Name: Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Lernen Sie die Mutagenese und funktionale Analyse von GRK-Ionenkanälen in Säugerzellen. Diese Methode nutzt Patch-Clamp-Elektrophysiologie zur Untersuchung von Punktmutationen und deren Einfluss auf die Kanalaktivierung durch Alkohol.

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Unsere Arbeit wurde durch die finanzielle Unterstützung von McKnight Endowment Fund for Neuroscience (PAS), das National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022; PAS) vom National Institute on Alcohol Abuse und ein Pre-Doc-Stipendium an NIH NRSA PA (F31AA017042) und Alkoholismus. Die GIRK2-L257W Mutante wurde durch Dr. Prafulla Aryal zur Verfügung gestellt. Fluoreszenzmikroskop und Sponsoring freundlicherweise von Leica Instruments zur Verfügung gestellt.

1. Ortsspezifische Mutagenese Wir verwenden Säugetieren Expressionsplasmid pcDNA3.1 Kodierung einer cDNA für GIRK2 und die Einführung einer Punktmutation mit Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II Mutagenese-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Primer-Sequenz kann leicht erzeugt werden mittels Online-Primer-Design-Programm finden Sie unter: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Hinweis: Wir verwenden Standard-Eppendorf 1,5 ml Röhrchen anstelle von BD 14 ml-Röhrchen in das Protokoll beschrieben. Allerdings ist die Verwendung von XL10-Gold ultracompetent E. coli vorbehandelt mit β-Mercaptoethanol, 30s Hitzeschock Zeit und NZY + (oder NZYM +) Medien sind entscheidend für die erfolgreiche Mutagenese. Wenn möglich, kann eine zusätzliche Engineering stille Mutation, die eine neue Restriktionsschnittstelle schafft praktisch sein für das Screening Mutantenkolonien unten. 2. Miniprep, DNA-Sequenzierung und Maxiprep 2,1 Qiagen Miniprep und Sequenzierung. Individuelle Bakterienkolonien werden gepflückt und aufgewachsen in LB-Medium mit Ampicillin (AMP). Wir folgen den Anweisungen des Herstellers für die Reinigung der cDNA. Eine einfache Restriktionsverdau kann bestätigen die erfolgreiche Einführung der Mutation verwendet werden, wenn eine Restriktionsschnittstelle in Schritt 1 oben eingebaut wird. Automatisierte DNA-Sequenzierung ist off-site, getan und ist von wesentlicher Bedeutung, um das Vorhandensein der Mutation in der cDNA zu bestätigen, als auch zu beurteilen, ob es irgendwelche unerwünschte Mutationen. Dieser Schritt ist sehr wichtig. Wir sequenzieren das gesamte GIRK kodierende Sequenz mittels Forward-und Reverse-T7-Promotor BGH Sequenzierungsprimern dass Flanke multiple Klonierungsstelle des pcDNA3.1 Plasmid. Hinweis: Es ist wichtig, sorgfältig zu untersuchen die Sequenzierung Elektropherogramm, um eine ausreichende Qualität der Sequenzierung Daten zu gewährleisten. Hochwertige Elektropherogramm hat scharfe, nicht-überlappenden Peaks mit wenig Hintergrundgeräuschen. 2,2 Qiagen Maxiprep. Wir folgen den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Dieser Schritt ist in unseren Experimenten enthalten, um die Reinheit der cDNA, die wir finden, ist für eine effiziente Transfektion wichtig zu verbessern. 3. Kultur und Transfektion von Zellen HEK293T All diese Schritte sollten in einem sterilen Gewebekultur Haube getan werden. 3,1 Zellkultur HEK293T Zellen sind bequem zu bedienen, weil sie einfach zu Kultur (37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator), haben schnelle Replikation, hohe Transfektionseffizienz und sind zugänglich für whole-cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie. HEK293T Zellen exprimieren SV40 large T Antigen, das episomalen Replikation von Plasmid pcDNA3.1 gewährleistet. HEK293T Zellen werden in DMEM mit niedrigem Glucosegehalt Medien mit L-Glutamin und 10% fötalem Rinderserum (FBS) gezüchtet. Für die Passage Zellen, fügen 0,25% Trypsin / EDTA zu konfluent (90-95%) HEK293T Zellen, warten, bis die Zellen aus dem Gewebe Gericht zu lösen, dann stoppen die Enzymaktivität durch Zugabe von frischem Medium mit FBS /. Platte ~ 1 X 10 5 Zellen / Well in eine 12-Well-Zellkulturschale zusammen mit 1 ml Antibiotika-freien Kulturmedien pro Vertiefung. (1 x 10 5 Zellen ~ 350 ul Zellsuspension aus konfluenten T25-Kolben mit 10 ml Medium resuspendiert erhalten). 