Name: Upright Imaging von Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Lernen Sie ein Einbettungsprotokoll für aufrechte Bildgebung von Drosophila-Embryonen mit konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Embryonengröße und Quantifizierung von Genexpression.

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Die Autoren danken insbesondere Deborah Harris und Danielle MacKay. Unterstützung für diese Arbeit wurde von der Fakultät für Biologie und dem College of Arts and Sciences der CWRU Verfügung gestellt und durch HHMI Förderkennzeichen 52005866 zur Unterstützung von Undergraduate-Ausbildung in den biologischen Wissenschaften.

1. Imaging-Methodik <ol><li> Melt Glyzerin-Gelatine in einem 55 ° C Grad Wasserbad für 20-30 Minuten, bis es eine homogene Flüssigkeit wird. Swirl, aber nicht die Flasche schütteln, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. </li><li> Während das Gelee schmilzt, eine dünne Schicht von Glycerin mit einem Kimwipe auf einen sauberen Glasobjektträger (optional). </li><li> Pipette 1 bis 1,5 ml geschmolzenem Glyzerin-Gelatine mit einem Schnitt P1000 Pipettenspitze auf der Oberfläche der Folie, um eine dünne erste Schicht zu erzeugen. Pipette vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie das Gelee erstarren für 5 min auf einer horizontalen Fläche, dann die Folie bei -20 ° C für 5 min und fahren Sie mit Embryo Ausrichtung. Alternativ Abdeckung der Folie mit Saran Wrap und legen Sie sie bei 4 ° C für bis zu 5 Tage. </li><li> Pipette einen kleinen Tropfen gefärbten Embryonen in 70% Glycerin / PBS oder andere Antifade Glycerin-Basis Montage Medien (zB Slowfade oder Vectashield) auf der Seite des Gelee Betten. </li><li> Begin pre-Ausrichtung der Embryonen, die durch individuell ihre Übertragung aus dem Drop auf das Gelee Oberfläche. Übertragen Sie sie mit einer schrägen Injektionsnadel, mit dem schrägen Seite wie ein Löffel. </li><li> Rund Ort des Embryos entlang von 2 bis 3 Spalten. Wenn ein Embryo in die Nadel stecken bleibt, rühren Sie ihn in der Dropdown mit den anderen Embryonen, um sie freizugeben. Verschwenden Sie keine Zeit sorgfältig richtet sie an dieser Stelle. Lassen Sie etwas Platz zwischen den Spalten. </li><li> Richten Sie die Embryonen, indem sie horizontal auf dem Gelee Medium mit Hilfe der Injektionsnadel. Während Sie, richten Sie die Köpfe und Schwänze in die gleiche Richtung. Machen Sie sie parallel zueinander entlang der Spalte. Entfernen Sie überschüssiges PBS Glycerin als einen Weg mit einem Stück gedreht Kimiwipe links. Hinweis: Überschüssige Glycerin verursacht Embryonen zu locker eingeschlossen in Gel, wodurch die Trennung der beiden Gelee Schichten, so dass es schwierig zu schneiden und zu montieren. Umgekehrt wird das Entfernen zu viel Glycerin trocken und flach Embryonen. </li><li> Verwenden Sie einen Schnitt gelber Spitze, eine dünne Schicht von Gelee über die Embryonen (50-150 ul, je nachdem wie viele ausgerichtet wurden) zu verbreiten. </li><li> Legen Sie gleiten in -20 ° C Gefrierschrank für 10-20 min oder lagern Sie es bei 4 ° C über Nacht. Stellen Sie sicher, das Gelee ist völlig starr vor dem Schneiden. Andernfalls wird der Block von Embryonen sehr schwierig sein, Verbrauchsteuern. Die besten Ergebnisse für das Schneiden sind am nächsten Tag erhalten. </li><li> Unter einem Binokular, verwenden Sie eine Rasierklinge vollständig durchschnitten das Gelee auf beiden Seiten der ausgerichteten Embryonen. Halten Sie die Rasierklinge in einem 90 ° Winkel gerade Schnitte zu machen. Die Schnitte sollten sehr nahe an den vorderen und hinteren Pole des Embryos in der Nähe, um überschüssige Gelee, das Bildgebung behindern könnten vermieden werden. </li><li> 100-200 ul kalter PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) neben der Schnitte und sorgfältig abkratzen das Gelee zwischen Embryonen mit einem Spatel. Hinweis: Das Waschmittel in PBT hilft das Entfernen des Gelee aus der Folie ohne Beschädigung des Embryos. </li><li> Mit einer Nadel, übertragen