Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

G-Protein-gesteuerte, einwärts gerichtete Kaliumkanäle oder GRK sind wichtig für die Regulation der Erregbarkeit von Neuronen. GKs können sowohl durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), wie beispielsweise den muskarinischen Rezeptor M2R, als auch durch Alkohol aktiviert werden, um die Auswirkungen von Mutationen in der GERK-Alkohol-Bindungsstelle zu untersuchen. Nach ihrer Aktivierung wird eine einzelne Punktmutation mittels gezielter Mutagenese in die GRK-cDNA eingeführt; gereinigte GERK-Konstrukte werden zusammen mit YFP-Konstrukten in Säugerzellen transfiziert, und die Transfektionseffizienz wird mittels Fluoreszenzbildgebung bewertet.

Mithilfe der Ganzzell-Patch-Clamp-Analyse wird anschließend der alkohol- und G-Protein-abhängige Aktivierungsvorgang verglichen. Diese visuelle Experimentdarstellung vermittelt Ihnen wichtige Informationen dazu, wie die Funktion von LY-Kanälen untersucht werden kann. Heute befassen wir uns mit der Frage, wie Alkohol Gruppenkanäle aktiviert.

Die hier gezeigte ortsspezifische Neogenesetechnik kann Einblicke in die Funktion von Ionenkanälen liefern. Diese Technik kann auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen bekannt ist, dass eine Mutation in einem Gen eine menschliche Erkrankung verursacht. Diese dienen als Demonstration, da die Patch-Clamp-Technik an heißen Zellen entscheidend ist, weil viele Schritte Präzision, eine korrekte elektronische Kompensation und Übung erfordern, um verwertbare Daten zu erzeugen.

Die für die Transfektion in diesem Protokoll verwendete DNA wird wie folgt hergestellt. Zunächst wird das GRK-Untereinheit-DNA aus der PCR direkt in das Säugetierexpressionssystem kloniert. Punktmutationen im Plasmid PC DNA 3.1 werden mithilfe entsprechend gestalteter Primer zusammen mit dem Quick-Change-XL-Zwei-Stellen-gerichteten Mutagenesekit eingeführt.

Mithilfe dieses Systems wird eine PCR durchgeführt, bei der das gesamte Plasmid repliziert wird und Punktmutationen, die durch die Primer kodiert sind, eingefügt werden. Nach der PCR werden die replizierten Plasmide mit dem Restriktionsenzym DPN I verdaut und anschließend mittels Hitzeschock in XL10-Gold-ultrakompetente E. coli transformiert. Die transformierten Bakterien werden auf LB-Agarplatten mit Ampicillin kultiviert; Bakterien, die das Plasmid enthalten, sind ampicillinresistent und bilden Kolonien aus.

Die isolierten Kolonien werden entnommen und in Minikulturen vermehrt. Es werden Minipräparationen durchgeführt, um die Plasmid-DNA zu isolieren. Anschließend wird die DNA sequenziert, um erfolgreich transformierte Mutanten zu identifizieren.

E. coli werden in größerer Menge kultiviert und Maxi-Präparationen durchgeführt, um größere Mengen an Plasmid-DNA herzustellen; impfen Sie jeweils etwa 1 × 10⁵ HEC 293T-Zellen in zwei verschiedene Wells einer 12-Well-Platte an, eine für das Mutantengen und eine für die Kontrolle. Inkubieren Sie die Wildtyp-Kanäle bei 37 °C.

Nach acht bis 24 Stunden heften sich die Zellen an ihren Untergrund an und sind bereit für die Transfektion. Transfizieren Sie die Zellen gemäß den Herstelleranweisungen mit Lipo 2000 unter Verwendung von 0,2 Mikrogramm Kanal-cDNA, 0,4 Mikrogramm M2R-Rezeptor-cDNA und 0,04 Mikrogramm YFP-cDNA. Um erfolgreich transfizierte Zellen zu identifizieren, inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.

Nach Ablauf der gewünschten Inkubationszeit die Zellen auf den Objekttisch eines invertierten Fluoreszenzmikroskops geben, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Fluoreszierende und DIC-Bilder vergleichen, um den Prozentsatz transfizierter Zellen zu ermitteln. Die Kulturschale anschließend in den Inkubator zurückbringen.

