung wird durch eine neutrophile Membran filtriert und in eine Glasflasche gegossen. Beschriften Sie die Glasflasche abschließend entsprechend und lagern Sie sie im Kühlschrank. Zur Vorbereitung der Probe werden in einem ersten Schritt 162 Mikroliter Spurenpufferlösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben.

Fügen Sie dann 18 Mikroliter einer zuvor vorbereiteten Kartenprobe in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter hinzu. In einem dritten Schritt fügen Sie 20 Mikroliter einer zuvor hergestellten einprozentigen Histaminlösung hinzu, um ein endgültiges Probenvolumen von 200 Mikrolitern zu erhalten. Bereiten Sie im nächsten Schritt eine Probe für fünf Sekunden vor.

Und zentrifugieren Sie fünf Sekunden lang. Das Gesamtvolumen der Probe wird abgesaugt. Und geben Sie es nach oben in ein Mikrofläschchen, um Blasenbildung zu vermeiden.

Zum Schluss das Fläschchen verschließen und unter den Kühlschrank stellen. Schalten Sie das CE-Gerät aus, indem Sie den Netzschalter drücken. Und öffnen Sie die Haustür.

Platzieren Sie ein neues bewegliches Tuch unter dem Schnittstellenblock. Spülen Sie die Elektroden mit einer Spülflasche durch den Schnittstellenblock mit Wasser. Lassen Sie das Wasser durch die Löcher tropfen und trocknen Sie den Schnittstellenblock gründlich ab.

Entfernen Sie das überschüssige Wasser vorsichtig mit dem Tuch von den Elektroden. Achten Sie darauf, dass Sie sich während dieses Vorgangs nicht in den Elektroden befinden. Nehmen Sie das Tuch aus dem Probenhaltesystem.

Reinigen Sie die Oberfläche der Probenschalen mit einem neuen, mit Wasser angefeuchteten, unbeweglichen Tuch. Und die Oberfläche der Puffertrays. Schieben Sie die Pufferschalen nach oben, heben Sie das Probenhaltesystem an und reinigen Sie ihre Oberfläche mit dem Tuch.

Bringen Sie die Pufferfächer wieder in Position. Reinigen Sie danach den Schnittstellenblock gründlich. Reinigen Sie die Klemmleiste und das Gehäuse der UV-Lampe.

Probieren Sie das System am Ende unbedingt vor der Verwendung aus. Spülen Sie die Öffnungshebel mit einer Spülflasche mit Wasser ab. Reinigen Sie ihre Oberfläche gründlich mit einem neuen, unbeweglichen Tuch, um Staub und angesammelte Salze zu entfernen.

Probieren Sie sie schließlich unbedingt aus, bevor Sie sie installieren. Reinigen Sie die beiden Enden des Glasfaserkabels mit einem wasserfeuchten Mikrofasertuch und bestätigen Sie den Lichtmast zwischen den Enden. Entfernen Sie eine neue neutrale Kapillare aus der Verpackung.

Bringen Sie nun ein Ende des Schutzschlauchs der Kapillare zur Werkbank. Wickeln Sie den Kunststoffschlauch ab, richten Sie ihn gerade und ziehen Sie die Kapillare vorsichtig aus dem Schlauch heraus. Kleben Sie ein Blatt Papier mit den folgenden Messmarkierungen auf die Werkbank.

Richten Sie das Kapillarfenster wie folgt auf den Nullpunkt auf Zentimeter Messmarkierungen aus:Befestigen Sie danach die Kapillarenden mit Klebeband an der Werkbank. Markieren Sie die Kapillarenden zwei Millimeter außerhalb der Messmarkierungen. Schneiden Sie die Schutzkappe am Kapillarende ab, die am weitesten vom Fenster entfernt ist.

Tauchen Sie das Kapillarende in ein mit Wasser gefülltes CE-Fläschchen, um eine dauerhafte Beschädigung der Innenbeschichtung der Kapillare zu vermeiden. Entfernen Sie die Kapillare aus der Durchstechflasche und führen Sie dieses Ende vorsichtig in die Auslassseite der Patrone ein. Sobald die Kapillare auf der anderen Seite erschienen ist, ziehen Sie wie folgt an dem Notwendigen, bis das Kapillarfenster zentriert zum Kartuschenfenster zentriert ist.

Drehen Sie danach die Patrone um, stecken Sie den Blendenstecker in das Patronenfenster und drücken Sie, um ihn einzurasten. Achten Sie darauf, dass Sie das Kapillarfenster während dieses Vorgangs nicht zerbrechen. Vergewissern Sie sich, dass Licht durch das Fenster fällt, wenn es der breiten Lichtquelle ausgesetzt ist.

Führen Sie die Kapillare in den vorgeformten Kühlmittelschlauch ein, wobei der vorinstallierte Schlauch nicht verwildert ist und ein O-Ring vorhanden ist. Schieben Sie die Kapillare durch den Schlauch, bis die Kapillare auf der anderen Seite erscheint. Führen Sie dann das Ende des Schlauchs an der Auslassseite der Kartusche ein und ziehen Sie die Schlauchmuttern fest.

Führen Sie das Kapillareinlassende in die Einlassseite der Kartusche ein. Sobald die Kapillare auf der anderen Seite erschienen ist, ziehen Sie nach Bedarf. Führen Sie anschließend das Ende des Schlauchs an der Einlassseite der Kartusche ein und ziehen Sie die Schlauchmuttern fest.