3,2 Transfektion Nach 8-24 Uhr, wird HEK-Zellen am Kunststoff haften und sind bereit für die Transfektion. Transfektion von Zellen mit 0,2 ug Kanal cDNA, 0,4 pg M2R-Rezeptor-cDNA und 0,04 pg YFP cDNA mit Invitrogen Lipofectamine 2000. Hinweis: wir verwenden eine kleine Menge von YFP cDNA zu bestimmen, welche Zellen erfolgreich transfiziert (grüne Zellen wird wahrscheinlich enthalten sowohl GIRK Kanäle und M2-Rezeptoren). Die Konzentration der cDNA zu nutzen, müssen Sie für jeden Klon eingestellt werden. 3,3 Fluoreszenz Visualisierung von transfizierten Zellen. Legen Sie 12-Well-Platte auf der Bühne eines invertierten Fluoreszenzmikroskop und untersuchen Zellen für YFP Ausdruck. Vergleichen Sie DIC Bild und notieren Sie die ungefähre Anzahl der grünen Zellen. Dies ermöglicht eine Abschätzung der Transfektionseffizienz. 3.4 Vorbereitung der 24-Well-Schalen und Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläsern Saubere 12 mm Glasdeckgläschen (Warner, CS-12R) durch Schütteln sie über Nacht mit Radiacwash, gefolgt von Waschen mit entionisiertem Wasser und über Nacht unter Schütteln in 95% Ethanol. Bewahren Sie die sauberen Deckgläschen in 70% igem Ethanol bis zur Verwendung. Legen Sie Deckgläser in einer Petrischale mit Ethanol Flamme aus Ethanol mit einer Pinzette und Brenner, eind in eine Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte. Abdeckung jedes Well mit 250 ul von Poly-D-Lysin (PDL)-Lösung [0,2 mg / mL] und lassen Sie die Deckgläser sich über Nacht in PDL-Lösung unter sterilen Haube getaucht. Wickeln Sie den 24-Well-Platte in Parafilm, um Verdunstung zu vermeiden. Am nächsten Morgen, absaugen und waschen PDL 2x mit sterilem Wasser. Lassen Platten offen unter der Haube trocknen, dann decken. Die 24 Well-Schalen mit beschichteten Deckgläser können in mit steriler Aluminiumfolie gewickelt und bei Raumtemperatur gelagert Wochen. 3,5 Plating transfizierten HEK293T Zellen auf dem Deckglas 24 Stunden nach der Transfektion, Teilen von Zellen in 24-Well-Platte (~ 4 X 10 3 Zellen / well) mit Glasdeckgläschen mit Poly-D-Lysin beschichtet. Hinweis: transfizierten Zellen können bis zu 24-72 Stunden nach der Transfektion verwendet werden. Die Zellen werden aufgeteilt auf einzelne Deckgläser für Patch-Clamp-Elektrophysiologie Experiment liefern. 4. Elektrophysiologie 4.1 Vorbereiten Lösungen Extrazelluläre (Bad) Lösung: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES (pH 7,4 eingestellt mit NaOH). Aliquot 20K Badlösung und fügen entsprechende Modulatoren <ul><li> 20K + Ba 2 +: Lösung mit 1 mM BaCl 2: ein spezifischer Inhibitor der inneren Gleichrichtung Ströme </li><li> 20K + Carbachol: Lösung mit 5 uM Carbachol: eine spezifische M2R Agonist; M2R Paare an G-Proteine, die offen GIRK Kanäle </li><li> 20K + Ethanol: Badlösung mit 100 mM EtOH zu GIRK Kanäle direkt aktivieren </li></ul> Ort Bad Lösungen in Spritzen (Lösung Container) von den schnellen Austausch Perfusion System. Hinweis: Wir verwenden ein Warner Quetschventil System, das Bad-Lösungen zu kontrollieren. PE-Schlauch wird empfohlen. Intern / Elektrode-Lösung: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM MgCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4) mit 2,5 mM K 2 ATP und 0,3 uM Li 2 GTP. Wir machen die Elektrode Lösung ohne ATP-und GTP. Wir gesondert vorbereiten Aliquots von ATP und GTP, die bei -80 ° C gelagert werden, und fügen Sie die Elektrode Lösung auf dem Tag des Experiments. Wir halten Spritze mit endgültigen Elektrode Lösung auf Eis, um die ATP / GTP zu bewahren. Wir Sterilfilter (0,2 um) die interne / externe Lösungen für das mikrobielle Wachstum zu hemmen und zu reduzieren Möglichkeit einer Verstopfung der Rohre und der Elektrode. 