Name: In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Visualisierung synaptischer Vesikel in Drosophila-Larvenaxonen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonalen Transports bei neurologischen Erkrankungen.

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SG wird durch Mittel aus der State University of New York at Buffalo und von John R. Oishei Foundation unterstützt. MK wurde von einem Student Research Award CURCA bei UB unterstützt.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie die Dissektion Puffer Vorbereitung, indem Sie die folgenden Verbindungen: 128 mM NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2 mM KCl, 5 mM HEPES und 36 mM Saccharose in 1000 ml, pH auf 7,2 und Filter zu sterilisieren. </li></ol> 2. Vorbereitung für die Präparation <ol><li> Siligard cube: Das Gel wird auf etwa einen Zentimeter breit, 1 cm lang und ca. 1cm hoch geschnitten. Das Gel Würfel ist auf einem Glasträger beim Präparieren platziert. Cubes können mehr als einmal verwendet werden. </li><li> Pins: Pins für die Präparation verwendet werden müssen extra kurz. Die scharfen unteren Teil des minutien Pins funktioniert am besten in Dissektion. </li><li> Brauchen Sie eine scharfe Schere Mikrodissektion Frühjahr. </li><li> Brauchen Sie zwei feinen Spitzen einer Pinzette. </li></ol> 3. Sammlung von Larven <ol><li> Wandering 3 rd Larvenstadium, die, die ein GFP markiert Vesikelprotein sind auf einer Petrischale gesammelt. </li><li> Die Larven werden in deionisiertem Wasser gewaschen, um loszuwerden, alle Lebensmittel. </li></ol> 4. Live-Präparation von Larven <ol><li> Eine Larve ist es, die Dissektion Gel Würfel auf einem Glasträger übertragen. Larva ist in Dissektion Puffer eingetaucht. </li><li> Larva ist an der vorderen und hinteren mit zwei feinen Nadeln mit dem Rücken nach oben schmachtete. </li><li> Mit Mikrodissektion Schere, wird ein kleiner Schnitt an der Mittellinie in der Nähe des hinteren Endes gemacht. Von diesem Schnitt ein Schnitt durch den vorderen gemacht. Mit zwei Stiften, Bolzen der Schnitt Nagelhaut an den seitlichen Rändern. </li><li> Geben Sie einen Tropfen zu sezieren Puffer. Entfernen Sie vorsichtig den Darm, Darm und Fettkörper mit einer Pinzette. Die meisten dieser Gewebe normalerweise sickern in den Rücken schneiden. </li><li> Ersetzen Sie den Puffer mit frischen Sezieren Puffer. Die Larve sollte nie trocken sein und sollte ständig in Sezieren Puffer sein. </li><li> Inkubationen mit in vivo Markern MitoTracker oder LysoTracker sind in dieser Zeit getan, durch Verdünnen der in vivo-Marker in Dissektion Puffer. Nach der Inkubation der in vivo-Marker waschen seziert Larve mehrere Male (5 schnelle wäscht) mit frischen Sezieren Puffer. </li><li> Nach dem Austausch der letzten Waschung drücken Sie die Stifte in die syligard und sofort Deckglas. Die Larven ist nun bereit für die Beobachtung. </li></ol> 5. Live-Darstellung von seziert Larven <ol><li> Legen Sie das Deckglas und Gel auf dem Mikroskoptisch und Bild mit einem inversen Mikroskop. </li><li> Wir verwenden eine 100x-Objektiv zum Bild getaggt Vesikel innerhalb Larven segmentalen Nerven. GFP-Expression in den Zellkörper der Bauchganglion wird zuerst ausgewertet, bevor segmentalen Nerven abgebildet werden. Wenn robust GFP Färbung in die Zellkörper in der ventralen Ganglion beobachtet wird, sind die Nerven dann abgebildet und zur Auswertung herangezogen. </li><li> Mit einem Dual-View-Systems mit Filtern für CFP / YFP oder RFP / YFP und geteilte Ansicht Software, die wir gleichzeitig Bild können zwei markierte Protein in vivo. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1:. Ein repräsentatives Bild zeigt viele axonalen Bläschen auf viele axonalen Tracks innerhalb eines larvalen segmentalen Nerven Beachten Sie die Tropfen von GFP, was axonalen Ansammlungen. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Ein repräsentatives Bild zeigt ein einzelnes Axon Strecke mit vielen axonaler Vesikel innerhalb eines larvalen segmentalen Nerven.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

In-vivo-Bildgebung der synaptischen Vesikel Transport innerhalb Drosophila Larve segmentalen Nerven ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erforschung der Mechanismen in axonalen Transport. Wir haben bereits dieses Protokoll verwendet, um den Transport Dynamik innerhalb larvalen Nerven Ausdruck erweitert polyQ wiederholt, um aufzuklären, wie Ausbau der wiederholt die Dynamik der Vesikeltransport beeinflussen 3 zu bewerten. Über dieses Protokoll die Geschwindigkeit der Vesikel Bewegung kan...

