Name: Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten mittels BN-PAGE. Diese Methode ermöglicht die native Trennung unter Erhaltung von Protein-Protein-Interaktionen für biochemische Analysen.

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Wir danken Michael Reth, Hermann Schägger und Margarita Camacho-Carvajal für die wissenschaftliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde von FORSYS vom Bundesministerium fuer Bildung und Forschung (BMBF) gefördert, durch BIOSS von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), und unterstützt zum Teil durch die Exzellenzinitiative der deutschen Bundesregierung und der Länder (GSC-4, Spemann Graduiertenschule ).

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

In dieser Studie beschreiben wir die Analyse der PLM nach BN-PAGE. Ein 2D-Ansatz ist die erste eigenständige MPC unter nativen Bedingungen verwendet werden, und dann weiter zu unterteilen sie in ihre einzelnen Komponenten durch eine zweite Dimension SDS-PAGE. Die Proben werden aus Zelllysaten vorbereitet. Für die Solubilisierung von vielen Mittelmeer-Partnerländer, ist ein geeignetes Reinigungsmittel benötigt, die bewahrt die Struktur des Protein-Komplexen. Hier verwenden wir 0,1% Triton X-100. Allerdings haben die optimale Reinigungs-und ihrer geeigneten Konzentration empirisch für jeden MPC bestimmt werden. Im Falle von Triton X-100 zum Beispiel wurde berichtet, dass niedrige Detergenzkonzentrationen die Identifizierung einer dimeren Form des F 1 ermöglichen F 0-ATPase-Komplex (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Höhere Triton X-100-Konzentrationen, jedoch auf die Dissoziation des Dimers und zu einer entsprechenden Erhöhung der monomeren F 1 F 0-ATPase-Komplexes führen. Dies steht im Einklang mit einem unserer früheren Studien konnten wir zeigen, dass die multivalente T-Zell-Rezeptor-Komplex (TCR) erhalten bleibt, wenn sie mit geringen Konzentrationen von Brij 96 extrahiert, während die Verwendung von höheren Konzentrationen oder eines anderen Waschmittel genannt Digitonin Ergebnisse in die Gewinnung von monomerem TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Häufig verwendete Reinigungsmittel, die getestet werden können, gehören Digitonin (0,5 bis 1%), Triton X-100 (0,1 bis 0,5%), Brij 96 (0,1 bis 0,5%), oder Dodecylmaltosid (0,1 bis 0,5%). Diese Reagenzien sind ionische Detergenzien, die am besten für MPC Stabilität neigen. Seien Sie sich bewusst, dass der Kontakt mit SDS und andere scharfe Reinigungsmittel sollten vermieden (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Dialyse der Lysate wird benötigt, um MPC Trennung in einem BN-Gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004). Erzielen; (Heiss, Junkes et al 2005).. Es scheint, dass die Einstellung der Salzkonzentration oder die Entfernung von Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht entscheidend für eine hohe Auflösung. Es ist bemerkenswert, dass auch Membran-Präparationen und MPC, die seit immunopurified haben und später aus dem Antikörper eluiert, geeignet für BN-PAGE werden (Swamy, Siegers et al. 2006). In beiden Fällen müssen die Proben nicht für BN-PAGE Trennung dialysiert werden, wenn Membran Lyse oder Elution erfolgt in BN-Lysepuffer durchgeführt. Für Protein Trennung durch BN-PAGE, wird der Farbstoff Coomassie-Blau benötigt, was bindet unspezifisch an Proteine ​​und bedeckt sie mit negativen Ladungen. Dadurch ermöglicht die Coomassie-Blau der elektrophoretischen Mobilität von Proteinen in Richtung der Kathode bei neutralem pH (Schägger und von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al 1994).. Darüber hinaus verhindert Coomassieblau Proteinaggregation in den Stapeln Gel während der Elektrophorese. Für BN-PAGE wurde Coomassie G250, um anstelle von Coomassie Blau R250 oder kolloidale Coomassie Blau verwendet werden. Bevor Sie eine BN-Gel, ist es notwendig, um sicherzustellen, dass der Anteil des Gels auf die erwartete Größe des MPC von Interesse passt. Vorgefertigte BN-Gele mit unterschiedlichen Steigungen und geeignete Puffer sind im Handel erhältlich von Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Aber BN-Gele können auch unter Verwendung eines Gradientenmischer zusammen mit einem persistaltic pumpen. Um zu gewährleisten, eine intakte Gradienten, sollte die