Kapillarelektrophorese zum Monitor Peptid Verpflanzen auf Chitosanfilme in Echtzeit

Das übergeordnete Ziel dieser Kapillarelektrophorese-Methode ist es, die Pfropfreaktion von Peptiden auf Chitosanfilme in Echtzeit zu überwachen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der analytischen Chemie und der Polymerchemie zu beantworten, z. B. wie die Reaktion abläuft und wie effizient der Pfropfprozess ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Probenvorbereitung erforderlich ist und das Reaktionsgemisch in Echtzeit analysiert werden kann.

Diese Methode kann zwar Einblicke in Reaktionsprozesse geben, aber auch auf ein System angewendet werden, z. B. auf die Bindung eines Krebsmedikaments an einen Wirkstoffträger oder die Verdauung von Reis oder Frühstückscerealien. Wiegen Sie zwei Gramm Eisessig ab und vervollständigen Sie sie mit Reinstwasser auf 100 Milliliter. Fügen Sie 100 Milliliter der wässrigen Essigsäurelösung mit 2 % Massenprozent zu 1,7 Gramm Chitosanpulver hinzu.

Fünf Tage lang mit einem Rührstab und einer magnetischen Rührplatte bei Raumtemperatur umrühren, entweder mit Alufolie abgedeckt oder im Dunkeln. Die Chitosan-Dispersion wird eine Stunde lang bei 1.076 mal g bei 23 Grad Celsius zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren den Überstand mit einer Spritze auffangen und den Niederschlag verwerfen.

Für jeden Film aliquotieren Sie 10 Milliliter der Chitosan-Suspension in eine neun Zentimeter große Petrischale aus Kunststoff bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Folien abgedeckt mindestens sieben Tage trocknen. Schneiden Sie die trockenen Folien mit einer Schere in ein Stück Zentimeter große Quadrate.

Das Experiment kann zu diesem Zeitpunkt pausiert werden. Spülen Sie 10 quadratische Chitosanfilme in fünf Millilitern PBS zwei Stunden lang in einer Petrischale bei Raumtemperatur. Bereiten Sie während dieser Zeit das Kapillarelektrophorese-Instrument vor und validieren Sie es.

Bereiten Sie eine 43,5 Zentimeter lange Kapillare aus blankem Quarzglas mit einem Innendurchmesser von 50 Mikrometern vor, indem Sie die Polymer-Außenbeschichtung der Kapillare in der eingestellten Länge mit einem stumpfen Utensil schwächen und dann die Kapillare abbrechen. Erstellen Sie ein Fenster für die Kapillare, indem Sie die Polymerbeschichtung mit einem Feuerzeug in einem Abstand von 8,5 Zentimetern vom Einlass verbrennen. Nachdem die Kapillare abgekühlt ist, wischen Sie sie mit Ethanol sauber.

Brennen Sie dann die Beschichtung der Kapillare an jedem Ende einige Millimeter lang mit einem Feuerzeug durch. Wischen Sie es nach dem Abkühlen ein zweites Mal mit Ethanol sauber. Platzieren Sie die Kapillare in das Erfassungsfenster und installieren Sie sie in der Kapillarkassette, indem Sie sie in gleichen Längen in den Ein- und Auslass einsetzen und um die Spindeln der Kassette wickeln.

Setzen Sie dann die Kassette in das Kapillarelektrophorese-Instrument ein. Legen Sie die Parameter der Methode für jede Trennung fest. Wählen Sie im Softwaremenü Methode und dann Gesamte Methode bearbeiten aus.

Wählen Sie die Registerkarte CE aus, um die CE-Bedingungen zu bearbeiten. Stellen Sie die Temperatur, die Zeit, die Spannung und die Fläschchen ein, die für die Trennung verwendet werden. Legen Sie im Abschnitt Vorkonditionierung die aufeinanderfolgenden Spülungen fest.

Verwenden Sie 10 Minuten mit einem molaren Natriumhydroxid, fünf Minuten mit 0,1 molaren Natriumhydroxid, fünf Minuten mit ultrareinem Wasser und fünf Minuten mit 75 Millimolar Natriumboratpuffer bei pH 9,2 für die erste Methode in der Sequenz. Überprüfen Sie die anderen Methoden in der Reihenfolge, indem Sie das gleiche Verfahren befolgen. Für die nachfolgenden Methoden stellen Sie die aufeinanderfolgenden Spülungen in der Vorkonditionierungssektion auf eine Minute mit einem molaren Natriumhydroxid und fünf Minuten mit 75 Millimolar Natriumboratpuffer bei pH 9,2 ein.

