Name: Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Kapillarelektrophorese zur Trennung von monoklonalen Antikörper-Isoformen mit neutralem Kapillarprotokoll. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen in der analytischen Chemie.

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Die Autoren danken Wiley für die erteilte Erlaubnis, die Konzepte der folgenden Veröffentlichung für dieses Tutorial zu verwenden. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analyse rekombinanter monoklonaler Antikörper durch Kapillarzonenelektrophorese. Elektrophorese. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Diese Arbeit wurde unterstützt durch CONACyT, Mexiko, Stipendium 230551.

1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Bereiten Sie die BGE - Lösung. <ol><li> Herstellung von 100 ml einer Lösung, bestehend aus 0,05% (m / v) Hydroxypropyl Methylcellulose (HPMC), 200 mM ε-Amino-n-Capronsäure (EACA) und 30 mM Lithiumacetat. HINWEIS: HPMC ein viskoelastisches Polymer ist, gießen Sie das Pulver in ein Becherglas, fügen Sie 80 ml Wasser und schließlich den Rührstab hinzufügen. Weiter zu den übrigen Reagenzien, wie sie normalerweise die Zugabe. Schutzbrille tragen beim Umgang mit Lithium-Acetat, wie es zu Augenreizungen führen kann. </li><li> Passen Sie auf einen pH-Wert 4,8 ± 0,1 mit 50% (v / v) Essigsäure. Lassen Sie die Lösung für 5 min zur Stabilisierung und ggf. korrigieren. </li><li> Fügen Sie Wasser, um bis zu einem endgültigen Volumen von 100 ml in Messkolben. </li><li> Filter durch eine hydrophile Membran mit einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 7 Tage. </li></ol></li><li> Bereiten Sie den internen Standard. <ol><li> Bereiten Sie 1 mleiner Lösung von 1% (m / v) Histamin besteht. </li><li> Filter durch eine hydrophile Membran mit einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 1 Tag. </li></ol></li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten 180 ul mAb Probe mit Tris-Puffer verdünnt (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan, pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l von 1% (m / v) Histamin. </li><li> Mischen und Zentrifugieren bei 1000 × g für 5 Sek. </li><li> Legen Sie ein Mikro Fläschchen in einem Universal-Fläschchen. </li><li> Übertragen Sie die Probe in die Mikro Fläschchen und die Kappe des Universal Fläschchen. Dispense die Probe nach oben, um alle Blasen zu vermeiden einzuführen. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 1 Tag. </li><li> Legen Sie die Universal-Fläschchen (mit Mikrofläschchen, die Probenlösung enthält) in der Probeneinlassfach. </li></ol> 3. Herstellung von CE-System. <ol><li> CE Systemreinigung. HINWEIS: Verhalten thist Verfahren mindestens einmal pro Woche, um elektrischen Strom Leckage aus Ansammlung von Staub und Schmutz abgeleitet zu vermeiden. Jedoch abhängig von der Anwendung (zB Verwendung eines BGE mit erhöhter Viskosität oder mit hoher Salzkonzentration, Proben mit erhöhter Viskosität) Elektroden und Öffnungshebel erfordern häufig gereinigt mehr zu Kreuzkontamination und Probenverschleppung zu vermeiden. <ol><li> Schalten Sie den Netzschalter des CE-Gerät aus und öffnen Sie die vordere Tür. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche der Probe Abdeckung, Probenhaltesystem (Probe und Puffer Tabletts), Patronenabdeckung, Klemmleiste, Schnittstellenblock und Elektroden mit einem mit Wasser angefeuchteten Vlies wischen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten wischen und trocken vor dem Gebrauch. </li><li> Spülen Sie die Öffnungshebel gründlich mit Wasser. Reinigen Sie die Oberfläche mit einem Vlies wischen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten wischen und trocken vor der Installation. </li><li> Reinigen Sie die beiden Enden des Glasfaserkabels vorsichtigly mit einem mit Wasser angefeuchteten Mikrofasertuch. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten Tuch. </li></ol></li><li> Kassetteneinheit. <ol><li> Nehmen Sie eine neue neutrale Kapillare (50 &amp; mgr; m Innendurchmesser) aus der Verpackung. </li><li> Band nach unten ein Ende der Kapillare Schutzschlauch an der Werkbank. Abrollen, begradigen und die Kapillare aus dem Schlauch ziehen. </li><li> Kleben Sie ein Stück Klebeband oder Papier an der Werkbank und fügen Messmarken wie folgt: Länge zum Detektor (30 cm), Kapillar - Fenster (0,2 cm) und einer Länge zum Auslaufende (10 cm) (dh 40,2 cm Gesamtlänge, 30,0 cm effektive Länge). </li><li> Richten Sie die Kapillare Fenster auf die 0,2 cm Messmarke im Referenzpapier. Befestigen Sie die Kapillare mit Band und markieren Sie die Kapillare endet 2 mm außerhalb der Messmarken. </li><li> Schneiden Sie die Schutzkappe an der Kapillareinlass Ende (das Ende der am weitesten vom Fenster) in einer einzigen geraden Bewegung den Flush Rand des Abspaltungs Stein verwenden.<ol><li> Tauchen Sie die Kapillare Ende in einem verschlossenen Universal-Fläschchen mit Wasser gefüllt, um dauerhafte Schäden an der kapillaren Innenbeschichtung zu vermeiden. Wiederholen Sie jedes Mal, dieses Verfahren das kapillare Ende für mehr als 1 min der Umgebung ausgesetzt ist. </li></ol></li><li> Legen Sie die Kapillareinlass Ende in die Ausgangsseite der Patrone. </li><li> Schieben und die Kapillare durch die Patrone nach Bedarf ziehen, bis die Kapillare Fenster in die Kassette Fenster zentriert ist. </li><li> Legen Sie die Blende Stecker (100 &amp; mgr; m × 200 &amp; mgr; m) in das Kassettenfenster. HINWEIS: Bestätigen, dass weißes Licht durch das Fenster, wenn zu einer weißen Lichtquelle ausgesetzt wird. Wenn das Licht, das ein bräunliches Aussehen hat durchläuft, ggf. einstellen. </li><li> Legen Sie die Kapillare in die vorgeformten Kühlmittelrohrleitung für insgesamt Kapillarlänge von 40,2 cm (mit vorinstallierter Schlauchmutter, Zwinge und O-Ring an beiden Enden in dieser Reihenfolge). </li><li> Schieben Sie die Kapillare durch die coolant Schlauch wie nötig, bis die Kapillare an der anderen Seite des Schlauchs erscheint. </li><li> Führen Sie das Ende des Kühlmittelrohrleitung in die Ausgangsseite der Patrone und ziehen Sie die Schlauchmutter. </li><li> Legen Sie die Kapillareinlass Ende in die Einlassseite der Patrone. </li><li> Hub und die Kapillare durch die Patrone nach Bedarf ziehen, bis die Kapillare an der Einlassseite der Kassette angezeigt wird. </li><li> Führen Sie das Ende des Kühlmittelrohrleitung in die Einlassseite der Patrone und ziehen Sie die Schlauchmutter. </li><li> Schneiden Sie die Schutzkappe an der Kapillarauslass Ende (das Ende nächsten aus dem Fenster) in einer einzigen geraden Bewegung den Flush Rand des Abspaltungs Stein verwenden. </li><li> Legen Sie die Dichtung-Halteklammern über die Kapillare Enden und drücken Sie in die richtige Position zu schnappen. Sichtprüfung der Kapillare endet. Wenn sie nicht einmal sind, wiederholen Sie den Vorgang. </li><li> Legen Sie die Kapillare Länge Vorlage auf dem Rand der Werkbank. </li><li> Legen Sie die Patrone nach unten against die Kapillare Länge Schablone und richten Sie die Kapillare mit den Referenzlinien auf der Vorlage endet. Wenn die Kapillare Messmarken (siehe 3.2.4) nicht mit den Referenzlinien ausrichten, ggf. einstellen. </li><li> Halten Sie die Kapillare gegen die kapillare Länge Schablone und schneiden beide Enden der Kapillare auf der Vorlage die flush Kante des Abspalten Stein 2 mm unterhalb der Referenzlinien verwendet wird. </li><li> Sichtprüfung der Kapillare mit einem Vergrößerungsglas endet. Wenn Kapillarenden nicht glatt sind, polieren sie das weiche Gesicht des Abspaltungs Stein verwenden. </li><li> Legen Sie die Öffnung O-Ring in die Öffnung Zündkerzenloch den O-Ring Einsatzwerkzeug verwendet wird. </li><li> Installieren Sie mit einer Kappe bedeckt Universal gefüllt Fläschchen mit Wasser in das Kassettengehäuse und Platz Patrone in Fall sofort mit Kapillar-Enden in Ampullen eingesetzt. Für Kurz- und Langzeitlagerung halten bei 2-8 ° C. </li></ol></li><li> Herstellung von Puffer Tabletts. <ol><li> Füllen Sie und legen Sie mit einer Kappe bedeckt universal Phiolen in dem Puffer Eintritts- und Austrittswannen (Abbildung 1). Wiederholen Sie Fläschchen Positionen in den Spuren 2, 3, 4 und 5 gemäß der Anzahl der zu analysierenden Proben, eine Spur für alle sechs Probeninjektionen platzieren. HINWEIS: Vermeiden Sie die Fläschchen-Kappen, um Frittstrom Auslaufen zu verhindern. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Abbildung 1: Lage und den Füllstand des Universalfläschchen in den Puffer Einlass und Auslass Tabletts. Füllstände: 1/1 = 1400 &amp; mgr; l, 3/4 = 1300 &amp; mgr; l und 1/2 = 1000 &amp; mgr; l. Abkürzungen: W = Wasser, HCl = 0,1 M Salzsäure. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> CE Systemkomponenten Montage. <ol><li> Installieren Sie den UV-Detektor. </li><li> Installieren Sie die Öffnungshebelindem sie in den Schnittstellenblock nach oben drücken. </li><li> Installieren Sie das Glasfaserkabel. Legen Sie die entsprechende Ende mit der Klemmleiste und, während beide Enden halten, drehen im Uhrzeigersinn. Schließen Sie das andere Ende mit dem UV-Detektor. HINWEIS: Behandeln Sie das Glasfaserkabel mit Sorgfalt während dieses Verfahrens, da Biegen seiner Fraktur verursachen könnte. </li><li> Platz Probe und Puffer Tabletts in den Probenhaltesystem und einrasten. </li><li> Legen Sie die Kapillarpatrone in den Schnittstellenblock und, während Sie die Klemmleiste an beiden Enden, ziehen Sie die Knöpfe. </li></ol></li></ol> 4. Instrument Methoden Set-up <ol><li> Erstellen Sie die Anlage, Laufen und Shutdown-Instrument Methoden nach mit den folgenden Parametern und Tabelle 1: Spannung, max: 30,0 kV; Strom, max: 300,0 uA; Cartridge Temperatur: 20,0 ° C; Probenlagertemperatur: 10,0 ° C; UV-Detektor Anfangsbedingungen: Wellenlänge: 214 nm; Datenrate: 4 Hz; Filter: Normal; Peakbreite (Punkte): 16-25; Absorptions-Signal: Direct. HINWEIS: Datenerfassungsrate erhöht werden kann, bis zu 25 Hz, um die Abdeckung der schmalen Trennzonen zu verbessern. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> Konditionierungsverfahren Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td> Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td> &lt;td&gt; Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Separate - Spannung </td><td> 15,0 KV </td><td> 10,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min Rampe, normale Polarität </td><td> Getrennte </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2758 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20,01 </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> Rinse-Tipps </td></tr><tr><td colspan="8"> Laufende Verfahren Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td&gt; Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 4,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Spritzen - Druck </td><td> 34 mbar </td><td> 20,0 sec </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> Außer Kraft setzen, nach vorne </td><td> Probeninjektion </td></tr><tr><td> - </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,4 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wash-Tipps </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Separate - Spannung </td><td> 15,0 KV </td><td> 30,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min Rampe, normale Polarität, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Probentrenn </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> Auto Zero </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30,01 </td><td> Stopp-Daten </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30,02 </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> 32,03 </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Rinse-Tipps </td></tr><tr><td> 32,04 </td><td> Ende </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Ende </td></tr><tr><td colspan="8"> Shutdown-Methode Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td> Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> Vorwärts </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 6,0 min </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> Vorwärts </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Lampe - Aus </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> Rinse-Tipps </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Konditionierung, Laufen und Shutdown - Zeit - Programme. 