4,2 Pulling Elektroden Wir verwenden Narishige zweistufigen vertikale Abzieher und Borosilikatglas Elektrode von Warner Instrument (1,5 mm Außendurchmesser, 0,86 mm Innendurchmesser und 7,5 cm Länge), um Elektroden mit 3-7 MOhm Widerstand, wenn sie mit intrazellulären Lösung gefüllt zu erhalten. Hinweis: Es ist notwendig, um experimentell zu bestimmen Parameter für die Elektrode Abzieher und die Art der Elektrode aus Glas in Ihrem Labor. Für unsere vertikale Abzieher, verwenden wir eine Kochstufe von 60,2 für das erste Zug-und ~ 43 für den zweiten Zug. 4,3 Whole-cell Patch-Clamp- <ol><li> Berg Deckglas in einer 35-mm-Schale mit wenig Vaseline, Deckel mit externen Lösung und Ort Schüssel auf der Bühne eines invertierten Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie DIC zu fokussieren und zu finden Zellen, Schalter auf YFP-Fluoreszenz zu YFP-positiven Zellen zu lokalisieren. </li><li> Position Spitze der Perfusion vielfältig in der Nähe einer grünen Zelle (20-30 um aus der Zelle von Interesse = 2-3 Zelllänge abgesehen). </li><li> Fill-Elektroden mit einer Lösung, hängen Sie es an die headstage von Axopatch 200B Verstärker (Axon Instruments) mit den folgenden Voreinstellungen: Gain 1, Konfiguration: whole-cell β = 1, mode V-Klemme. </li><li> Bewerben Überdruck auf der Elektrode zu verhindern das Verstopfen der Pipette, und verwenden Sie den Manipulator Elektrodenspitze knapp oberhalb der Zelle zu platzieren. </li><li> To Zero der Pipette Potenzial, wählen Sie das Seal Test, um eine Prüfspannung Schritt zu liefern. Die 5 mV rechteckförmige Spannung Schritt wird in der Seal-Test Fenster CLAMPEX erscheinen. Passen Sie die Pipette Offset-Potentiometer auf den Verstärker an die Basis-Linie auf 0 nA zu bringen. Alternativ Null der Pipette Potenzial durch Einschalten des Verstärkers Modus-Wahlschalter auf V-Track-Modus und das Messgerät Regler VTrack und verwenden Sie die Pipette Offset-Potentiometer am Verstärker, um die Spannung am Verstärker Meter Anzeige auf "0.00" zu bringen. </li><li> Überprüfen Widerstand der Elektrode mit Dichtheitsprüfung Kommando der CLAMPEX 8.2 Software (sollte 3-7 MOhm sein). </li><li> Öffnen einer gespeicherten Protokoll-Datei oder erstellen Sie ein neues Protokoll. So öffnen Sie Protokoll-Datei aus dem Hauptmenü wählen Sie übernimmt dann Open Protocol und wählen Sie eine gespeicherte Spannung Protokoll-Datei. Für dieses Experiment wurde das Protokoll erstellt, um Membranpotential at-40mV zu halten, liefern eine Einzeldosis von 50 ms Spannung Schritt bis -100 mV und Rampe bis +40 mV über 200 ms. Dieses Protokoll wird alle 2 Sekunden ausgeführt. Die Rampe Protokoll erlaubt die Beobachtung der Umkehr Potenzial und nach innen Nachbesserung GIRK Kanäle. Für Spannung Ionenkanälen kann eine rechteckige Spannung Schritt besser geeignet. </li><li> Anfahrt Zelle mit Feineinstellung des Manipulators, lassen positive Druck, nach dem Berühren der Zelloberfläche gelten Unterdruck und überwachen Erhöhung des Widerstandes in der Seal-Test Oszilloskop-Fenster. Nach Widerstand in der GOhm Bereich ist, hat der Elektrode auf Membran (Gigaseal gebildet hat) abgedichtet. </li><li> Tragen Sie einen Puls von Unterdruck an die Zellmembran zu durchbrechen und erhalten Zugang in die Zelle. Einmal in der whole-cell-Konfiguration, werden Sie kapazitiven Ströme erhöht registrieren. </li><li> Switch to Membrane Test in CLAMPEX und notieren Sie sich den Zugang Widerstand Ra, Membranwiderstand Rm, Membran-Kapazität Cm und überprüfen Sie mit dem Auge die exponentielle Anpassung der theoretischen Kurve der realen kapazitiven Strom. Membrane Kapazität ist proportional zur Größe der Zellen und wird später verwendet werden, um die Stromdichte zu berechnen. </li><li> Wechseln Sie wieder