Flüssigkeit fließen ständig während des Gießens und Blasen zu vermeiden. Wir empfehlen das Laden von verschiedenen Probenverdünnungen auf das Gel weil Überlastung kann zu Proteinfällung während der Elektrophorese-Verfahren führen. Darüber hinaus sollten BN-Gels bei 4 laufen ° C bis Proteinabbau zu verhindern und zu halten, den Mittelmeer-Partnerländern intakt. Nach BN-PAGE, Visualisierung der Mittelmeer-Partnerländer durch Coomassie Brilliant Blue-Färbung, Silberfärbung oder Immunoblotting erreicht werden. Proteinbanden sichtbar gemacht durch Coomassie-oder Silberfärbung sind für die weitere Analyse geeignet durch Massenspektrometrie (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Im Falle von Immunoblot, haben die optimale Übertragung Bedingungen für die Mittelmeer-Partnerländer von Interesse sind empirisch ermittelt werden. Seien Sie sich bewusst, dass Coomassie-Blau auch während Blotting einer BN-Gel übertragen. Daher wird das Gel nach dem erfolgreichen Transfer farblos, während die Membran eine blaue Farbe ausüben wird. Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass nicht jeder primärer Antikörper, die für den Nachweis nach SDS-PAGE arbeitet, für Immunoblot auf BN-PAGE ist. Es kann vorkommen, dass Antikörper erkennen nicht die MPC von Interesse, weil ihre Epitop in die native Konformation der Proteine ​​verborgen ist. Um dieses Problem zu überwinden, ist es möglich, die Proteine ​​innerhalb der BN-Gel vor der Übertragung durch Kochen denaturiert das Gel kurz in 1x SDS-Probenpuffer. In unserem Beispiel haben wir nicht unter dem BN-Gel direkt auf die Erfassung Proteinbanden. Stattdessen haben wir weiter unterteilt die BN-PAGE getrennt Lysat durch eine zweite dimensiauf SDS-PAGE. In der zweiten Dimension SDS-Gel, monomere Proteine ​​innerhalb einer hyperbolischen diagonal durch die Gradienten-Gel in der ersten und der linear-Gel in der zweiten Dimension (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004) zu migrieren. Dies ermöglicht die einfache Identifizierung der Mittelmeer-Partnerländer, da sie unterhalb dieser hyperbolischen Diagonale lokalisiert sind. Unterkomponenten einer deutlichen MPC sind in einer vertikalen Linie in der zweiten Dimension SDS-PAGE getrennt. Komponenten, die Bestandteile von mehreren dinstinct MPCs sind, können auf einer horizontalen Linie nach der Größe der MPC identifiziert werden. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass mehrere Proteinspots erscheinen in einer vertikalen Linie könnte auch ein Teil der getrennten Komplexen, die an der gleichen Position in BN-PAGE wandern werden. Der endgültige Beweis, dass sie in der gleichen MPC sind, können durch einen Antikörper-basierte Gel-Shift-Assay erhalten. In diesem Assay wird Zelllysat mit einem Antikörper gegen ein Protein, das von einem der identifizierten Spots vor der BN-PAGE vertreten inkubiert. Dies führt zu einer Verschiebung aller MPCs, dass dieses Protein enthalten, zu einem höheren Molekulargewicht in der ersten Dimension. Andere Proteine, die auch ein Teil dieser MPCs wird durchlaufen diese komplexe spezifische Schicht und sind deshalb leicht in die zweite Dimension SDS-Gel zu identifizieren. Nicht nur die Zusammensetzung der Mittelmeer-Partnerländer durch BN-PAGE analysiert werden, sondern auch die Bestimmung ihrer Stöchiometrie ist möglich (Schamel und Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. Zu diesem Zweck kann ein NAMOS Assay (native Antikörper-basierte Mobility-Shift-Assay) durchgeführt werden. Wie in der Antikörper-basierte Gel-Shift-Assay werden die zellulären Lysaten mit monoklonalen Untereinheit-spezifischen Antikörper inkubiert. Dies führt zur Induktion der elektrophoretischen immunoshifts in der BN-Gele, die den Schluss erlauben aus dem Ausmaß der Verschiebung von der Stöchiometrie der MPC In SCHLUSSKOMMENTAR ist BN-PAGE geeignet für die Identifizierung von MPL und die Bestimmung ihrer Größe, Zusammensetzung, sowie relative Häufigkeit. Aufgeführt als NAMOS Assay, es bietet auch die Möglichkeit, die Stöchiometrie einer bestimmten MPC bestimmen. Aufgrund seiner allgemeinen Anwendbarkeit, ist diese Technik ein sehr nützliches Werkzeug für die Charakterisierung von PLM (Dekker, Müller et al 1996.); (Wittig und Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.); (Wittig und Schägger 2009) .