Sie die Block-Gelee mit eingebetteten Embryonen zu einem sauberen Objektträger zur weiteren Schnitt. Cut kleinere Blöcke mit 5-7 Embryos. Verwenden Sie PBT, um leicht die Gelee-Block zu bewegen. Alternativ, setzen Sie den Block auf einer trockenen Glasoberfläche zu lassen, um das Glas, das mehr Stabilität für präzise Beschneiden der Gelee, wenn nötig schafft befestigen. </li><li> Flip aufrechte die Embryonen in die Gelee mit Hilfe einer Rasierklinge und einer Nadel eingebettet. Für die Visualisierung unter dem Mikroskop, die entweder mit einem der beiden unten angegebenen Schritte aus, abhängig von der Art des Stativs verwendet wird. </li><li> Inversen Mikroskop: Platz beendete Embryo Blöcke auf einen langen Deckglas mit Embryonen in eine aufrechte Position. Stellen Sie sicher, dass die Seite des Embryos mit der geringsten Menge von Gelee wird in engeren Kontakt mit Ziel sein. </li><li> Aufrechten Mikroskop: make zwei Stapel mit vier Nr. 1 Deckgläser mit Sekundenkleber verklebt als "unterstützt" verwendet werden und statt der Embryo-Block in Glycerin zwischen den "unterstützt". Brücke der Stapel mit einem langen Deckglas. </li><li> Für konfokale Analyse, Überprüfung der Arbeitsabstand der Ziele, die verwendet werden, um herauszufinden, ob man sich vorstellen kann den ganzen Weg durch den Embryo oder nur teilweise. Zum Beispiel, D. melanogaster Embryonen ~ 0,55 mm in der Länge und kann vollständig abgebildet werden mit Hilfe eines Zeiss 20x Plan-Apo oder 40x LD Neo-Fluor Ziel. Die folgende Website bietet Informationen zu verfügbaren Zeiss Ziele und gibt Ihnen die Möglichkeit, Ziele nach Arbeitsabstände Suche: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse Da die Embryonen links intakt sind, kann diese Methode verwendet, um präzise Messungen der Embryo Größe und Abstände zwischen Genexpressionsmuster ergreifen. In Abbildung 1 zeigen wir eine Blastodermstadium Embryonen mit der Kernfärbung DAPI (blau), Anti-Dorsal-Protein (rot), sog mRNA (gelb) und sna mRNA (grün) gefärbt. Morphologische Verarbeitungses kann wie Invagination des Mesoderms (Abb. 2A, B) und die Migration von mesodermalen Zellen (Abb. 3 und 4) visualisiert werden mit dieser Methode. Verschiedene Z-Positionen entlang der DV-Achse kann durch Änderung der Fokusebene erhalten werden, wie in den Abbildungen 2-4 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Upright optische Scheibe eines intakten Embryos in Blastodermstadium. Doppelfärbung für mRNA und Protein. Ziel-mRNAs für in situ Sonden (sog und SNA) und Protein, das von primärer Antikörper (anti-Dorsal) gefärbt sind in der Figur angedeutet. DAPI wurde verwendet, um die Kerne Etikett. Beachten Sie, dass die Expression des sog und sna apikal sind im Zytoplasma lokalisiert, während die Expression von Dorsal ist die Kernkraft. Starke Signale aus sog entstehenden Transkripte, die in den Kernen liegen auch bei dieser Vergrößerung zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Upright Bildgebung von einer intakten gastrulating Embryo. MRNA-Sonden verwendet werden und ihre jeweiligen Farben sind in der Figur angedeutet. A) Beachten Sie, dass in dieser Phase drei Gene mit gleicher Fluor (SNA, sog und dpp, in grün), gefärbt sind in räumlich getrennten Bereichen zum Ausdruck gebracht. Die einstülpende Mesoderm drückt sna, drückt die Neuroblasten Schicht ind und dem Ektoderm drückt dpp, während sog Ausdruck ist noch im ventralen Regionen des Nervensystems. B) In einem tieferen konfokalen Ebene des gleichen Embryos, bemerken wir die Basis des einstülpende Mesoderm stark drückt sna, aber die apikale Region drückt unteren Ebenen. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Upright Bildgebung von einer intakten Embryo mit Keimstreifs erweitert sog RNA (gelb);. Schnecke, ind und dpp mRNAs (grün), Dorsal-Protein (rot). Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. A) Focal-plane in der Nähe Embryo Kopf. B) Ein weiterer Schwerpunkt Flugzeug in den Kofferraum Region gleichen Embryos. Hinweis Masse von Mesodermzellen vor seitlichen Migration (vgl. Abbildung 4) liegen in der Nähe der ventralen Mittellinie auf beiden Seiten ein Keim-Band erweitert Embryo. Delaminierenden Neuroblasten sind in grün (ind und SNA) gekennzeichnet. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Upright Bildgebung von einer intakten Embryo während Keimstreifs Erweiterung sog RNA (gelb);. Schnecke, ind und dpp mRNAs (grün), Dorsal-Protein (rot). A) Man beachte die Delamination Neuroblasten aus dem Epithel (Pfeil), gebeizt sowohl für ind und sna in dieser Phase (grün). Beachten Sie auch die beschränkte Expression von sog an der ventralen Mittellinie (gelb). Expression von dpp in diesem Stadium kann bei der lateralen Seite des Embryos (Stern) zu sehen. B) Optische Abschnitt in der gleichen Embryo in A am Ende des Embryos Länge, die bis Mitte hinteren Bereich entspricht gezeigt. Die ventralen Mittellinie Zellen sind für die sog gefärbt.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

Unter Querschnitt Bilder von Drosophila Embryonen kann eine Herausforderung sein, da sie entweder eine sorgfältige Hand Dissektion der Scheiben 2 oder die Verwendung von eingebetteten Medien für Mikrotom Verarbeitung, die in der Regel nachteilig für fluoreszierende Färbungen benötigt. Alternativ können Z-Stapel in einem konfokalen Mikroskop verwendet werden, um 3D-Rekonstruktion von Schnittbildern zu machen. Es ist jedoch zeitaufwendig, mehrere dünne Scheiben Confocal für eine genaue 3D-Rekonstruktion und Bleichen Problematisch wird machen. Ein weiteres Problem bei der Abbildung Embryonen, die in Längsrichtung montiert sind die Lichtstreuung, die bei Erreichen tieferen Abschnitte des Embryos, die auch erschwert unter präzise Messungen der Fluoreszenz-Signale für die Zwecke der Quantifizierung von Proteinen oder mRNA-Expression Level 1 erfolgt ist. Selbst mit einem Zwei-Photonen-konfokalen Mikroskop, ist die Lichtstreuung noch ein Anliegen wegen der Undurchsichtigkeit der Dotter Material in der Mitte des Embryos, die Auswahl der Montage Medien für eine optimale Transparenz der Probe zu begrenzen lässt. Um diese Probleme zu umgehen, eine neue Technik namens &quot;End-on&quot; imaging der Positionierung Embryonen vertikal wurde vor kurzem zum Bild sowohl live als auch feste Proben 4 entwickelt. In diesem Papier haben wir ein neues Protokoll für vertikal montierte Embryonen, die eine einfache Erstellung und Visualisierung von festen Embryonen oder Gewebe von beliebiger Größe und Form, die mit mehreren in-situ-Sonden 3 gefärbt werden können. Unsere Methode besteht in der Verwendung einer Montageplatte Medien mit gelartige Konsistenz, die zur Ausrichtung Embryonen darin einzuhüllen ist. Cut Blöcke dieser Montage Medien mit eingebetteten Embryonen aufrecht vor der Belichtung in jeder Art von konfokalen Mikroskop positioniert werden. Durch die Einbettung der Embryonen in die Gallerte und die Positionierung vertikal, sind wir in der Lage, horizontale Querschnitte nehmen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, in denen die Zellen entlang der dorsal-ventralen Achse des Embryos gleichzeitig dargestellt werden. Dies ist eine deutliche Verbesserung für die Quantifizierung Zwecke, da Probleme der Lichtstreuung und Bleichen der Fluoreszenzfarbstoffe, die in konventionellen Z-Stapel-Rekonstruktion des längs eingebauten Embryonen tritt nun beseitigt. So ist die Quantifizierung der Genexpression oder Protein-Ebene entlang der dorsal-ventralen Achse genau, da die Zellen an den gegenüberliegenden dorsal-ventral Positionen angeordnet gleichzeitig und am gleichen konfokalen Z-Position abgebildet werden. Darüber hinaus ermöglicht das beschriebene Verfahren uns zu einem kompletten 2-D Bild über die dorsal-ventrale Achse von einem 3-D Embryo zu erhalten, ohne komplexe Berechnungen Abrollen Methoden, um Zellen an verschiedenen Positionen entlang der DV-Achse 6 zu visualisieren. Einige der kritischen Schritte umfassen die Beseitigung von überschüssigen Glycerins nach dem Ausrichten Embryonen zu