Reinigen Sie 12 Millimeter große Glasobjektträger und lagern Sie sie bis zur Verwendung in Ethanol. Entfernen Sie den restlichen Ethanol durch Flammen im sterilen Schrank. Legen Sie die Objektträger in eine 24-Loch-Platte und beschichten Sie sie mit 0,2 Milligramm pro Milliliter.

Poly-D-Lysin 24 Stunden nach der Transfektion die Zellen abspalten und 4 × 10³ Zellen pro Vertiefung auf vier bis acht Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit mit Poly-D-Lysin beschichteten Glas-Deckgläsern ausplattieren. Weitere 24 bis 48 Stunden inkubieren, bevor das Ganzzellen-Patch-Clamp-Verfahren durchgeführt wird. Patch-Elektroden mit einem zweistufigen vertikalen Ziehgerät und Borosilikat-Elektroden-Glas herstellen.

Im Idealfall weist die fertige Elektrode einen Widerstand von drei bis sieben Megaohm auf und bedarf keiner weiteren Bearbeitung wie einer Hitzepolitur. Für das Patch-Clamp-Verfahren geben Sie eine Deckglaspräparation mit transfizierten Zellen in eine 35-Millimeter-Schale, die 20 Millimolar Kalium oder 20 K äußere Lösung enthält. Stellen Sie die Schale auf den Objekttisch eines invertierten Fluoreszenzmikroskops.

Die hier verwendete Patch-Clamp-Anordnung arbeitet mit einem Perfusionsystem. Dieses System enthält die extrazellulären Lösungen, die den Zellen zugeführt werden und über Schläuche, die an ein Verteilerstück angeschlossen sind, gravitativ fließen. Jede Lösung wird über ein magnetisch betätigtes Pinzettenventil ferngesteuert geregelt.

Verwenden Sie DIC, um zu fokussieren und Zellen zu finden. Wechseln Sie zum YFP-Filter, um die YFP-positiven Zellen zu lokalisieren. Sobald die YFP-positiven Zellen identifiziert wurden, positionieren Sie die Spitze des Perfusionsystems 20 bis 30 Mikrometer oder zwei bis drei Zelllängen entfernt von der neurofluoreszenten Zelle.

Füllen Sie eine Elektrode mit intrazellulärer Elektrolytlösung. Entfernen Sie mit einer Spritze und einer flexiblen Nadel vorsichtig Luftblasen aus der Elektrodenspitze, indem Sie leicht dagegenklopfen. Befestigen Sie die Elektroden am Kopfverstärker eines AXO Patch 200 B Verstärkers.

Überprüfen Sie erneut, ob die Einstellungen am Verstärker einer Konfiguration entsprechen. Der Ganzzellenschalter ist auf Beta gleich eins eingestellt, und der Tiefpassfilter ist auf 10 Kilohertz eingestellt. Wenden Sie mit der Spritze und der Klemme positiven Druck an, um die Elektroden spitze sauber zu halten.

Verwenden Sie dann einen Mikromanipulator, um die Elektrodenpitze in das Bad zu bringen, und bewegen Sie sie über die Zelle. Schalten Sie den Verstärker in den V-Track-Modus und den Messknopf auf V-Track. Verwenden Sie anschließend das Pipetten-Offset-Potentialmessgerät am Verstärker, um das Pipettenpotential zu nullen, indem Sie die am Messgerät des Verstärkers angezeigte Spannung auf 0,00 bringen.

Wechseln Sie alternativ in den Spannungs-Klemm-Modus am Verstärker und wählen Sie die Testimpuls-Taste, um einen testweisen Spannungsschritt auszulösen. Der rechteckförmige Spannungsschritt erscheint im Dichttest-Fenster der Klemme. Stellen Sie den Pipetten-Offset am Verstärker so ein, dass der Basisstrom auf null Nanoampere eingestellt wird.

Der Dichtigkeitstest zeigt den Elektrodenwiderstand an, der zwischen drei und sieben Megaohm liegen sollte. Schließen Sie danach das Fenster für den Dichtigkeitstest. Wählen Sie im Dropdown-Menü den offenen Erwerbsprotokollmodus aus.

