Name: Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion von Embryonen bei Anopheles stephensi zur Erzeugung transgener Malaria-resistenter Mücken. Diese Methode ermöglicht genetische Modifikationen für Vektorbiologie und Malariabekämpfung.

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Vorbereitung im Vorfeld der Mikroinjektion: <ol><li> Blut ernähren Mücken: für die Injektion von Montag bis Mittwoch Feed Weibchen auf der vorigen Freitag. Um Donnerstag und Freitag, Futtermittel Frauen am Montag injizieren der gleichen Woche. </li><li> Bereiten Sie den Quartz Nadeln mit dem Programm 2 und isotonischen Puffer (siehe Materialien). </li><li> &quot;Legen tube&quot; für die Embryonen ist die regelmäßige Drosophila Kultur Durchstechflasche. Wet Watte in den Boden, mit einem nassen Scheibe Filterpapier für sie. </li><li> Bereiten Kunststoff Deckglas durch Kleben beidseitig Klebeband an einem Ende. Trim Band Deckglas, so dass es am Rande des Deckglases endet. </li><li> Bereiten Öl für Austrocknung. </li><li> Bereiten Sie eine Petrischale mit isotonischen Puffer, um Embryonen zu Schlüpfen zu übertragen. </li></ol> Set up der erzwungenen Verlegung: <ol><li> Sammeln 6-10 Blut zugeführt Weibchen mit dem Einsatz von einem Aspirator und übergeben sie an die Drosophila Kultur Fläschchen mit Baumwolle und Filterpapier nass mit isotonischen Puffer. </li><li> Die Mücken werden dann wieder in insectery Bedingungen in der Dunkelheit setzen und dürfen Eier für 1 h und 15 min lag. </li><li> Lassen Erwachsenen in den Käfig zu fliegen, und entfernen Sie das Filterpapier Festplatte mit Embryonen. </li><li> Um line up Eier, tun Sie es unter dem Binokular. Sammeln Trauben von Eiern mit einem feinen Pinsel (Sable, No 0000) und Transfer zum einen vorbereiteten Platz 3MM Whatman-Papier mit isotonischen Puffer getränkt. Schützen Sie das Papier alle Zeit nass. Lassen Sie sich nicht ausgetrocknet Eier zu bekommen. Entfernen Sie die exochorion mit dem Pinsel, hilft es, besser kleben Eier auf das Band. </li><li> Mit feinen ForceP Nr. 5 oder einem feinen Pinsel, abholen dunkleres Grau Embryonen und ordnen Linie auf Platz 3MM Whatman nass mit isotonischen Puffer. Line up von 20 bis 30 Embryonen. Alle Embryonen müssen in der gleichen Ausrichtung wie Injektion auf hinteren Pol sein. Das vordere Ende des Embryos ist etwas breiter als der hintere. Dann, mit Streifen 3MM Whatman-Papier, trockenes Filter in denen die Eier durch starken Druck auf beiden Seiten des Eies Linie nicht berühren, werden die Eier gefüttert. </li><li> Zur Übertragung der Eier, drehen Sie die Folie mit dem doppelseitigen Klebeband (Medizin), und sanft gegen die Eier zu drücken. Das hintere Ende der Eier müssen sehr nah an den Rand des doppelseitigem Klebeband. Die Nässe des Papiers ist entscheidend dafür, ob es zu nass werden sie nicht halten wird. Ich weiß Austrocknung des Embryos von 5-10 Sekunden, aber Austrocknung hängt von feuchten und Temperatur in Mikroinjektion Raum. </li><li> Austrocknung ist entscheidend für Eier: etwas zu viel und Embryonen nicht schlüpfen. Ohne Austrocknung DNA wird nicht in Embryos. </li><li> Abdeckung ausgetrocknet Embryonen mit Halocarbonöl weitere Austrocknung zu verhindern. </li></ol> Mikroinjektion der Embryonen: Der wichtigste Aspekt guter Injektion wird die Qualität der Nadel (siehe Anmerkung). <ol><li> Füllen Sie eine Nadel mit der DNA-Lösung, um mit Hilfe eines Microloader (Eppendorf # 5242 956,003) injiziert werden. Sehr wenig Injektion soliution benötigt wird, von 1 bis 2 ml. </li><li> Schließen Sie die Nadel auf die Eppendorf Transjector, die Einspritzzeit und Druck steuert, sowie der Gegendruck. Mikroinjektion wird mit einem Mikroskop mit einer beweglichen Bühne (Leica) bei 10facher Vergrößerung und Mikromanipulator (Leica). Falls erforderlich, kann eine erhöhte Mikroskoptisch durch Stapeln 05.04 Objektträger vorbereitet werden. Legen Sie das Deckglas tragen die Embryonen auf die erhöhte Bühne. Die Embryonen werden in einem 150 ° Winkel injiziert; Penetration sollte am hinteren Pol sein. Für die Injektion, halte ich die Nadel stationär und bewegen die Bühne des Mikroskops. Wenn die Nadel neu ist, ist die Spitze verschlossen und in der Regel bricht in der ersten Injektion. Ich arbeite immer aus den Druck benötigt wird, um ein kleines Tröpfchen von DNA in Öl zu vertreiben, zwischen jeder Injektion. </li><li> Ich habe die Einspritzzeit um 0,2 bis 0,9 sec und 1000 hPa, wenn die Nadel ist neu. Ich variieren den Druck und die Zeit, bis ein kleiner Tropfen ist zu sehen, die sich aus der Nadel in das Öl. Der Gegendruck muss rund 100 eingestellt werden. Wie der Nadelspitze wird getragen hat den Einspritzdruck reduziert werden, um das Injektionsvolumen niedrig (ca. 300 hPa) zu halten. Danach wird die Nadelspitze zu groß und tötet die meisten der Embryonen. </li><li> Nach der Injektion zu entfernen das Öl mit Seidenpapier und decken die Rutsche mit Embryonen und in der Petrischale mit isotonischen Puffer. Die Schalen werden in der Insektarium und sie dort lassen, bis die Embryonen schlüpfen. Sie fangen an, nach 2-6 Tagen ausbrüten. Übertragen Sie die Larven in destilliertes Wasser mit der Prise gemahlener Fischfutter. </li></ol> Hinweise DNA für die Injektion: Plasmid-DNA-Lösung zur Injektion wurde unter Verwendung Endofree Plasmid-Kit.Construct Plasmid und Helferplasmids vermischen sich in richtigen Konzentration, mit Isopropanol gefällt. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol, bevor Resuspendieren in Injektionspuffer gewaschen. Vor der Injektion, saubere DNA mit Millex-GV-Spalte. Izotonic Puffer: <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 1,68 m NaCl - 88,3 ml 1,68 m NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 m CaCl 2 bis 2,2 ml dH 2 O - 896 ml </td><td> OR </td><td> 5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCl - 4.87 ml 1 M Hepes - 10,7 ml 1,12 m CaCl 2 bis 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml </td></tr></tbody></table> Passen Sie auf pH 7,2