blaue native polyacrylamid-gelelektrophorese (bn-page) zur analyse von multiproteinkomplexen aus zelllysaten

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiproteinkomplexen (MPL) spielen eine entscheidende Rolle für die Zellkommunikation, da die meisten Proteine ​​in funktioneller oder regulatorische Komplexe mit anderen Proteinen (Sali, Glaeser et al. 2003) gefunden werden kann. So erfordert die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktions-Netzwerke die detaillierte Charakterisierung der Mittelmeer-Partnerländer, um ein integratives Verständnis der Funktion von Proteinen und Regulierung zu gewinnen. Zur Identifizierung und Analyse muss MPCs unter nativen Bedingungen getrennt werden. In diesem Video, beschreiben wir die Analyse der Mittelmeer-Partnerländer durch blaue nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-PAGE). BN-PAGE ist eine Technik, die Trennung von MPC ermöglicht in einer nativen Konformation mit einer höheren Auflösung als durch Gelfiltration oder Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation angeboten und ist daher sinnvoll, MPC Größe, Zusammensetzung und relative Häufigkeit (Schägger und von Jagow 1991) bestimmen ; (Schägger, Cramer et al 1994).. Mit dieser Methode werden Proteine ​​nach ihrer hydrodynamischen Größe und Form in einem Polyacrylamid-Matrix getrennt. Hier zeigen wir die Analyse der Mittelmeer-Partnerländer der gesamten zellulären Lysaten und wies darauf hin, dass Lysat Dialyse den entscheidenden Schritt zu machen BN-PAGE für diese biologischen Proben ist. Mit einer Kombination aus der ersten Dimension BN-und die zweite Dimension SDS-PAGE zeigen wir, dass PLM nach BN-PAGE getrennt weiter in ihre einzelnen Bestandteile werden durch SDS-PAGE unterteilt. Visualisierung der MPC-Komponenten auf Gel-Trennung wird durch Standard-Immunblot durchgeführt. Als Beispiel für MPC Analyse von BN-PAGE, wählten wir die gut charakterisierten eukaryotischen 19S, 20S und 26S Proteasomen.