5. Datenerfassung und -verarbeitung <ol><li> Programmieren Sie die Probe eingestellt. <ol><li> Programmieren Sie die Kapillare für die Konditionierung der Konditionierung Instrument Methode. Wenn die Kapillare zum ersten Mal verwendet wird, Programm vier Wiederholungen; programmieren sonst nur zwei Wiederholungen des Konditionierungsmethode. </li><li> Programm, um die Proben werden analysiert, um die ablaufenden Instrumenten-Methode. </li><li> Programmieren Sie die Kapillare zur Speicherung der Shutdown Instrument Methode und wiederholen Sie den in Abschnitt 3.2.22 Verfahren. </li></ol></li><li> Führen Sie das Experiment. </li><li> Exportieren Sie die Elektropherogramme. </li><li> Berechnen Sie die Migrationszeit und der Anteil an Grund-, Haupt-and sauren Isoformen vertikalen Falllinie Integration des Elektropherogramm-Profil. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz und Emilio Medina-Rivero sind Mitarbeiter der Probiomed S.A. de C.V., die Biosimilar-Produkte entwickelt, herstellt und vermarktet. Alle Autoren sind an der Entwicklung von Biosimilar-Produkten für Probiomed beteiligt.

In diesem Tutorial zeigen wir die Bedeutung der richtigen Praktiken bei der Durchführung von CZE von mAb analysiert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, um erfolgreich zu sein. Wenn jedoch CZE auf einer Routinebasis verwendet wird, Probleme entstehen zwangsläufig 12. Für die besten Ergebnisse ist es wichtig, die Hinweise zu folgen, die das ganze Protokoll aufgenommen wurden, da sie den Analytiker schwierige Schritte zu überwinden und zu beheben helfen. Eine wichtige Überlegung o...

Monoklonale Antikörper (mAb) sind Biotherapeutikum Proteine mit steigendem Interesse aufgrund ihrer Handlungsfähigkeit gegen mehrere chronische und degenerative Krankheiten 1. Wie andere Biomoleküle sind mAbs anfällig mehrere physikalisch - chemische Modifikationen in allen Phasen ihres Lebenszyklus zu unterziehen (dh von Biosynthese zum Endprodukt). Solche Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf : Desamidierung, Glykosylierung, Oxidation, Cyclisierung, Isomerisierung, Aggregation und proteolytische Spaltung 2. Daher analytische Techniken der Lage intrinsische Isoformen zu lösen sind erforderlich mAbs Heterogenität und Stabilität, um zu überwachen, um Qualitätsanforderungen herzustellen. Kapillarelektrophorese (CE) ist ein Hochleistungstrenntechnik outinside eines schmalen Quarzglasröhre (&amp; mgr; m-Bereich) gefüllt durch mit einem Hintergrundelektrolyten (BGE). Bei Anlegen eines elektrischen Feldes (bis zu 30.000 V), geladenes Moleküls wandern in Richtung der Elektrode mit entgegengesetzter Ladung (dh elektrogetriebene Trennung). Die Verwendung von hohen Spannungen in CE ermöglicht schnelle Analysen und erhöhte Effizienz, die der Elektrophorese klassischen Gel überlegen sind. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist eine CE-basierte Technik routinemäßig in der biopharmazeutischen Industrie für die Produktqualität Beurteilung verwendet 3-9. Im Gegensatz zu anderen Formen der CE (zB Kapillar - Gel - Elektrophorese, Kapillar - isoelektrische Fokussierung) oder Chromatographie-basierte Methoden können CZE ohne Verwendung von Denaturierungsmitteln oder Festphasen - Schnittstellen durchgeführt werden, so dass die Analyse der inhärenten Heterogenität der mAbs nahe an ihrem nativen Zustand 10 . CZE Trennung von mAb - Isoformen auftritt innerhalb einer Fused-Silica - Kapillare mit einem hydrophilen Polymer (neutral Kapillare) abgedeckt und auf der Basis ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität, die durch Ladung, Masse, Größe und Form (oder hydrodynamischen Volumen) 11 ausgeschlossen ist. mAb-Einheiten detektiert, wennsie mobilisiert und durch das Erfassungsfenster, das 4 durch ein Ultraviolett (UV) Absorptionsdetektor bei 214 nm gemessen wird. Die erfolgreiche Umsetzung dieser Analysetechnik wird vor und während des Experiments zu Details über angemessene Aufmerksamkeit abhängen. Acting sonst wird die Kosten und die Zeit erhöhen, um die Analyse durchzuführen, was letztlich zu konstanten Versagen und Frustration führen. Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, eine erfolgreiche Analyse von mAb Heterogenität durch CZE durch die detaillierte Erläuterung der Herstellung von Lösungen und Proben durchzuführen, die Herstellung von CE-System, das Instrument Verfahren einzurichten, die Datenerfassung und das Verarbeiten. Für die Zwecke dieses Tutorial, eine rekombinante vollständig humanen Anti-Tumor-Nekrose-Faktor alpha (anti-TNF) mAb als Proteinmodell verwendet wird; jedoch kann dieses Protokoll leicht für die Analyse von anderen Proteinen unter Berücksichtigung kurze Änderungen angepasst werden. EINußerdem, mehrere Empfehlungen zu mildern sind mögliche Probleme vorgeschlagen. Der Leser wird aufgefordert, zu streng, die vorgeschlagene Protokoll folgen, da die Wahrscheinlichkeit erhöhen, um erfolgreich zu sein.

<table><tbody><tr><td>Eisessig</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure in ACS-Qualität</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamindihydrochlorid</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr> <tr><td>(Hydroxypropyl) methylcellulose</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocapronsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris-Puffer, 50,0 mM,&nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Pharmazeutisches Analysesystem</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Neutralkapillare&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen, Mikro, 200 & Mikro; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Universal-Fläschchenkappen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Universalfläschchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>Kabel, Optik, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis Detektormodul</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>144738</tr></tbody></table>

kapillarelektrophorese trennung des monoklonalen antikörpers isoformen eine neutral kapillare

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Biotherapeutische Proteine, wie monoklonale Antikörper (mAbs), sind praktikable Alternativen für die Behandlung chronisch-degenerativer Krankheiten. Die biologische Aktivität dieser Proteine hängt von ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften ab. Der Einsatz von Hochleistungstechniken wie Chromatographie und Kapillarelektrophorese wurde für die Analyse der physikochemischen Heterogenität von mAbs beschrieben. Heutzutage stellt die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) einen der auflösendsten und empfindlichsten Assays für die Analyse von Biomolekülen dar. Darüber hinaus wird die elektrogetriebene Trennung in CZE von umfangreichen Eigenschaften der Materie bestimmt und bietet den Vorteil, dass Proteine nahe an ihrem nativen Zustand analysiert werden können. Die erfolgreiche Implementierung dieser Technik für die Routineanalytik hängt jedoch von den Fähigkeiten des Analytikers in den kritischen Schritten während der Proben- und Systemvorbereitung ab. Der Zweck dieses Tutorials besteht darin, die Schritte zum Erfolg bei der CZE-Analyse von mAbs zu beschreiben. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Entwicklung und Verbesserung der Fähigkeiten des Personals verwendet werden, das in Laboratorien für analytische Proteinchemie tätig ist.

Figur 2 zeigt den typischen elektrischen Stromprofil eines 200 mM EACA, 30 mM Lithiumacetat, pH 4,8 BGE mit anti-TNF &amp; agr; mAb Probe mit Tris - Puffer (50 mM, pH 8,0). Wie beobachtet werden kann, ist der Strom in der gesamten Analyse stabil und zwischen Werten von 30 bis 35 &amp; mgr; A oszillieren kann. Abbildung 3 zeigt die CZE Elektropherogramm einer Blindprobe , wo der detektierte Peak, der dem Histamin interner Standard entspricht. Es ist für H...

Hier präsentieren wir ein umfassendes Kapillarzonenelektrophoreseprotokoll zur Beurteilung der intrinsischen physikochemischen Heterogenität von monoklonalen Antikörpern als Qualitätsmerkmal.

Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Heutzutage stellt die kapillare Zellelektrophorese eine der auflösendsten und empfindlichsten Methoden für die Analyse von Biomolekülen wie monoklonalen Antikörpern dar. Die erfolgreiche Anwendung dieser Technik hängt jedoch vom Wissen und den Fähigkeiten des Analysten in kritischen Schritten während der Probenvorbereitung und Systemvorbereitung ab. Dieses Tutorial zielt darauf ab, detailliert zu erläutern, wie eine erfolgreiche Analyse durchgeführt wird, einschließlich der genauen Vorbereitung von Lösungen und Proben, der Vorbereitung des Kapillarelektrophorese-Systems, der Instrumentenmethode, sowie der Datenbewertung und -verarbeitung.Insgesamt kann dieses Protokoll zur Entwicklung und Verbesserung der Fähigkeiten des Personals, das an der Vorbereitung analytischer Chemielabore beteiligt ist, verwendet werden. Wiegen Sie die Menge an HPMC ab, um eine Endkonzentration von 0,05 Prozent in 100 Milliliter zu erhalten. Da HPMC ein grundlegender elastischer Polymer ist, gießen Sie als ersten Schritt den Bindemittelstoff in ein Glasbecherglas und fügen Sie langsam 80 Milliliter Wasser hinzu, um das Pulver zu desaggregieren.Danach spülen Sie die Befeuchtungsschale mit Wasser, um Puderspuren zu entfernen. Geben Sie die restlichen Reagenzien wie üblich hinzu und rühren Sie die Lösung um. Stellen Sie den pH-Wert mit 50 Prozent Essigsäure auf 4,8 ein.Und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang stabilisieren. Danach den pH gegebenenfalls einstellen. Wasser hinzufügen, um das Endvolumen von 100 Milliliter zu erreichen.Filtern Sie die hergestellte BG-Lösung durch eine neutrophile Membran und gießen Sie sie in eine Glasflasche. Beschriften Sie abschließend die Glasflasche entsprechend und lagern Sie sie gekühlt. Um die Probe vorzubereiten, geben Sie als ersten Schritt 162 µL Pufferpufferlösung in ein 1,5-mL-Röhrchen.Dann 18 Mikroliter einer zuvor hergestellten Map-Probe mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter hinzufügen. Als dritten Schritt 20 Mikroliter einer zuvor hergestellten einprozentigen Histaminlösung hinzufügen, um ein Endvolumen der Probe von 200 Mikrolitern zu erhalten. Nächster Schritt: Eine Probe fünf Sekunden lang vorbereiten.Und zentrifugieren Sie fünf Sekunden lang. Aspirieren Sie das gesamte Probenvolumen. Geben Sie die Probe dann nach oben in ein Mikrovial, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.Schließen Sie schließlich das Gefäß mit einem Deckel und lagern Sie es gekühlt. Schalten Sie das CE-Gerät aus, indem Sie den Netzschalter drücken. Und öffnen Sie die Fronttür.Legen Sie ein neues Bewegungstuch unter den Interface-Block. Spülen Sie die Elektroden durch den Interface-Block mit Wasser unter Verwendung einer Sprühflasche. Lassen Sie das Wasser durch die Löcher tropfen und trocknen Sie den Interface-Block gründlich ab.Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser von den Elektroden mit dem Tuch. Achten Sie darauf, während dieses Vorgangs nicht in den Elektroden zu sein. Entfernen Sie das Tuch aus dem Probenträgersystem.Reinigen Sie die Oberfläche der Probenschalen mit einem neuen, mit Wasser angefeuchteten, nicht fuselnden Tuch. Und die Oberfläche der Puffergefäße. Schieben Sie die Puffergefäße nach oben, heben Sie das Probenträgersystem an und reinigen Sie deren Oberfläche mit dem Tuch.Bewegen Sie die Pufferbehälter wieder an ihre Position. Danach reinigen Sie den Schnittstellenblock gründlich. Reinigen Sie den Klemmstab und das Gehäuse der UV-Lampe.Am Ende sollten Sie das System vor der Verwendung unbedingt testen. Spülen Sie die Öffnungshebel