<table><tbody><tr><td>Injektions-Quarznadeln</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>OD–1,0 mm, ID–0,70, 10 cm Länge, werden hergestellt, indem Kapillarrohre mit einem Mikropipettenzieher zu einer feinen Spitze von 3–8 µm und einem Schaft von etwa 100–300 mm gezogen werden.</td></tr><tr><td>Quarzzieher</td><td>Werkzeug</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>Grundeinstellung: Hitze–275, Fil–3, Geschw–38, Verz–250, Zug–141</td></tr><tr><td>EndoFree-Plasmidkit</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV-Säule</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>für die DNA-Reinigung</td></tr><tr><td>Konstrukt-DNA</td><td></td><td></td><td></td><td>0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Helferplasmid</td><td></td><td></td><td></td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>Injektionslösung</td><td>Puffer</td><td></td><td></td><td>1x-Lösung: 5 mM KCl, 0,1 mM Natriumphosphat, pH 6,8</td></tr><tr><td>Isotonischer Puffer</td><td></td><td></td><td></td><td>siehe Rezept im Protokollabschnitt</td></tr><tr><td>Trocknungsmittelöl</td><td></td><td></td><td></td><td>Halocarbon-Öl 700 : Halocarbon-Öl 27 (1:1). Gleichmäßig vermischen. Vor der Mikroinjektion vorbereiten.</td></tr><tr><td>Blut</td><td></td><td></td><td></td><td>zur Fütterung von Mücken</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>Tier</td><td></td><td></td><td>Mücken, männlich und weiblich.</td></tr><tr><td>Drosophila-Kulturröhrchen</td><td></td><td></td><td></td><td>für die Eiablage</td></tr><tr><td>Petri-Schalen</td><td></td><td></td><td></td><td>mit isotonischem Puffer, zur Embryonalentwicklung</td></tr><tr><td>Feine Pinsel</td><td></td><td></td><td></td><td>Schablonenpinsel Nr. 0000</td></tr><tr><td>3MM Whatman-Papier</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Nr. 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Transjektor</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>mit verstellbarem Objekttisch und Mikromanipulator, eingestellt auf 10fache Vergrößerung</td></tr></tbody></table>

injektion eines. stephensi embryonen zu generieren malaria-resistenter moskitos

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Die Einführung von exogenen Genen in den Genomen von Moskitos erfordert Mikroinjektion Techniken abgestimmt auf die spezifischen Arten von Interesse. Dieses Video-Protokoll beschreibt eine Methode durch die James-Labor verwendet werden, um DNA-Konstrukte in Anopheles stephensi Embryonen für die Erzeugung von transformierten Mücken microinject. Techniken für die Herstellung Mikroinjektion Nadeln, Sammlung und Aufbereitung von Embryonen und die Durchführung der Mikroinjektion dargestellt.

Anopheles stephensi Mücken sind Vektoren für Malaria bewohnen Indien und ganz Asien. Dieses Video zeigt die Technik für die Durchführung microinjections dieser Art mit Transgene, dass Widerstand gegen die Malaria, die Mücke wird zu verleihen. Ein großer Teil der Methodik in diesem Video gezeigt, ist für die Mikroinjektion Techniken anderer Mückenarten.

Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

Die Einführung exogener Gene in die Genome von Mücken erfordert Mikroinjektionstechniken, die auf die jeweilige Zielspezies zugeschnitten sind. Dies ...

Alle 15 Sekunden stirbt weltweit ein Kind an Malaria. Hier im James-Labor versuchen wir, französische Mücken zu erzeugen, die den Malariaerreger nicht übertragen können. Mein Name ist TIUs. Ich bin hier an der University of California Irvine am Department für Molekularbiologie und Biochemie im Labor von Anthony James.Heute zeige ich Ihnen, wie man transgene und nicht Stevens-Augen herstellt. Wir führen dies durch, um Mücken gegen Malaria resistent zu machen, sodass sie den Malaria-Parasiten nicht übertragen können. Ich habe ein Gefäß mit isotonischem Puffer vorbereitet, in dem die Mücken ihre Eier ablegen werden.Ich werde diesen Aspirator verwenden, um die Mücken aufzusaugen und sie in ein Gefäß zu überführen. Dieses Gefäß kommt anschließend in einen Inkubator mit 30 Grad Celsius, wo es etwa eine Stunde lang in einem Becher verbleibt. Nun werden wir die Mikroinjektionsnadeln ziehen.Es handelt sich um Nadeln aus Quarz, und wir müssen eine sehr feine Spitze verwenden. Daher benötigen wir diesen Nadelpuller. Wir verwenden einen Nadelpuller von Suter Instruments sowie die Nadeln von Subtle in SU Instruments.Jetzt nehme ich die Mücken heraus und lege diese Eier in die Petrischale, in de

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll zeigt eine Methode, mit der James-Labor verwendet werden, um dsRNA in weibliche A. aegypti Moskitos, die Dengue-Virus Hafen zu injizieren. Die Technik für die Kalibrierung von Injektionsnadeln, die Manipulation der Injektion Setup, und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

Die Injektion von dsRNA in Female A. aegypti Mosquitos

In diesem Video zeigt Nijole Jasinskiene der angewandten Methode, um transgene Aedes aegypti Mücken, die Überträger für Dengue-Fieber sind zu generieren. Die Techniken für die richtige Vorbereitung Mikroinjektion Nadeln, Entfeuchtungsmittel Embryonen, und die Durchführung der Mikroinjektion werden aufgezeigt.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In diesem Interview, konzentriert sich George Dimopoulos auf die physiologischen Mechanismen von Mücken verwendet werden, um Plasmodium falciparum und Dengue-Virus-Infektionen zu bekämpfen. Erklärung dafür, wie Schlüssel feuerfesten Gene gegeben ist, sind die Gene, die Resistenz gegen Pathogene Vektor, in der Mücke identifiziert und wie dieses Wissen genutzt, um transgene Moskitos, die nicht in der Lage, die Malaria-Parasiten oder Dengue-Virus in sich tragen sind zu generieren.

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos

Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen...

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

In diesem Video demonstrieren wir die phiC31-vermittelte ortsspezifische Transgenintegration im Anopheles-Embryo mittels Mikroinjektion. Diese Methode hilft dabei, gewünschte Gene in ein Wirtssystem für Forschung und industrielle Anwendungen einzubringen.

phiC31-Integrase-vermittelte ortsgerichtete Transgenintegration: Eine Mikroinjektionstechnik zur ortsspezifischen Transgenintegration in einen Anopheles-Vektor

In diesem Video demonstrieren wir die Verabreichung des Gene-Drive-Konstrukts in den Embryo der Anopheles gambiae Mücke durch die Mikroinjektionstechnik des Embryos. Dieses Verfahren ermöglicht die Integration des gelieferten DNA-Konstrukts durch homologe Rekombination in die Keimbahnzellen, um eine transformierte Mückenpopulation zu erzeugen.

Mikroinjektion von Mückenembryonen: Eine Technik zur Verabreichung exogener DNA in das Eigelb des Embryos von Anopheles gambiae, um Keimbahnmutationen zu erzeugen

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Mikroinjektionstechniken sind unerlässlich, um exogene Gene in die Genome von Moskitos einzuführen. Dieses Protokoll erklärt eine Methode, die vom James-Labor verwendet wird, um DNA-Konstrukte in Anopheles gambiae-Embryonen zu mikroinjizieren, um transformierte Moskitos zu erzeugen.

Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Malaria wird durch Inokulation des Sporozoitenstadiums von Plasmodium durch infizierte Stechmücken übertragen. Transgenes Plasmodium hat es uns ermöglicht, die Biologie der Malaria besser zu verstehen und hat direkt zur Entwicklung von Malaria-Impfstoffen beigetragen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Generierung transgener Plasmodium berghei-Sporozoite.

Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in der Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie.

Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

Lernen Sie die Mikroinjektion von Embryonen bei Anopheles stephensi zur Erzeugung transgener Malaria-resistenter Mücken. Diese Methode ermöglicht genetische Modifikationen für Vektorbiologie und Malariabekämpfung.

Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

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