In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone
15. Oktober 2010
Dieses Protokoll beschreibt die Live-Präparation Drosophila Larven zum Zwecke der Abbildung der Bewegung der GFP markierten axonalen Bläschen auf Mikrotubuli.
Um zu untersuchen, ob Defekte im langstreckigen axonalen Transport bei neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit oder Huntington-Krankheit vorliegen. Der axonale Transport von Transportvesikeln wird in lebenden Speiseröhrenlarven abgebildet. Hier rätselnd.
Larven des dritten Sterne-Stadiums, die ein GFP-markiertes physikalisches Protein exprimieren, werden auf einem Gelwürfel präpariert und anschließend für die In-vivo-Bildgebung auf das Mikroskop übertragen. Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie wird danach der Transport innerhalb des Axons verfolgt. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden liegt in der Visualisierung der lebenden, ungestörten Bewegung von synaptischen Vesikeln und larvalen Axonen.
Bereiten Sie die Dissektion vor, indem Sie sicherstellen, dass die folgenden Materialien und Reagenzien bereitliegen. Dissektionspuffer. Ein Sill-Schutzwürfel, der einen Zoll breit, einen Zoll lang und einen Zentimeter hoch zugeschnitten ist und auf einem Objektträger platziert wird.
Extra kurze Dissektionsnadeln. Der scharfe untere Teil von Manum-Nadeln eignet sich am besten für die Dissektion. Die richtige Länge kann erreicht werden, indem längere Nadeln in das Gel eingeführt und die überstehenden Teile abgeschnitten werden.
Sie benötigen außerdem ein Paar scharfe Feder-Schneidspitzen-Scheren und zwei Sätze feinspitziger Pinzetten. Verwenden Sie einen kleinen Metallspatel, um wandern. Dritte in Sternlarven, die ein GFP-markiertes SLE-Protein exprimieren, in eine Petrischale zu überführen.
Als Nächstes deionisiertes Wasser auf die Larven in der Petrischale auftragen, um die gesamte Nahrung zu entfernen. Anschließend mit einer Pinzette die Larven auf einen Schnittgelwürfel übertragen, um die Lebenddissektion durchzuführen. Mit der Pinzette eine Larve auf den Dissektionsgelwürfel überführen.
Auf einem Objektträger Dissektionspuffer auf den Objektträger geben, um ihn einzutauchen. Danach die Larve an den vorderen und hinteren Enden mit der dorsalen Seite nach oben fixieren. Mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt entlang der Mittellinie nahe dem hinteren Ende anbringen.
Von diesem Einschnitt ausgehend einen weiteren Schnitt nach anterior vornehmen. Die Darmeingeweide und Fettkörper treten unter Verwendung zweier Nadeln heraus. Den eingeschnittenen Cuticula-Rand an den lateralen Kanten am Silikonhalterwürfel fixieren.
Verwenden Sie eine Pipette, um einen Tropfen Puffer für die Dissektion hinzuzufügen. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig die Darmeingeweide und Fettkörper. Legen Sie ein Kim-Tuch auf eine Seite der Larve, um den Puffer zu entfernen, während Sie gleichzeitig mit einer Pipette frischen Dissektionspuffer hinzufügen.
Die Lava darf niemals trocken sein. Um mitochondriale oder lysosomale Strukturen in der Lava zu markieren, ersetzen Sie den Dissektionspuffer durch Dissektionspuffer, der Mito Tracker oder Lyo Tracker enthält. Stellen Sie den Dissektionswürfel in eine quadratische befeuchtete Kammer und bedecken Sie ihn mit Aluminiumfolie.
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation mit dem In-vivo-Marker das umgebende Dissektionspuffermedium um die Larven herum wiederholt mit einer Pipette aufsaugen und frisches Dissektionspuffermedium hinzufügen. Diesen Schritt fünfmal wiederholen, um jeglichen verbliebenen Marker zu entfernen.
Nach dem Ersetzen der letzten Waschung schieben Sie die Stifte vollständig in die S-Halterung und legen Sie sofort ein Deckglas auf, um eine Bewegung der Larve zu vermeiden. Die Larve ist nun bereit zur Beobachtung, um eine Live-Bildgebung der dissezierten Larve durchzuführen. Platzieren Sie die Probe auf dem Objektträger eines invertierten Mikroskops, um markierte Vesikel abzubilden.
In den larvalen segmentalen Nerven. Führen Sie die Bildgebung mit einem 100-fachen Objektiv durch. Wenn die GFP-Färbung stark ist, können die Zellkörper im Bild des ventralen Ganglions sowie die segmentalen Nerven mithilfe eines Dual-View-Systems mit Filtern für C-F-P-Y-F-P oder R-F-P-Y-F-P und Split-View-Software untersucht werden, wodurch zwei in vivo markierte Proteine gleichzeitig sichtbar gemacht werden können.
In dieser Zeitrafferserie sind viele axonale Vesikel auf zahlreichen axonalen Bahnen innerhalb eines larvalen segmentalen Nervs zu sehen. Beachten Sie, dass GFP die axonalen Ansammlungen darstellt, und beobachten Sie ebenfalls die bidirektionale Bewegung der Vesikel. Hier ist die Bewegung axonaler Vesikel auf einer einzelnen Bahn innerhalb eines larvalen segmentalen Nervs zu erkennen.