vermeiden, aufgeteilt zwischen den beiden Schichten von Gelee. Allerdings, wenn die Probe zu dehydriert ist, wird das resultierende Bild wird unförmig und haben falsche Morphologie. Darüber hinaus, wenn das Gelee Medium rund um den Embryo in einem Winkel, anstatt gerade geschnitten wird, kann das resultierende Bild erscheint weniger rund und mehr eiförmige Gestalt, wegen einer falschen Positionierung der Embryonen in einem anderen Winkel als 90 Grad. Schließlich, wenn das Gelee ist nicht eng genug geschnitten, um den Embryo auf der vorderen / hinteren Enden, ist es nicht möglich, ein richtiges Bild zu erhalten, weil das Ziel der Arbeitsabstand hauptsächlich verwendet würde, um in das Gelee und nicht den Embryo zu konzentrieren. Ein weiterer wichtiger Schritt, die erforderlich sind, wenn bildgebende späten gastrulating Embryo ist sorgfältig zu sortieren Stufen von Interesse unter den Anwendungsbereich vor deren Ausrichtung. Normalerweise sind Embryonen nach morphologischen Merkmalen, die am leichtesten erkannt werden, wenn in einem Längs-Position kann in Szene gesetzt. Unter alternative Änderungen, die mit dieser Methode gemacht werden kann, ist ein Anti-Fade-Reagenz (z. B. p-Phenylendiamin oder PPD) in die zweite Schicht von Gelee zum Schutz vor Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe gehören.

<table><tbody><tr><td>Glycerin-Gelatine-Einbettmedium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Enthält eine geringe Konzentration Phenol als Konservierungsmittel und sollte in einem Abzug oder gut belüfteten Bereich verwendet werden. Das Rezept zur Herstellung des eigenen Mediums ist in Zander, 1997 beschrieben.</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 700 Konfokal</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Folgende Objektive wurden verwendet: Plan-Apo 20x 0,8 M27 (WD 0,55 mm); EC Plan-Neofluar 40x 1,3 Öl (WD 0,21 mm); LD Plan-Neofluar 0,6 Korr 40x (WD 2,9 mm).</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>Größe 1 &amp;#189; (spezifisch für die in dieser Arbeit verwendeten Objektive).</td></tr><tr><td>Deckgläser (zur Herstellung von Abstandhaltern)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Vier Deckgläser mit Sekundenkleber verkleben.</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td></td><td></td><td>Industrieklingen aus Stahl mit Rücken, einseitig</td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermikannadeln</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>26 Gauge</td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

upright imaging von drosophila embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Mehrere bekannte morphogenetischen Gradienten und zelluläre Bewegungen treten entlang der dorsal / ventral Achse des<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo. Allerdings sind die aktuellen Techniken verwendet, um solche Prozesse Blick etwas begrenzt. Das folgende Protokoll beschreibt eine neue Technik für die Montage fixiert und beschriftet<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen für koronare Betrachtung mit konfokale Bildgebung. Diese Methode besteht aus Einbettung Embryonen zwischen zwei Schichten aus Glyzerin-Gelatine Montage Medien-und Imaging-Gelee-Streifen positioniert aufrecht. Der erste Schritt für sandwiching der Embryonen ist eine dünne Bettwäsche von Glyzerin-Gelatine auf einer Folie zu machen. Als nächstes werden Embryonen sorgfältig auf dieser Fläche ausgerichtet und mit einer zweiten Schicht von Gelee. Nach der zweiten Schicht verfestigt, sind Streifen von Gelee geschnitten und gespiegelt aufrecht für die Bildgebung. Alternativen sind für die Visualisierung der Embryonen in Abhängigkeit vom Typ des Stativs eingesetzt werden beschrieben. Da alle Zellen entlang der dorsal-ventralen Achse in einem einzigen konfokalen Z-Ebene abgebildet werden, erlaubt unsere Methode eine präzise Messung und Vergleich der Fluoreszenz-Signale ohne Bleichen oder Lichtstreuung gemeinsamen 3D-Rekonstruktionen von längs eingebauten Embryonen.

