Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

Alle 15 Sekunden stirbt weltweit ein Kind an Malaria. Hier im James-Labor versuchen wir, französische Mücken zu erzeugen, die den Malariaerreger nicht übertragen können. Mein Name ist TIUs. Ich bin hier an der University of California Irvine am Department für Molekularbiologie und Biochemie im Labor von Anthony James.

Heute zeige ich Ihnen, wie man transgene und nicht Stevens-Augen herstellt. Wir führen dies durch, um Mücken gegen Malaria resistent zu machen, sodass sie den Malaria-Parasiten nicht übertragen können. Ich habe ein Gefäß mit isotonischem Puffer vorbereitet, in dem die Mücken ihre Eier ablegen werden.

Ich werde diesen Aspirator verwenden, um die Mücken aufzusaugen und sie in ein Gefäß zu überführen. Dieses Gefäß kommt anschließend in einen Inkubator mit 30 Grad Celsius, wo es etwa eine Stunde lang in einem Becher verbleibt. Nun werden wir die Mikroinjektionsnadeln ziehen.

Es handelt sich um Nadeln aus Quarz, und wir müssen eine sehr feine Spitze verwenden. Daher benötigen wir diesen Nadelpuller. Wir verwenden einen Nadelpuller von Suter Instruments sowie die Nadeln von Subtle in SU Instruments.

Jetzt nehme ich die Mücken heraus und lege diese Eier in die Petrischale, in der sich ein Filterpapier befindet, das mit isotonischem Puffer getränkt ist, um die Embryonen während der Injektionsphase feucht zu halten. Die Menge an Wasser auf dem Filterpapier ist entscheidend. Die Eier dürfen nicht herumschwimmen, aber auch nicht austrocknen.

Jetzt werde ich das Embryo vom Eipapier auf ein anderes Watman-Papier mit einer Dicke von drei mm verbringen, das zuvor in isotonischem Puffer getränkt wurde. Dies erfolgt, um die Korion vor der Ausrichtung für die Mikroinjektion zu entfernen. Nun werde ich die Korion entfernen, die als silbrige Schicht auf den Eiern sichtbar ist.

Und das mache ich, indem ich sie mit meinem Pinsel abbürste. Oben hier haben wir ein Embryo, bei dem der Corion noch sitzt und der diesen silbrig glänzenden Teil aufweist. Wo ist der darunter?

Ich habe es geschafft, das Corian zu entfernen, und dieser obere Teil wird vermutlich auf einem Klebeband abrutschen, während der untere Teil haften bleibt. Das ist wichtig, wenn man eine asymmetrische Seite bearbeitet. Jetzt richte ich die Embryonen aus.

Die Embryonen sind am vorderen Ende größer, und dieses Ende platziere ich nach rechts. Links habe ich das hintere Ende, das schlanker ist und an dem ich die Embryonen injizieren werde. Ich versuche, sie so zusammenzustellen, dass sie sich gegenseitig in der Position halten.

Und normalerweise bearbeite ich etwa 10 nebeneinander in einer Reihe. Jetzt habe ich eine Reihe mit den Embryonen, die ich auf einen Deckelglas übertragen werde. Auf das Deckelglas.

Ich verwende Haarteppichband, damit sie haften. Danach trockne ich das Filterpapier, auf dem die Embryonen liegen, mit einem weiteren Filterpapier ab, lege die Embryonen auf die Deckglasabdeckung und lasse sie 30 Sekunden trocknen, bevor ich Öl auftrage. Nun haben wir die Embryonen ausgerichtet und unter dem Öl platziert.

Auf der Mikroskopbühne injizieren wir DNA, die mit Lebensmittelfarbstoff gemischt wurde, unter Verwendung dieser speziellen Spitze des Mikrobenmusters und führen diese in die Nadeln des Ports ein. Nun haben wir die Nadel gefüllt und sie wieder in einen Mikroinjektor eingesetzt. Jetzt sind wir bereit, die Mikroinjektionen durchzuführen.

Jetzt bewege ich die Nadel, um sie zu schärfen, und stelle scharf, damit ich sie fokussiert sehen kann. Sobald dies erledigt ist, bewege ich die Gewichtsnadel und bringe die Embryonen ein, die ich ebenfalls fokussiere. Und wenn das erledigt ist, bewege ich die Nadel erneut, bis sie in der richtigen Position ist, und fahre mit meinen Embryonen fort.

Wenn die Nadel nun durch das Öl tritt, wird sie unscharf, und Sie müssen erneut nachjustieren. Genau das ist Hai. Genau, Haieichen.

Und nun bin ich bereit, die Injektionen durchzuführen. Sie konnten sehen, dass ich das Embryo mit der Nadel berührt habe, wodurch ich die Spitze abgebrochen habe, und Sie können einen kleinen Tropfen austreten sehen, der in das Embryo injiziert wird. Also hier injizieren und dann wieder herausziehen.

Und ich überprüfe jedes Mal zwischen den einzelnen Embryonen, ob ein kleiner Tropfen an der Nadelspitze austritt. Wie Sie sehen, muss ich für jeden Embryo die Position neu justieren, um die perfekte Lage zu erreichen. Dieser hier hatte gerade eine Undichtigkeit.

Wie Sie sehen, wird die Blase beim zweiten Injektionsvorgang im Öl sehr groß, und ich muss den Druck des Mikroinjektors neu einstellen. Nun sind wir mit den Mikroinjektionen fertig und werden die Embryonen vom Mikroskop in die Petrischale überführen, die wir mit isotonischem Puffer gefüllt haben. Ich werde das Öl vom Deckglas abwischen, es in ein kleines Stück zerschneiden und dieses in die Petrischale legen.

Jetzt lassen wir sie hier bis zum Ende des Tages bei Raumtemperatur stehen. Danach bringen wir sie in das Insektarium. Heute habe ich Ihnen gezeigt, wie man eine Stechmücke injiziert, um vorübergehend Mücken zu erzeugen.

Und nun müssen wir nur noch warten, bis alle Larven geschlüpft sind. Wir werden sie bis zur Erwachsenenstufe aufziehen, und dann werden sie sich paaren. Danach vergehen drei Wochen, bevor wir mit einem Screening beginnen können, um festzustellen, ob sie umgebaut sind oder nicht.