Beachten Sie, dass die bidirektionale Bewegung dieser SLEs im Durchschnitt einen Mikrometer pro Sekunde beträgt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine saubere Dissektion zur in-vivo-Beobachtung von GFP-markierten Vesikeln und GSOs larvaler Axone durchführt.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Live-Dissektion von Drosophila-Larven zur Abbildung der Bewegung von mit GFP markierten axonalen Vesikeln entlang Mikrotubuli-Trakten. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der ungehinderten Bewegung synaptischer Vesikel in larvalen Axonen in Echtzeit.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Abbildungstechniken
Hintergrund
- Der axonale Transport ist entscheidend für die neuronale Funktion.
- Defekte im axonalen Transport sind mit neurologischen Erkrankungen assoziiert.
- Drosophila-Larven dienen als Modellorganismus zur Untersuchung dieser Prozesse.
- Mittels Fluoreszenzmikroskopie lässt sich die Vesikelbewegung in Echtzeit beobachten.
Zweck der Studie
- Untersuchung von Defekten im langstreckigen axonalen Transport.
- Verständnis der Auswirkungen dieser Defekte bei neurologischen Erkrankungen.
- Anwendung von Live-Bildgebungstechniken zur verbesserten Beobachtung.
Verwendete Methoden
- Präparation von Drosophila-Larven, die mit GFP markierte Proteine exprimieren.
- Übertragung der präparierten Larven auf einen Gelwürfel zur Stabilisierung.
- In-vivo-Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Verfolgung des Vesikeltransports innerhalb von Axonen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung des axonalen Transports in lebenden Larven.
- Nachweis der Bewegung von GFP-markierten Vesikeln.
- Erkenntnisse über die Dynamik des synaptischen Vesikeltransports.
- Der Vergleich mit etablierten Methoden unterstreicht die Vorteile dieses Ansatzes.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des axonalen Transports dar.
- Mittels Live-Bildgebung lassen sich entscheidende Erkenntnisse über die neuronale Funktion gewinnen.
- Diese Methode kann zur Untersuchung verschiedener neurologischer Erkrankungen angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der Dynamik des axonalen Transports ist entscheidend, um neurodegenerative Erkrankungen als Zielstrukturen sicherer zu bewerten, da Störungen im Vesikeltransport mechanistisch mit Alzheimer, Huntington und ALS verknüpft sind. Dieses Modell der Drosophila-Larvenaxon ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Bewegung von synaptischen Vesikeln und stellt somit ein vorhersagekräftiges, krankheitsrelevantes System für die frühe Validierung von Zielstrukturen und mechanistische Einblicke bereit. Durch die Quantifizierung des bidirektionalen Vesikelstroms und der Transportgeschwindigkeiten unterstützt die Methode Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in präklinischen Programmen, die auf die Integrität der Axone abzielen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Transportvorgänge von GFP-markierten APP- oder Synaptotagmin-Vesikeln in lebenden Axonen sichtbar gemacht werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch direkte Beobachtung der Vesikeldynamik in einem genetisch zugänglichen System.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem Transportdefekte mit neuronaler Dysfunktion in Krankheitsmodellen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte axonale Systeme für die Wirkstoff-Screening vor, indem die Baseline der Vesikelbeweglichkeit unter physiologischen Bedingungen etabliert wird.
- Operationaler Wert: Liefert quantitative, reproduzierbare Messgrößen zur Vesikelbewegung (z. B. bidirektionale Flussrate von 1 µm/s) zur Standardisierung von Assays.
- Strategischer Wert: Ermöglicht skalierbare, plattformkompatible Bildgebungsworkflows zur Bewertung der Wirkstoffeffekte auf den axonalen Transport.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung krankheitsrelevanter Systeme, indem Transportdefekte modelliert werden, wie sie bei menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet werden.
- Operativer Wert: Bietet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch Live-Bildgebung des Vesikeltransports in intakten larvalen Nerven.
- Risikominderung: Unterstützt Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem der durch Kandidaten-Modulatoren bewirkte Transportwiederherstellung oder -verschlechterung quantifiziert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein und unterstützt die Hypothesenprüfung in der frühen Entdeckungsphase, die Assay-Bereitschaft beim Screening sowie die mechanistische Validierung in den präklinischen Stadien.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominderung, indem der Vesikeltransport als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Störungen sichtbar gemacht wird.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft von Assays durch standardisierte Protokolle zur Dissektion, Färbung und Bildgebung, die zu konsistenten Messgrößen der Vesikelbeweglichkeit führen.
- Analytik: Erzeugt quantitative abhängige Messgrößen (Geschwindigkeit, Richtungstreue, Fluss), die den Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem axonale Transportdefekte modelliert werden, die mit menschlichen neurologischen Erkrankungen assoziiert sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform für Längsschnittstudien zur axonalen Integrität über mehrere Zielklassen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch direkte Visualisierung der Dynamik synaptischer Vesikel.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Pufferbedingungen für die Dissektion und Bildgebungsparameter.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unklarheiten bei Hypothesen zum axonalen Transport.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der Wirksamkeit der Wiederherstellung des Transports in krankheitsrelevanten Modellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, in Mikrodissektion und in der Fluoreszenzmikroskopie.
- Benötigt ein umgekehrtes Mikroskop mit 100x-Objektiv, Dual-View-System und geeigneten Filterkombinationen für GFP und andere Fluoreszenzfarbstoffe.
- Erfordert die Standardisierung von Dissektionspuffer, larvaler Stadieneinteilung und Umweltbedingungen (befeuchtete Kammer, Temperatur).
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die Expression verschiedener GFP-markierter Frachtstoffe (z. B. Mitochondrien, Lysosomen) mithilfe neuronaler GAL4-Treiber.
- Praktische Einschränkungen sind die Vorbereitungszeit der Larven und das Zeitfenster von 2–3 Stunden für einen robusten Vesikeltransport nach der Dissektion.