Hier präsentieren wir eine Montage-Protokoll für Kirchenfenster<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen in einer aufrechten Position, die Darstellung von Querschnitten durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Mehrere bekannte morphogenetische Gradienten und Zellbewegungen treten entlang der dorsal-ventralen Achse des Drosophila-Embryos auf. Die derzeitigen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mittels konfokaler Mikroskopie koronare Ansichtsbilder intakter Oph-Embryonen zu erhalten, die zur genauen Bestimmung der Embryogröße sowie zur Quantifizierung der Proteine und RNA-Expressionslevel verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem ein montagefähiges Medium gelatinöser Konsistenz verwendet wird, um die Embryonen darin einzuschließen und aufrecht zu positionieren. Als erster Schritt.Die Embryonen werden über einer dünnen Schicht Glycerin-Gel ausgerichtet und anschließend mit einer zweiten Schicht dieses Mediums bedeckt. Danach wird das Einbettungsmedium mit den Embryonen in Blöcke geschnitten, die vertikal umgedreht werden können, um sie festzuhalten. Die Embryonen in Position für die Bildgebung liefern Ergebnisse, die Querschnittsbilder zeigen, die mit jeder Art von konfokalem Mikroskop sichtbar gemacht wurden.Hallo, mein Name ist Milu. Ich bin Doktorandin am Meso-Labor der Biologieabteilung der Case Western Reserve University. Heute werden wir eine Montageanleitung zur Abbildung von PHI-Embryonen in einer dorsalen Position mittels konfokalem Mikroskop demonstrieren.Wir haben diese Methode während unseres Entwicklungsbiologiekurses im Labor an der Case in Zusammenarbeit mit Dr. entwickelt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Endon-Bildgebungstechnik, die vom Mindin-Labor entwickelt wurde, liegt darin, dass sie eine einfache Vorbereitung und Visualisierung fixierter Embryonen oder Gewebe beliebiger Größe und Form ermöglicht. Die Idee zu dieser Methode kam uns erstmals, als wir Querschnitte sehr kleiner Embryonen anderer Gesso-Arten visualisieren mussten, die äußerst schwierig per Hand zu schneiden gewesen wären. Diese Methode kann dazu beitragen, Fragestellungen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, indem sie eine präzise Quantifizierung der Genexpression und Proteinspiegel entlang der dorsoventralen Achse ermöglicht.Üblicherweise werden Embryonen longitudinal eingebettet. Obwohl es möglich ist, Zack-Rekonstruktionen von Querschnitten zu erhalten, tritt häufig ein Problem durch Photobleichen der fluoreszierenden Augen und Lichtstreuung auf, und der Prozess ist sehr zeitaufwendig. Unsere Technik minimiert diese Probleme, da Querschnittsbilder von Embryonen entlang eines einzelnen konfokalen Punktes visualisiert werden.Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten beim Schneiden der Glycerin-Jolly-Blöcke nahe der Embryospitze haben. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da sie ein sorgfältiges Vorgehen erfordert. Wir haben heute eine Demonstration unserer Studentinnen Catherine Chen und Catty vorbereitet, um Drosophila-Embryonen für die aufrechte Bildgebung vorzubereiten.Schmelzen Sie zunächst Glyceringelatine im Wasserbad bei 55 Grad Celsius 20 bis 30 Minuten lang, bis sie sich in eine homogene flüssige Masse verwandelt hat. Schütteln Sie die Flasche dabei nicht, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Geben Sie mithilfe einer abgeschnittenen P-1000-Pipettenspitze vorsichtig ein Milliliter geschmolzene Glyceringelatine auf den Objektträger. Um eine dünne, gleichmäßige erste Schicht ohne Luftblasen zu erzeugen, lassen Sie das Gel fünf Minuten lang auf einer horizontalen Oberfläche fest werden. Anschließend stellen Sie den Objektträger für fünf Minuten in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Alternativ können Sie den Objektträger mit Plastikfolie abdecken und bis zu fünf Tage bei vier Grad Celsius lagern.Nachdem die erste Geleinschicht erstarrt ist, bringen Sie den Objektträger zum Mikroskop und fahren Sie mit der Ausrichtung der Embryonen fort. Geben Sie eine kleine Menge gefärbter Embryonen und 70 % PBS-Glycerin mit der Pipette an die Seite der ersten Geleinschicht. Richten Sie unter dem Mikroskop die Embryonen nebeneinander entlang von drei bis vier Spalten pro Objektträger aus.Verwenden Sie eine Hohlnadel, um sie mit der schrägen Seite der Nadel aufzunehmen, wie mit einem Löffel. Orientieren Sie vorsichtig die Köpfe aller Embryonen in dieselbe Richtung, indem Sie sie mit Hilfe der Nadel horizontal über das Gelemedium schieben.Die endgültige Anordnung der ausgerichteten Embryonen entspricht derjenigen, die für die DNA-Injektion beschrieben wurde. Mit einem verdrehten Stück Kimwipe überschüssiges PBS-Glycerin von den Embryonen entfernen. Vorsichtig zwischen 50 und 300 Mikroliter geschmolzenes Glyceringel über die Embryonen pipettieren, abhängig von der Anzahl der Embryonen, um eine zweite Gelschicht zu bilden.Schließlich die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius fünf bis zehn Minuten abkühlen lassen oder über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Um die in Glycerin eingebetteten Embryonen vom Objektträger zu entfernen und unter einem Stereomikroskop abzubilden, mit einer Rasierklinge nahe an den anterior und posterior gelegenen Seiten der ausgerichteten Embryonen durch das Gel schneiden. Die Rasierklinge in einem Winkel von 90 Grad halten.Um gerade Schnitte zu erhalten, 100 bis 200 Mikroliter kaltes PBT neben die Schnitte geben. Vorsichtig das Gel um die Embryonen herum abschaben. Mithilfe eines Spatels hilft PBT, den Embryonenblock freizusetzen.Übertragen Sie den Block auf einen trockenen Objektträger, um ihn weiter zu schneiden. Schneiden Sie zunächst kleinere Blöcke mit fünf bis sieben Embryonen darin. Schneiden Sie anschließend überschüssiges Glycerin-Gel ab, das die Bildgebung beeinträchtigen könnte.Schließlich drehen Sie die eingebetteten Embryonen mithilfe einer Rasierklinge und einer Nadel in eine aufrechte Position. Um Drosophila-Embryonen mit einem invertierten konfokalen Mikroskop zu visualisieren, platzieren Sie den Geleblock mit den Embryonen auf einen Deckgläser. Stellen Sie sicher, dass die Seite des Embryos mit der geringsten Geleinschicht enger mit der Objektivlinse in Kontakt steht.Wenn ein aufrechter Mikroskop zur Bildgebung verwendet wird, bereiten Sie vier Stapel aus Superglue vor. Nummer eins: Deckgläser als Abstandshalter verwenden und den Embryoblock in Glycerin zwischen den Abstandshaltern platzieren. Verbinden Sie die Stapel mit einem längeren Deckglas für die konfokale Analyse.Platzieren Sie das Präparat auf dem Mikroskoptisch. Überprüfen Sie den Arbeitsabstand der verwendeten Objektive, um festzustellen, ob Sie das Embryo vollständig oder nur teilweise durchmessen können. Richten Sie die Konfokal-Einstellung am Computer entsprechend ein, um mit der Bildaufnahme zu beginnen, wie hier gezeigt. Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, können Querschnittsbilder von Embryonen mit intakter Morphologie beobachtet werden, da die Embryonen intakt belassen werden.Mit dieser Methode können präzise Messungen der Embryogrößen und Genexpressionslevel entlang der dorsoventralen Achse durchgeführt werden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in 30 bis 45 Minuten durchgeführt werden. Es ist wichtig, überschüssiges Glycerin zu entfernen, bevor die zweite Schicht Glyceringel über die Embryonen gegossen wird.Andernfalls können sich die beiden Schichten trennen und den Schrittschneidevorgang erschweren. Außerdem müssen Sie den Arbeitsabstand der verwendeten Objektive überprüfen, um sicherzustellen, ob Sie den gesamten Embryo oder nur einen Teil davon abbilden können, da der Arbeitsabstand eine Begrenzung für den abbildbaren Bereich darstellt. Achten Sie darauf, das Gel dicht an der Seite des Embryos abzuschneiden, die Sie der Objektivseite zuwenden werden.Andernfalls bilden Sie nur Gelee und nicht die Embryonen ab. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man Querschnittsbilder von Joseph-Embryonen aufnimmt. Vielen Dank, dass Sie uns zugeschaut haben, und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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