mit Wasser unter Verwendung einer Sprühflasche ab. Reinigen Sie ihre Oberfläche gründlich mit einem neuen, fusselfreien Tuch, um Staub und angesammelte Salze zu entfernen.Testen Sie diese schließlich, bevor Sie sie installieren. Reinigen Sie die beiden Enden des Glasfaserkabels mit einem mit Wasser angefeuchteten Mikrofasertuch und überprüfen Sie das Licht zwischen den Enden. Entnehmen Sie eine neue neutrale Kapillare ihrer Verpackung.Nehmen Sie nun ein Ende des Schutzschlauchs der Kapillare auf die Arbeitsfläche. Entrollen und richten Sie den Kunststoffschlauch und ziehen Sie die Kapillare vorsichtig aus dem Schlauch heraus. Befestigen Sie ein Stück Papier auf der Arbeitsfläche mit den folgenden Maßstabsmarkierungen.Richten Sie das Kapillarfenster an den Zentimeter-Maßmarken am Nullpunkt aus, wie folgt: Befestigen Sie danach die Kapillarenden mit Klebeband auf der Arbeitsfläche. Markieren Sie die Kapillarenden zwei Millimeter außerhalb der Messmarkierungen. Schneiden Sie die Schutzkappe am kapillaren Ende, das am weitesten vom Fenster entfernt ist, ab.Und tauchen Sie das Kapillarendstück in ein CE-Gefäß, das mit Wasser gefüllt ist, um eine dauerhafte Beschädigung der inneren Beschichtung der Kapillare zu vermeiden. Entfernen Sie die Kapillare aus dem Gefäß und setzen Sie dieses Ende vorsichtig in die Auslassseite der Kartusche ein. Sobald die Kapillare auf der anderen Seite erscheint, ziehen Sie so weit nötig, bis das Kapillarfenster mittig zum Fenster der Kartusche ausgerichtet ist, wie folgt.Danach das Kartusche umdrehen und den Abdeckstopfen in das Kartuschenfenster einsetzen, indem man andrückt, bis er einrastet. Achten Sie darauf, das Kapillarfenster während dieses Vorgangs nicht zu beschädigen. Überprüfen Sie, ob Licht durch das Fenster hindurchtritt, wenn es einer breiten Lichtquelle ausgesetzt wird.Führen Sie die Kapillare in die vorgefertigte Kühlmittelleitung mit vorinstallierter Leitung nicht feral und O-Ring ein. Schieben Sie die Kapillare durch die Leitung, bis die Kapillare an der anderen Seite erscheint. Stecken Sie dann das Ende der Leitung an der Auslassseite der Kartusche ein und ziehen Sie die Leitungsverschraubungen fest. Führen Sie das Einlassende der Kapillare in die Einlassseite der Kartusche ein. Sobald die Kapillare auf der anderen Seite erscheint, ziehen Sie sie entsprechend heraus. Danach führen Sie das Ende des Schlauchs in die Einlassseite der Kartusche ein und ziehen die Schlauchmuttern fest.Schneiden Sie die Schutzkappe am kapillaren Ende, das am weitesten vom Fenster entfernt ist, ab. Bringen Sie die Halteklammern für die Kapillare an den kapillaren Enden an, indem Sie sie wie folgt eindrücken, bis sie einrasten. Schneiden Sie die kapillaren Enden unterhalb der Bezugsstriche auf den verlängerten Kapillarplatten ab.Überprüfen Sie die Kapillarenden unbedingt mit einer Lupe. Falls die Kapillarenden nicht glatt sind, glätten Sie sie mit dem Cleveland-Stein. Setzen Sie den Dichtungsring in die blaue Öffnung ein.Und setzen Sie es vorsichtig mit dem O-Ring-Einbautool ein. Bringen Sie schließlich CE-Fläschchen, die mit Wasser gefüllt sind, in das Kartuschengehäuse an, und setzen Sie die Kartusche unverzüglich ein, wobei die Kapillarenden in die Fläschchen eingeführt werden, und lagern Sie sie gekühlt. Stellen Sie das Pipettenvolumen ein.Fügen Sie die korrekte Wassermenge in den Pufferzulauf an den Tray-Koordinaten A1, B1 und F6 sowie in den Pufferablauf an den Tray-Koordinaten A1, B1, C1, E6 und F6 hinzu. Geben Sie 0,1 normales HCl zu den Pufferzulauf-Koordinaten C1 und E6. Fügen Sie außerdem BGE den Pufferzulauf-Koordinaten D1 