Quantitativer Dot-Blot zur Schätzung von Zielproteinen in einem Gewebelysat

Der quantitative Dot-Blot – oder QDB – ist eine nützliche Technik, um die Konzentration von Zielproteinen in einer Probe zu quantifizieren. Sobald die Probe auf einer Polymermembran immobilisiert ist, können die Proteine durch Immunblotting nachgewiesen werden.

Nehmen Sie zunächst eine QDB-Platte – eine Multi-Well-Platte mit einer Nitrozellulosemembran, die am Boden jeder Vertiefung befestigt ist. Fügen Sie die Probe – ein Gewebelysat, das das Zielprotein enthält – in der Mitte der Membran in der Vertiefung hinzu.

Lassen Sie die Probe trocknen. Das Zielprotein bindet über nicht-kovalente Wechselwirkungen an die Membran.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu. Die Proteine in der Lösung binden sich an die ungebundenen Stellen auf der Membran und verhindern so die unspezifische Bindung von Nachweisreagenzien.

Fügen Sie als Nächstes eine Lösung hinzu, die Primärantikörper enthält, die an das Zielprotein in der Probe binden. Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie dann eine sekundäre Antikörperlösung hinzu. Diese Moleküle – markiert mit einem Peroxidase-Enzym – binden an die proteingebundenen Primärantikörper. Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie schließlich eine Lösung hinzu, die ein chemilumineszierendes Substrat und Wasserstoffperoxid enthält. Unter Verwendung von Wasserstoffperoxid oxidiert die Antikörper-gebundene Peroxidase das Substrat und gibt Licht ab. Messen Sie mit einem Plattenlesegerät die Lumineszenzintensität der Probe.

Erzeugen Sie eine Standard-Lumineszenzkurve unter Verwendung einer seriellen Verdünnung mit bekannten Konzentrationen des Zielproteins. Tragen Sie den gemessenen Lumineszenzwert der Probe auf der Kurve auf, um die Zielproteinkonzentration zu bestimmen.