Danach ein gespeichertes Spannungsprotokoll auswählen. Das hier ausgewählte Protokoll wurde vorab so programmiert, dass es alle zwei Sekunden einen einzelnen Spannungsschritt auf minus 100 Millivolt ausführt und dann auf plus 40 Millivolt ansteigt. Dieses Rampenprotokoll ermöglicht die Beobachtung des Umkehrpotentials und der Eigenschaft der inward-gerichteten Rektifizierung von GK-Kanälen.

Für spannungsabhängige Ionenkanäle kann ein rechteckförmiger Spannungsschritt geeigneter sein. Unter Verwendung der Feinjustierung des Mikromanipulators nähern Sie sich der Zelle, lösen den positiven Druck und, nachdem die Zelloberfläche berührt wurde, wird leichter Unterdruck aufgebracht. Überwachen Sie den resultierenden Anstieg des Widerstands im Dichtmess-Test. Sobald der Widerstand im Gigao-Bereich liegt, hat die Elektrode dicht an der Membran abgeschlossen.

Dies wird als Giga-Seal bezeichnet. Unter Verwendung einer Spritze negative Druckimpulse anwenden, um die Membran zu durchbrechen und Zugang zur Zelle zu erhalten. Sobald sich die Aufnahme in der Ganzzell-Konfiguration befindet, zeigt der Dichtetest große kapazitive Ströme an, die als Spitzen oder transiente Signale zu Beginn und am Ende des Tests sichtbar sind.

Puls im Dichtprüftest. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Membrantest. Notieren Sie im Clamp X den Zugangswiderstand und den Membranwiderstand.

Die Membrankapazität in einem Notizbuch überprüfen, indem man die exponentielle Anpassung visuell beurteilt. Die Membrankapazität ist proportional zur Zellgröße und wird verwendet, um die Stromdichtezugriffe zu berechnen. Widerstand und Membranwiderstand dienen dazu, zu beurteilen, ob die Aufzeichnung für eine Fortsetzung geeignet ist.

Eine gute Aufnahme zeichnet sich durch einen niedrigen Zugangswiderstand aus. Schließen Sie nun das Membrantest-Fenster und klicken Sie erneut auf die Taste „Seal test“ im Seal-Test-Fenster. Stellen Sie V_out auf minus 40 Millivolt ein, um die Membrankapazität und den Serienwiderstand am Verstärker zu kompensieren. Schalten Sie die Ganzzellkappe ein und justieren Sie die Ganzzellkappe und den Serienwiderstand mehrmals hin und her, bis der transiente Ausschlag minimiert ist und der Strom eine flache Linie aufweist. Falls erforderlich, stellen Sie die Pipettenkapazität mit dem Fast-Cap-Regler am Verstärker nach.

Zu viel oder zu wenig Kompensation führt zu einer verbleibenden Kapazitätsüberschwingung. Drehen Sie als Nächstes den Prozentsatz-Vorhersage-Regler auf 60 bis 80 % und stellen Sie den Serie-Widerstand der Ganzzellkapazität und die schnelle Kapazität nach Bedarf erneut ein, um eine flache Linie im Dichttest zu erhalten. Schließlich stellen Sie die Prozentkompensation auf etwa 100 %, ohne die Zelle zu oszillieren, und versuchen dabei, den Impuls durch Nachjustierung der Potentiometer für den Serie-Widerstand der Ganzzellkapazität und der schnellen Kapazität so linear wie möglich zu halten.

Nachdem die Widerstands- und Kapazitätskompensation erreicht ist, notieren Sie den eingestellten Wert für den prozentualen Serienwiderstand der Verstärkerkapazität, den Prozentsatz der Kompensationsvorhersage und die Totzeit in einem Laborbuch, schalten Sie das Ventil für die äußere Lösung für die Kontrollbadelektrolytlösung (20 K) ein. Stellen Sie den Tiefpassfilter des Verstärkers auf zwei Kilohertz ein. Beginnen Sie dann mit der Aufnahme der Ströme, indem Sie im Softwareprogramm auf die Schaltfläche „Aufzeichnen“ klicken.