und E6 sowie der Pufferablauf-Koordinate D1 hinzu. Verschließen Sie abschließend alle CE-Fläschchen in den Pufferzulauf- und -ablauf-Trays. Vermeiden Sie während des Vorgangs, die Fläschchenverschlüsse zu benetzen, um Kohlenstoffleckage zu verhindern. Öffnen Sie die Fronttür des CE-Geräts.Installieren Sie zuerst den UV-Detektor und befestigen Sie ihn, indem Sie die Schraube im Uhrzeigersinn drehen. Heben Sie die Innentür an und installieren Sie die Öffnungshebel, indem Sie sie nach oben in den Schnittstellenblock drücken. Führen Sie das Glasfaserkabel in die Klemme ein und drehen Sie es im Uhrzeigersinn.Und verbinden Sie das andere Ende mit dem Detektor. Handhaben Sie das Glasfaserkabel sorgfältig, da Biegungen zu dessen Bruch führen können. Setzen Sie das Probenfach in das Probenträgersystem ein und rasten Sie es ein.Befolgen Sie denselben Vorgang, um die Pufferschalen in das Probenhaltesystem einzusetzen. Heben Sie die Klemmleiste an und setzen Sie die Kapillarkassette in den Anschlussblock ein. Drücken Sie die Klemmleiste an beiden Enden herunter und ziehen Sie die Knäufe durch Drehen im Uhrzeigersinn fest. Schließen Sie die Innentür und anschließend die Fronttür. Schalten Sie abschließend das CE-Instrument durch Drücken des Netzschalters ein. Erstellen Sie die Instrumentenmethode für die Konditionierung.Konfigurieren Sie die Parameter in der Anfangsbedingungsspalte, einschließlich der Spannung, der Kartusche sowie der Probenspeichertemperatur und der Auslöseeinstellungen. Wählen Sie zweitausendvierzehn als Erfassungs-Wellenlänge. Legen Sie die vom Instrument durchzuführenden Aktionen fest, indem Sie die Parameter in zeitprogrammierte Zellen konfigurieren.Unter Einbeziehung der spezifischen Einstellungen für jeden Spül-, Injektions- und Trennungsschritt. Führen Sie diesen Vorgang durch, um die Instrumentenmethoden für die Bedingungsfahrt sowie für das Herunterfahren zu erstellen. Der nächste Schritt besteht darin, eine neue Sequenz anzulegen.Programmieren Sie die Kapillare für die Konditionierung unter Verwendung der Konditionierungsmethode. Wenn die Kapillare zum ersten Mal verwendet wird, programmieren Sie vier Wiederholungen. Andernfalls programmieren Sie zwei Wiederholungen.Programmieren Sie anschließend die zu analysierenden Proben mithilfe der Laufmethode. Schließlich programmieren Sie die Kapillare zur Lagerung mit der Herunterfahrmethode. Die Kapillarelektrophorese-Analyse ist innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen.Das erste Ergebnis entspricht dem Histamin-Internalisierungsstandard als Maß für die Leistungsfähigkeit des Adeque-Systems. Anschließend folgen die charakteristischen basischen, Haupt- und sauren Eislformen des Ebaluadith-Monoklonalen Anthiberi. Die gesamte Trennung erfolgt bei einem konstanten Strom von etwa 30 Mikroampere.Nach Durchführung des Experiments rohe Daten aus der Grab-Software exportieren und zur Verarbeitung über die Empower-Software importieren. Der prozentuale Gehalt jeder Eisform wird nach vertikaler Drop-Line-Integration des Elektropherogrammprofils ermittelt. Hier stellen wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Analyse monoklonaler Aktivitäten bereit, die mittels kapillarer Zellelektrophorese erzeugt wurden.Zusammen mit mehreren Empfehlungen zur Minderung potenzieller Probleme bietet das vorliegende Protokoll zusätzlich den Vorteil, dass es leicht für die Analyse anderer Proteine angepasst werden kann, indem kurze Modifikationen an den Leitfähigkeits- und pH-Parametern vorgenommen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

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