In diesem Video, beschreiben wir die Charakterisierung von Multiproteinkomplexen (MPL) durch blaue nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-PAGE). In einer ersten Dimension sind dialysiert Zelllysaten durch BN-PAGE getrennt an die einzelnen MPL zu identifizieren. In einer zweiten Dimension SDS-PAGE, werden MPC von Interesse weiter unterteilt, um ihre Wähler durch Immunoblot analysieren.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiproteinkomplexe (MPCs) spielen eine entscheidende Rolle in der Zellsignalisierung, da die meisten Proteine in funktionalen oder regulatorischen Komplexen mit anderen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen MultiPro-Komplex aus zellulären Lysaten mittels blauer nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu charakterisieren, bei der im Gegensatz zur SDS-Gelelektrophorese die Trennung der Proteine unter nativen Bedingungen erfolgt und somit Protein-Protein-Interaktionen erhalten bleiben. Dies wird erreicht, indem das zelluläre Lysat dialysiert wird, um überschüssige Salze zu entfernen, wodurch die Probe für die Trennung mittels blauer nativer Gelelektrophorese als zweiter Schritt geeignet wird. Das Lysat wird auf die eindimensionale blaue native Gelelektrophorese aufgetragen, die Protein-Komplexe unter nativen Bedingungen entsprechend ihrer Größe und Form trennt.Danach eine zweite Dimension. Eine denaturierende SDS-Gelelektrophorese wird durchgeführt, um die Komplexe in ihre einzelnen Bestandteile aufzutrennen. Proteine können durch Silber- oder Kumasi-Färbung oder durch Western Blotting sichtbar gemacht werden.Hier wurden getrennte Proteine im folgenden Nachweis durch Silberfärbung detektiert, es wird jedoch die Westernblot-Analyse verwendet. Hallo, ich bin Brita Bloom aus dem Labor von Wolfgang Sharmel an der Abteilung für Molekulare Immunologie am Max-Planck-Institut für Immunbiologie in Freiburg, Deutschland. Hallo, ich bin Dina Fiala.Ich komme ebenfalls aus dem Sham-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Analyse von MultiPro-Komplexen aus zellulären Lysaten. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Zusammensetzung mehrteiliger Membranrezeptoren zu untersuchen.Doch in diesem Video verwenden wir Tic-Proteasom als Beispiel. Beginnen wir also. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, bereiten Sie alle Puffer gemäß der schriftlichen Anleitung vor und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.10 Millionen HEC 2 9 3-Zellen gewinnen und durch Zentrifugation bei 350 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius pelletieren. Anschließend die Zellpellets mit einem Milliliter eiskalter PBS waschen und die gewaschenen Zellen erneut durch Zentrifugation pelletieren. Diesen Waschschritt zweimal wiederholen und dann das gewaschene Zellpellet in 250 Mikrolitern Eis resuspendieren.Kalte blaue, native Lysepuffer hinzufügen und die Suspension 15 Minuten auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation die lebenden Zellen bei 13.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um unlösliches Material zu entfernen. In der Zwischenzeit mit der erhitzten Seite mit großem Durchmesser einer Pasteurpipette ein Loch in die Kappe eines 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens schmelzen.Danach das Röhrchen auf Eis stellen, um es auf vier Grad Celsius abzukühlen. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, das Lysat in das Röhrchen zur Salzentfernung durch Dialyse überführen. Eine Dialysmembran mit einer Grenzgröße von 10 Kilodalton auf das offene Röhrchen legen.Schließen Sie die Kappe und schneiden Sie überschüssige Dialysemembran ab. Versiegeln Sie dann vorsichtig die Seite der Kappe mit Parafilm. Sobald dies erfolgt ist, drehen Sie das Gefäß um und stellen es verkehrt herum in ein 50-Milliliter-Konischgefäß. Zentrifugieren Sie die Probe für 10 Sekunden mit der niedrigstmöglichen Drehzahl.Stellen Sie in einem Zentrifugen-Gerät für Zellkulturen einen 100-Milliliter-Becher mit kaltem blauen, nati­vem Dialysepuffer und einem magnetischen Rührstab bereit, wobei mindestens 10 Milliliter blauen, nati­ven Dialysepuffers pro 100 Mikroliter Probe verwendet werden. Entfernen Sie dann das umgestülpte