Suchen Sie nach der Eigenschaft der inward-gerichteten Rektifikation des Ger-Stroms. Dies zeigt sich als großer inward gerichteter Strom negativ zum Kaliumumkehrpotential, das durch die Nernst-Gleichung EK bestimmt wird, und als kleiner outward gerichteter Strom positiv zu EK. Nach Aufzeichnung einer stabilen Grundlinie bestimmen Sie die rezeptorvermittelte Aktivierung der Ströme durch Zugabe der extrazellulären Lösung mit 20 K+ Carbachol.

Wenn die maximale Aktivierung beobachtet wird und der Strom den stationären Zustand erreicht hat, wechseln Sie zurück zur K-Bad-Lösung und warten Sie, bis der Basisstromwert erreicht ist. Als Nächstes wird die Alkoholaktivierung von gert-Strömen untersucht. Wechseln Sie zur äußeren Lösung mit 20 K plus 100 Millimolar Ethanol und warten Sie auf die maximale Antwort.

Wechseln Sie dann zurück zur 20-K-Badlösung und warten Sie, bis der Basisstrom erreicht ist. Schließlich wechseln Sie zur 20-K- plus 20-K-Bariumlösung, um die basalen GERT-Ströme zu bestimmen, und warten Sie hier auf die Reaktion. Die Hemmung des GERK-Stroms sollte deutlich sein und während des gesamten Verfahrens bei minus 100 Millivolt am stärksten ausgeprägt sein.

Notieren Sie die Tracenummer, die der Applikation unterschiedlicher extrazellulärer Lösungen entspricht. Eine einzelne Clamp-Fit-Datei enthält alle Traces für das gesamte Experiment. Zur Analyse der GK-Daten verwenden Sie die Clamp-FIT-8.2-Software.

Gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll wurden zwei verschiedene Großaufnahmen von HEC 2 9 3 T-Zellen aufgezeichnet, die entweder Wildtyp- oder mutierte GK-Kanäle exprimierten, und gemäß den Anweisungen in diesem Video analysiert, wie hier für den Wildtyp GK zwei gezeigt. Das Feld auf der linken Seite enthält ein Fenster mit mehreren überlagerten Strömen, die durch das Spannungsrampen-Protokoll in Gegenwart unterschiedlicher Lösungen erzeugt wurden. Beachten Sie die innere Rektifizierung.

Das ist der größere Innenstrom bei minus 100 Millivolt etwa bei 50 Millisekunden auf der Stromspur. Der kleine Auswärtsstrom zwischen null und plus 40 Millivolt etwa bei 200 bis 260 Millisekunden auf der Stromspur stammt von einem endogenen spannungsabhängigen Kaliumkanal. Es ist nicht der Gert-Strom-Cursor.

Einer wird über dem maximalen Innenstrom platziert, und die Cursorwerte werden in die Tabellenkalkulation geschrieben. In der Tabellenkalkulation sind die Spurnummer und der Strom bei minus 100 Millivolt zu sehen.

Die Daten umfassen den Grundstrom, carbacholinduzierte und alkoholisch hervorgerufene Ströme sowie einen durch Barium gehemmten Strom. Ebenso sind die Stromantworten während einer Spannungsrampe in Gegenwart verschiedener Lösungen dargestellt: 20 k plus 100 Millimolar Ethanol oder 20 k plus fünf Millimolar Carbachol oder 20 k plus Barium für den mutierten Kanal L 2 57 w.

Beachten Sie die deutlich kleineren alkohol- und Carbo-Alkohol-induzierten Ströme. Diese Befunde deuten darauf hin, dass dieser Rest eine wichtige Rolle bei der Alkohol- und g-Beta-Gamma-Untereinheiten-vermittelten Öffnung von GK-Kanälen spielt. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Mutation in einem konstruiert und deren Auswirkung auf die Kanalfunktion mithilfe fortschrittlicher elektrophysiologischer Techniken untersucht.

Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann diese ortsspezifische Neogenese-Technik innerhalb von zwei bis drei Tagen durchgeführt und auf fünf oder mehr Mutationen skaliert werden. Die Entwicklung dieser Techniken ebnete den Weg dafür, dass Ionenkanal-Biophysiker grundlegende Eigenschaften der Ionenkanalfunktion und -gating untersuchen konnten. Außerdem ermöglichen sie es Forschern, menschliche Erkrankungen zu untersuchen, die durch eine einzelne Mutation in einem Ionenkanal-Gen verursacht werden.