Schneiden Sie die Schutzkappe an dem Kapillarende ab, das dem Fenster am nächsten ist. Und installieren Sie die Zellenhalterungsclips über den Kapillarenden und drücken Sie, um wie folgt einzurasten. Schneiden Sie die Kapillarenden unterhalb der Referenzlinien auf den kapillar verlängerten Platten ab.

Achten Sie darauf, die Kapillarenden mit einer Lupe zu inspizieren. Wenn die Kapillarenden nicht glatt sind, polieren Sie sie mit dem Cleven-Stein. Setzen Sie den O-Ring der Blende in das blaue Loch der Blende ein.

Und setzen Sie ihn vorsichtig mit dem O-Ring-Einsetzwerkzeug ein. Setzen Sie abschließend mit Wasser gefüllte CE-Fläschchen in das Kartuschengehäuse ein und legen Sie die Kartusche sofort in das Etui ein, wobei die Kapillarenden in die Fläschchen eingesetzt und im Kühlschrank gelagert werden. Stellen Sie das Pipettenvolumen ein.

Geben Sie das richtige Volumen Wasser in den Puffereinlass mit den Koordinaten A1, B1 und F6. Und zu den Koordinaten des Pufferauslassfachs A1, B1, C1, E6 und F6. HCl 0.1 senkrecht zu den Koordinaten C1 und E6 des Puffereinlauffachs hinzufügen. Fügen Sie BGE zu den Koordinaten D1 und E6 des Puffereinlauffachs hinzu. Und zur Koordinate D1 des Pufferauslassfachs. Verschließen Sie abschließend alle CE-Fläschchen in den Pufferein- und -auslassschalen. Vermeiden Sie während des Eingriffs, die Verschlüsse des Fläschchens zu benetzen, um ein Austreten von Kohlenstoff zu vermeiden. Öffnen Sie die vordere Klappe des CE-Instruments.

Installieren Sie zunächst den UV-Detektor und sichern Sie ihn, indem Sie die Schraube im Uhrzeigersinn drehen. Heben Sie die Innentür an und installieren Sie die Öffnungshebel, indem Sie sie nach oben in den Schnittstellenblock drücken. Stecken Sie das Glasfaserkabel in die Klemme und drehen Sie es im Uhrzeigersinn.

Und verbinden Sie das andere Ende mit dem Detektor. Gehen Sie vorsichtig mit dem Glasfaserkabel um, da es durch Verbiegen brechen kann. Setzen Sie das Probentablett in das Probenhaltesystem ein und rasten Sie ein.

Setzen Sie die Pufferschalen auf die gleiche Weise in das Probenhaltesystem ein. Heben Sie die Klemmstange an und setzen Sie die Kapillarpatrone in den Schnittstellenblock ein. Drücken Sie die Klemmstange an beiden Enden und ziehen Sie die Knöpfe fest, indem Sie sie im Uhrzeigersinn drehen.

Schließen Sie die innere Tür und schließen Sie die vordere Tür. Schalten Sie abschließend das CE-Instrument ein, indem Sie den Netzschalter drücken. Erstellen Sie die Methode des Konditionierungsinstruments.

Konfigurieren Sie die Parameter im Anfangszustandsstab, einschließlich der Spannung, der Kartusche und der Lagertemperatur der Probe sowie der Triggereinstellungen. Wählen Sie zweitausendvierzehn als Erfassungswellenlänge. Deklarieren Sie die Aktionen, die vom Gerät ausgeführt werden sollen, indem Sie die Parameter in zeitprogrammierten Zellen konfigurieren.

Einschließlich der spezifischen Einstellungen für jeden Spül-, Injektions- und Trennschritt. Führen Sie dieses Verfahren durch, um die Methoden zum Ausführen und Herunterfahren des Instruments für die Konditionierung zu erstellen. Der nächste Schritt besteht darin, eine neue Sequenz zu erstellen.

Programmieren Sie die Kapillare für die Konditionierung mit der Konditionierungsmethode. Wenn die Kapillare zum ersten Mal benutzt wird, programmieren Sie vier Wiederholungen. Andernfalls programmieren Sie zwei Wiederholungen.

Programmieren Sie dann die zu analysierenden Proben mit der laufenden Methode. Programmieren Sie abschließend die Kapillare für die Lagerung mit der Abschaltmethode. Die Elektrophorese der Kapillarzellen ist innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen.

Das erste Ergebnis entsprach dem Histamin-internalistischen Standard als Maß für die Leistung des adeque-Systems. Es folgen charakteristische basische, Haupt- und saure Eisformen der monoklonalen Ebaluadith-Anthiberi. Die gesamte Trennung läuft unter einem konstanten Strom von etwa 30 Mikroampere.

Exportieren Sie nach dem Ausführen des Experiments Rohdaten aus der Grab-Software und importieren Sie sie über die Empower-Software zur Verarbeitung. Der prozentuale Gehalt jeder Eisform wird nach vertikaler Dropline-Integration des Elektropharogrammprofils ermittelt. Hier haben wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Analyse monoklonaler Aktivitäten dargestellt, die durch Kapillarzellelektrophorese erzeugt wurden.

Neben mehreren Empfehlungen zur Milderung potenzieller Probleme bietet das vorliegende Protokoll zusätzlich den Vorteil, dass es unter Berücksichtigung kurzer Änderungen der Leitfähigkeits- und PH-Parameter leicht für die Analyse anderer Proteine angepasst werden kann.