<table><tbody><tr><td>1 Paar Mikro-Präzisionsscheren</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Federscheren &amp;#8211; 6 mm Klinge. 0,125 mm Spitzen­durchmesser</td></tr><tr><td>2 Paar Pinzetten</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fisherbrand Präparations-Mikro-Adson-Pinzette mit rauer Spitze</td></tr><tr><td>Box mit Präparationsnadeln</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Minutien-Pinzetten, 0,1 mm Durchmesser</td></tr></tbody></table>

in-vivo-visualisierung von synaptischen vesikeln innerhalb drosophila larven segmentale axone

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Die Aufklärung der Mechanismen der axonalen Transport hat gezeigt, dass sehr wichtig bei der Bestimmung, wie Mängel in Ferntransport verschiedenen neurologischen Erkrankungen beeinflussen. Mängel in diesem wichtigen Prozess kann nachteilige Auswirkungen auf die neuronale Funktion und Entwicklung. Wir haben eine Dissektion Protokoll, das entworfen, um das Expose wird entwickelt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven segmentalen Nerven axonalen Transport in Echtzeit anzeigen. Wir haben dieses Protokoll für Live-Aufnahmen von der von Hurd und Saxton (1996) für immunolocalizatin der Larven segmentalen Nerven verwendet veröffentlicht angepasst. Eine sorgfältige Präparation und richtige Puffer-Bedingungen sind entscheidend für die Maximierung der Lebensdauer des seziert Larven. Wenn es richtig getan haben, seziert Larven robust Vesikeltransport für 2-3 Stunden unter physiologischen Bedingungen gezeigt. Wir nutzen die UAS-GAL4-Methode<sup&gt; 1</sup&gt; Zum Ausdruck zu bringen GFP-markierten APP oder Synaptotagmin Vesikel innerhalb eines einzigen Axon oder viele Axone in Larven segmentalen Nerven durch verschiedene neuronale GAL4-Treiber. Andere fluoreszenzmarkierten Marker, zum Beispiel Mitochondrien (MitoTracker) oder Lysosomen (LysoTracker), kann auch für die Larven vor der Anzeige angewendet werden. GFP-Vesikel Bewegung und der Bewegung von Teilchen können gleichzeitig angezeigt werden mit unterschiedlichen Wellenlängen.

Dieses Protokoll beschreibt die Live-Präparation<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven zum Zwecke der Abbildung der Bewegung der GFP markierten axonalen Bläschen auf Mikrotubuli.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Die Aufklärung der Mechanismen des axonalen Transports hat sich als äußerst wichtig für die Bestimmung erwiesen, wie Defekte im Ferntransport verschiedene ...