Stellen Sie im Abschnitt Injektion die Parameter für eine hydrodynamische Injektion mit 30 Millibar Druck für 10 Sekunden für alle Methoden ein. Legen Sie im Abschnitt Trennung die Trennbedingungen für alle Methoden auf 30 Kilovolt und neun Minuten lang auf 25 Grad Celsius fest. Injizieren und trennen Sie einen neutralen internen Standard.

Verwenden Sie für den neutralen internen Standard 10 Mikroliter DMSO mit 10 Vol.-% in Wasser, verdünnt in 450 Mikrolitern 75 Millimolar Natriumboratpuffer. Stellen Sie vor dem Starten der Sequenz sicher, dass die Sequenzparameter auf den richtigen Ordner und die richtige Dateinummer eingestellt sind. Drücken Sie dann die Sequenz, um das Experiment zu starten.

Die Trennung der Standards ermöglicht die Validierung des Instruments, bevor ein Experiment durchgeführt wird. Dies ist für ein erfolgreiches Experiment unerlässlich. Injizieren und trennen Sie dann auf die gleiche Weise einen Oligoacrylat-Standard, um die Gültigkeit der Kapillare zu überprüfen.

Pausieren Sie die Sequenz hier, bis die Transplantationsreaktion startbereit ist. Um die Transplantation von RGDS auf Chitosanfilm durchzuführen, wiegen Sie zunächst das Peptid und die Haftvermittler ab. Zwei Stunden nach Beginn des Einweichens des Chitosanfilms in PBS lösen Sie das Peptid und die Haftvermittler in fünf Millilitern PBS auf.

Nehmen Sie ein Aliquot von 50 Mikrolitern dieser Lösung und fügen Sie zwei Mikroliter DMSO mit 10 Vol.-% DMSO in Wasser als internen Neutralstandard hinzu. Analysieren Sie das Aliquot mit Kapillarelektrophorese unter den gleichen Analysebedingungen wie zuvor. Entfernen Sie als Nächstes das PBS, mit dem die Chitosanfilme aus der Petrischale gespült wurden.

Geben Sie die Fünf-Milliliter-Lösung aus Peptid und Haftvermittlern in die Petrischale, die die Chitosanfilme enthält. Decken Sie die Petrischale mit Paraffinfolie ab und legen Sie sie bei Raumtemperatur auf einen Orbitalschüttler. Nehmen Sie 50 Mikroliter Aliquots Reaktionsmedium zu festgelegten Zeitpunkten ein.

Die aus dem Reaktionsmedium entnommenen Aliquote müssen sofort analysiert werden. Die entsprechenden Schritte müssen in schneller Folge unternommen werden, um eine Echtzeitanalyse zu ermöglichen. Geben Sie zwei Mikroliter DMSO von 10 Vol.-% in Wasser als internen Neutralstandard zu jedem Aliquot.

Analysieren Sie die Aliquote mit Kapillarelektrophorese, sobald sie entnommen werden. Spülen Sie die Kapillare nach Abschluss der Trennungen 10 Minuten lang mit Reinstwasser. Nach vierstündigem Schütteln und Entfernen des Aliquots nehmen Sie die Petrischale aus dem Shaker.

Nachdem Sie das Reaktionsmedium aus der Petrischale genommen haben, fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu, um die Chitosanfilme zu spülen. Nehmen Sie das PBS aus der Petrischale, spülen Sie die Chitosanfilme mit Reinstwasser ab und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Lagern Sie die Filme bei minus 20 Grad Celsius in einer Petrischale aus Kunststoff.

Repräsentative Ergebnisse des ersten Aliquots der chemischen Reaktion zeigen eine Trennung der verschiedenen chemischen Reaktanten. Der RGDS-Peptidpeak zu diesem Zeitpunkt ist der Ausgangspunkt der Reaktion und kann zur Quantifizierung der Transplantateffizienz verwendet werden. Da die Transplantationsreaktion kontinuierlich überwacht wird, nimmt die Fläche des RGDS-Peaks weiter ab, bis sie konstant bleibt, was das Ende des Experiments bedeutet.

Ein zweiter Peak auf der rechten Seite des EDC-HCl-Peaks erscheint, wie erwartet, wenn die Reaktion fortschreitet. Eine Integration des RGDS-Peaks über die Zeit ermöglicht es, den Peptidverbrauch zu berechnen. Die NMR-Spektroskopie im geschwollenen Zustand von Chitosanfilmen in PBS ermöglicht den Nachweis der Transplantation von RGDS, Chitosanfilmen und Chitosanfilmen, die mit dem Peptid RGDS gepfropft oder in PBS geschwollen wurden.

Das Sternchen stellt die Signale dar, die RGDS zugewiesen sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Lösungen im Voraus vorzubereiten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Festkörper-Tierspektroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, wie z.B. die direkte Validierung der Graphing-Experimente. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Kapillarelektrophorese mit freier Lösung bei der Überwachung chemischer Reaktionen einsetzen können.