Röhrchen aus dem Konusrohr mithilfe einer Pinzette. Achten Sie darauf, das Röhrchen nicht wieder in die aufrechte Position zu drehen.Fixieren Sie das Röhrchen mit Klebeband verkehrt herum im Becher und entfernen Sie Luftblasen aus dem Loch unterhalb der Kappe. Unter Verwendung einer gebogenen Pasteurpipette schalten Sie den magnetischen Rührer ein und lassen die Probe sechs Stunden oder über Nacht im Kühlschrank dialysieren. Überprüfen Sie die Probe gelegentlich, um sicherzustellen, dass das Rühren keine Luftblasen an der Dialysemembran erzeugt.Nach der Inkubation überführen Sie das dialysierte Zelllysat in ein neues gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen und lassen es auf Eis, bis es auf das Gelelektrophorese-Gel aufgetragen wird. Das Gießen des Gels erfolgt bei Raumtemperatur mit einem Gradientenmischer. Stellen Sie den Gradientenmischer auf einen Rührer und verbinden Sie ihn mit einem Stück flexiblen Schlauchs.Schließen Sie den Kanal des Gradientenmischers mit dem Ventil und verschließen Sie den Schlauch mit einer Klemme. Platzieren Sie einen magnetischen Rührstab in den mit dem Schlauch verbundenen Zylinder. Führen Sie als Nächstes den flexiblen Schlauch in eine peristaltische Pumpe ein und befestigen Sie eine Spritzennadel an dessen Ende.Bringen Sie dann die Nadel zwischen den beiden Glasplatten an der Oberseite der Gelelektrophoresevorrichtung an. Bereiten Sie 4 %ige und 15 %ige Trenngellösungen vor, sodass die kombinierten Volumina dem Volumen des Trenngels entsprechen. Geben Sie unmittelbar davor ein PS und TM me hinzu.Verwenden und gießen Sie die Gel-Lösungen in die entsprechenden Zylinder des Gradientenmischers. Schalten Sie dann das Gerät ein und öffnen Sie das Ventil. Drücken Sie auf den linken Zylinder, um die Luftblase aus dem Kanal zwischen den beiden Gel-Behältern herauszudrücken.Schalten Sie die Pumpe auf fünf Milliliter pro Minute ein. Entfernen Sie die Klemme und lassen Sie das Gel langsam zwischen den Glasplatten fließen. Heben Sie die Nadel langsam an, wenn das Gel anhält, und stellen Sie sicher, dass sich die Nadel stets über der Flüssigkeit befindet.Lassen Sie die gesamte Flüssigkeit in die Gelelektrophoreseapparatur eintreten. Überlagern Sie die Flüssigkeit anschließend vorsichtig mit Isopropanol und spülen Sie die Apparatur mit destilliertem Wasser aus. Lassen Sie das Gel mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren.Bereiten Sie anschließend ein 3,2 %iges Anreicherungsgel vor und fügen Sie unmittelbar vor der Verwendung ein PS und TM me hinzu. Gießen Sie das Anreicherungsgel auf das Trenngel und führen Sie den Kamm zwischen die Glasplatten ein, wobei Blasen vermieden werden sollten. Nach der Polymerisation des Anreicherungsgels kühlen Sie das Gel unverzüglich vor dem Beladen mit der Probe auf vier Grad Celsius ab.Entfernen Sie den Kamm langsam, indem Sie ihn in einem Winkel zur Ebene des Gels herausziehen. Dadurch gelangt Luft rasch in die Taschen, was die Qualität der Vertiefungen verbessert, um das dialysierte Zelllysat durch Blue Native PAGE aufzutrennen. Geben Sie 20 Mikroliter des Ferritinmarkers und 40 Mikroliter des dialysierten Lysats in die trockenen Vertiefungen. Bei vier Grad Celsius werden leere Spuren mit gleichen Volumina Dialysepuffer gefüllt. Anschließend überlagern Sie die Proben in jeder Vertiefung mit kaltem Kathodenpuffer.Füllen Sie die innere Kammer mit kaltem Kathodenpuffer und die äußere Kammer mit kaltem Anodenpuffer. Arbeiten Sie bei vier Grad Celsius und legen Sie 100 Volt an, bis die Proben in das Trenngel eingewandert sind. Erhöhen Sie dann die Spannung auf 180 Volt und führen Sie das Gel so lange weiter, bis die Farbfront das Ende des Gels erreicht hat.Der Lauf dauert drei bis vier Stunden. Für die SDS-Gelelektrophorese in der zweiten Dimension bereiten Sie ein standardmäßiges 10 % SDS-Gel mit einer einzigen großen Laufbahn vor. Eine Laufbahn für den Molekulargewichtsmarker und eine Laufbahn für ein Aliquot des dialysierten Lysat-Kontrollproben, das mit SDS-Probenpuffer versetzt und fünf Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzt wurde. Entfernen Sie das Blue-Native-Page-Gel in den Glasplatten aus dem Elektrophoresegerät und heben Sie vorsichtig