Um zu untersuchen, ob Defekte im langstreckigen axonalen Transport bei neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit oder Huntington-Krankheit vorliegen. Der axonale Transport von Transportvesikeln wird in lebenden Speiseröhrenlarven abgebildet. Hier rätselnd.Larven des dritten Sterne-Stadiums, die ein GFP-markiertes physikalisches Protein exprimieren, werden auf einem Gelwürfel präpariert und anschließend für die In-vivo-Bildgebung auf das Mikroskop übertragen. Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie wird danach der Transport innerhalb des Axons verfolgt. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden liegt in der Visualisierung der lebenden, ungestörten Bewegung von synaptischen Vesikeln und larvalen Axonen.Bereiten Sie die Dissektion vor, indem Sie sicherstellen, dass die folgenden Materialien und Reagenzien bereitliegen. Dissektionspuffer. Ein Sill-Schutzwürfel, der einen Zoll breit, einen Zoll lang und einen Zentimeter hoch zugeschnitten ist und auf einem Objektträger platziert wird.Extra kurze Dissektionsnadeln. Der scharfe untere Teil von Manum-Nadeln eignet sich am besten für die Dissektion. Die richtige Länge kann erreicht werden, indem längere Nadeln in das Gel eingeführt und die überstehenden Teile abgeschnitten werden.Sie benötigen außerdem ein Paar scharfe Feder-Schneidspitzen-Scheren und zwei Sätze feinspitziger Pinzetten. Verwenden Sie einen kleinen Metallspatel, um wandern. Dritte in Sternlarven, die ein GFP-markiertes SLE-Protein exprimieren, in eine Petrischale zu überführen.Als Nächstes deionisiertes Wasser auf die Larven in der Petrischale auftragen, um die gesamte Nahrung zu entfernen. Anschließend mit einer Pinzette die Larven auf einen Schnittgelwürfel übertragen, um die Lebenddissektion durchzuführen. Mit der Pinzette eine Larve auf den Dissektionsgelwürfel überführen.Auf einem Objektträger Dissektionspuffer auf den Objektträger geben, um ihn einzutauchen. Danach die Larve an den vorderen und hinteren Enden mit der dorsalen Seite nach oben fixieren. Mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt entlang der Mittellinie nahe dem hinteren Ende anbringen.Von diesem Einschnitt ausgehend einen weiteren Schnitt nach anterior vornehmen. Die Darmeingeweide und Fettkörper treten unter Verwendung zweier Nadeln heraus. Den eingeschnittenen Cuticula-Rand an den lateralen Kanten am Silikonhalterwürfel fixieren.Verwenden Sie eine Pipette, um einen Tropfen Puffer für die Dissektion hinzuzufügen. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig die Darmeingeweide und Fettkörper. Legen Sie ein Kim-Tuch auf eine Seite der Larve, um den Puffer zu entfernen, während Sie gleichzeitig mit einer Pipette frischen Dissektionspuffer hinzufügen. Die Lava darf niemals trocken sein. Um mitochondriale oder lysosomale Strukturen in der Lava zu markieren, ersetzen Sie den Dissektionspuffer durch Dissektionspuffer, der Mito Tracker oder Lyo Tracker enthält. Stellen Sie den Dissektionswürfel in eine quadratische befeuchtete Kammer und bedecken Sie ihn mit Aluminiumfolie.10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation mit dem In-vivo-Marker das umgebende Dissektionspuffermedium um die Larven herum wiederholt mit einer Pipette aufsaugen und frisches Dissektionspuffermedium hinzufügen. Diesen Schritt fünfmal wiederholen, um jeglichen verbliebenen Marker zu entfernen.Nach dem Ersetzen der letzten Waschung schieben Sie die Stifte vollständig in die S-Halterung und legen Sie sofort ein Deckglas auf, um eine Bewegung der Larve zu vermeiden. Die Larve ist nun bereit zur Beobachtung, um eine Live-Bildgebung der dissezierten Larve durchzuführen. Platzieren Sie die Probe auf dem Objektträger eines invertierten Mikroskops, um markierte Vesikel abzubilden.In den larvalen segmentalen Nerven. Führen Sie die Bildgebung mit einem 100-fachen Objektiv durch. Wenn die GFP-Färbung stark ist, können die Zellkörper im Bild des ventralen Ganglions sowie die segmentalen Nerven mithilfe eines Dual-View-Systems mit Filtern für C-F-P-Y-F-P oder R-F-P-Y-F-P und Split-View-Software untersucht werden, wodurch zwei in vivo markierte Proteine gleichzeitig sichtbar gemacht werden können.In dieser Zeitrafferserie sind viele axonale Vesikel auf zahlreichen axonalen Bahnen innerhalb eines larvalen segmentalen Nervs zu sehen. Beachten Sie, dass GFP die axonalen Ansammlungen darstellt, und beobachten Sie ebenfalls die bidirektionale Bewegung der Vesikel. Hier ist die Bewegung axonaler Vesikel auf einer einzelnen Bahn innerhalb eines larvalen segmentalen Nervs zu erkennen.Beachten Sie, dass die bidirektionale Bewegung dieser SLEs im Durchschnitt einen Mikrometer pro Sekunde beträgt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine saubere Dissektion zur in-vivo-Beobachtung von GFP-markierten Vesikeln und GSOs larvaler Axone durchführt.

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Drosophila melanogaster-Larven bieten ein ideales Modellsystem, um die Mechanismen der axonalen Transport innerhalb Larven segmentalen Nerven zu untersuchen. Mit diesem Verfahren können 3 rd Larvenstadium, die verschiedene Mutationen zu Wildtyp-Larven verglichen werden.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung...

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Betäubung und Bildgebung von...

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Untersuchung des synaptischen Vesikelrecyclings an neuromuskulären Verbindungen in Channelrhodopsin-exprimierenden Drosophila-Larven unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs. Blaues Licht aktiviert die Kanalrhodopsine, was zu Kalziumeinstrom und synaptischer Vesikelexozytose führt. Der Farbstoff integriert sich in die neuronalen Membranen und wird während der Endozytose internalisiert, was zu einer verstärkten Fluoreszenz führt. Eine weitere...

Analyse des synaptischen Vesikelrecyclings und der Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen in Drosophila-Larven

Quelle: Jeong, S. Visualisierung des axonalen Projektionsmusters embryonaler Motoneuronen in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Visualisierung von axonalen Projektionen in Drosophila Embryonen. Die Immunmarkierung von Motoneuronen, die präzise Dissektion zur Freilegung neuronaler Strukturen und die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie zeigen zusammen eine detaillierte neuronale Architektur, wobei die axonalen Projektionsmuster hervorgehoben werden.

Visualisierung axonaler Projektionsmuster embryonaler Motoneuronen in Drosophila

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Lernen Sie die In-vivo-Visualisierung synaptischer Vesikel in Drosophila-Larvenaxonen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonalen Transports bei neurologischen Erkrankungen.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

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