eine Platte an.Entfernen Sie das Stapelgel und schneiden Sie die Spur des Blue-Native-PAGE-Gels mit den Proteinen von Interesse aus. Geben Sie das Blue-Native-PAGE-Gel-Stück in SDS-Probelösungspuffer und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Anschließend das Gel-Stück kurz in einer Mikrowelle erhitzen und danach weitere 15 Minuten inkubieren.Entfernen Sie in dem SDS-Probe-Puffer auf einem Schüttler den Kamm des SDS-Gels und füllen Sie etwas SDS-Puffer in die Vertiefung, laden Sie die Blue-Native-PAGE-Gel-Scheibe in das große Loch des SDS-Gels. Vermeiden Sie Luftblasen. Möglicherweise möchten Sie eine Pinzette zur Hilfe nehmen, da die Gel-Scheibe exakt auf dem Stapelgel liegen muss.Überlagern Sie den Schnitt mit SDS-Probelösungspuffer, anschließend laden Sie den Marker und die Lysat-Kontrolle auf. Führen Sie die Elektrophorese und den Proteinentransfer gemäß Standardprotokollen durch. Zur Interpretation der Ergebnisse ist es wichtig zu wissen, dass die Position eines Proteins in der zweidimensionalen blauen nativen SDS-Gelelektrophorese Hinweise darauf gibt, ob das Protein Teil eines MultiPro-Komplexes ist oder nicht.Einfache Proteine wandern aufgrund des Gradientengels in der ersten Dimension entlang einer hyperbolischen Diagonalen und als lineares Gel in der zweiten Dimension; Untereinheiten von MultiPro-Komplexen befinden sich unterhalb der Diagonalen und bilden eine vertikale Linie. Wenn ein bestimmtes Protein Bestandteil verschiedener Komplexe ist, werden mehrere Spot in einer horizontalen Linie nachgewiesen. Zusammenfassend ermöglicht die zweidimensionale Blue Native PAGE/SDS-PAGE-Methode die Bestimmung der Zusammensetzung, Größe und relativen Häufigkeit von MultiPro-Komplexen.In dieser Demonstration wurden mehrere Proteasome oder Untereinheiten mittels Western Blot nachgewiesen. Die Untereinheiten Beta-Zwei und MCP 21 konnten als einzelne Flecken detektiert werden, die vertikal angeordnet sind, was darauf hinweist, dass sie Teil derselben Komplexe sind. PA 28 befindet sich in einer vertikalen Linie mit Beta-Zwei und CP 21 und ist somit Teil desselben Komplexes.Wenn man die horizontalen Linien betrachtet, erkennt man, dass Beta zwei und MCP 21 Bestandteil von drei verschiedenen Komplexen sind. PA 28 kommt nur in einem dieser Komplexe vor. Daher könnten diese MultiPro-Komplexe als 20 S Proteasom und 20 s Proteasom identifiziert werden.Zusammen mit P 28 und dem 20 S Proteasom allein haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie man native MultiPro-Komplexe aus einem zellulären Lysat mittels Blue Native PAGE trennen und charakterisieren kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Probe sorgfältig zu dialysieren. Um Kontakt mit SDS zu vermeiden und stets bei vier Grad zu arbeiten, empfehlen wir, verschiedene Detergenzien für die Zelllyse zu vergleichen, um sowohl die Integrität der Motorproteinkomplexe als auch eine optimale Solubilisierung zu erreichen.Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Ich bin dabei.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Proteinzusammensetzung von großen native Protein: Protein und Protein zu analysieren: Nukleinsäure-komplexe aus Raps (B. Napus) Phloem Exsudat mit einem 3D Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Ansatz kombiniert blau Native (BN) mit zwei denaturierenden Seiten gefolgt von massenspektrometrische Identifizierung.

Phloem Sap Probenahme aus Brassica Napus für 3D-Seite von Protein und Ribonucleoprotein komplexe

Ein Protokoll für die Aufklärung der Pflanze Thylakoidmembran Protein komplexe Organisation und Zusammensetzung mit blauen native Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Das Protokoll ist optimiert für Arabidopsis Thaliana, aber für andere Pflanzenarten mit geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden.

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Lernen Sie die Charakterisierung von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten mittels BN-PAGE. Diese Methode ermöglicht die native Trennung unter Erhaltung von Protein-Protein-Interaktionen für biochemische Analysen.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

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