zu testen, legen Sie V-Out (Membranpotential) bis -40 mV und Filter bei 10 kHz Seal </li><li> Ausgleich für Membran-Kapazität und Serienwiderstand am Verstärker mit den folgenden Schritten: <ol class="lalpha"><li> Schalten Sie die gesamte Zelle CAP einschalten. Passen Whole Cell CAP und Serienwiderstand wählt hin und her, bis Sie eine flache Testpuls bekommen. Sie müssen möglicherweise auch Pipette Kapazität FAST CAP Regler einstellen. </li><li> Schalten Sie% PREDICTION Knopf, um etwa 60-80%, wieder re-Einstellung Whole Cell GAP und der Serienwiderstand dial (Sie müssen eventuell Pipette Kapazität Entschädigung FAST CAP-Knopf als auch einstellen). </li><li> Schalten Sie% COMP-zu 100% ohne Oszillieren der Zelle, während er versuchte zu halten den Puls flach durch Neueinstellung Whole Cell CAP und Serienwiderstand (Sie müssen eventuell Pipette Kapazität Entschädigung FAST CAP-Knopf als auch einstellen). Stellen Sie die Verzögerung durch eine Verringerung der Zeit konstant. </li><li> Notieren Sie sich Werte für Cm (Membran-Kapazität), Rs (Vorwiderstand),% COMP, PRED% und Lag Zeit auf den Verstärker in das Notebook gesetzt. Die Cm und Rs sollte etwa die gleiche wie die Cm und Rm in der Membran-Test oben gemessen werden. </li></ol></li><li> Schalten Sie externe Lösung Ventil in die Badlösung Kontrolle. Stellen Sie den Verstärker 8-poligen Bessel-Filter bis 2kHz, öffnen Sie ein Voltage-Clamp-Protokoll und beginnt die Aufnahme Ströme. </li><li> Wir erfassen GIRK Ströme mit einer Rampe Protokoll, das bis -100 mV-Schritten für 50 ms dann Rampen von 100 mV bis +40 mV über 200 ms und ausgeliefert wird alle 2 Sekunden. Die Rampe Protokoll erlaubt die Beobachtung der Umkehr Potential und zur aktiven Korrektur Eigentum GIRK Kanäle. Bei Raumtemperatur (22-25 ° C), die GIRK Strom sollte in der Nähe reverse -50 mV (mit 20 mM KCl in der Badewanne), die in der Nähe der berechneten Gleichgewichtspotential für K (E K = -50 mV) ist, dann bleiben ziemlich flach bei Potentialen positiv zu E K. </li><li> Experimentelles Protokoll: Nach der Aufzeichnung einer stabilen Basislinie, zur Lösung 20K + Carbachol Schalter und warten Höhepunkt Reaktion, wechseln Sie wieder auf 20K Badlösung, dann gelten 20K + Ethanol und warten Peak-Ansprechen, dann 20K Badlösung Schalter, und schließlich 20K + Ba 2 +-Lösung. Während der Anwendung dieser Medikamente sehen Sie Änderungen in der Amplitude GIRK Ströme (die meisten bei -100 mV ausgesprochen). Beachten Sie die Trace-Nummer entsprechend der Anwendung der unterschiedlichen extrazellulären Lösungen in das Notebook. Ein einziger Clampfit Datei enthält alle Sweeps für die gesamte Experiment. </li></ol> 5. Data Analysis Wir verwenden Clampfit 9.2 Software, um Daten GIRK Ströme bei -100 mV zu analysieren. <ol><li> Öffnen Sie die Datei mit der Aufzeichnung, set cursor bei -100 mV. Standardmäßig finden Sie alle Spuren auf dem Bildschirm überlagert. Durch Drücken von "Write-Cursor"-Symbol erstellen Sie Excel-ähnliche Tabellenkalkulation mit numerischen Daten. </li><li> Durch die Zuordnung X, um die Trace-Nummer Spalte und Y, um den Cursor-Spalte und Drücken von "Create Graph"-Symbol schnell zurückgreifen kann eine Zeit-Gänge-Plot des Experiments. </li><li> Berechnen basalen Strom, der durch Subtraktion in Anwesenheit von Ba 2 + Strom aus Strom im externen Perfusionslösung allein ("20K aktuellen" minus "20K + Ba 2 + current") aufgezeichnet. Berechnen induzierten Ströme durch Subtraktion basalen Strom in 20K aus dem aktivierten Ströme ("20K + Carbachol aktuellen" minus "20K aktuellen"; "20K + Ethanol aktuellen" minus "20K current"). Berechnen Sie die Stromdichte (pA / pF), indem der Strom durch Membran Kapazität (direkt aus dem Verstärker eingelesen). Berechnen Prozent Aktivierung, indem induzierten Ströme durch basale Ströme und mit 100 multipliziert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Sie sollten in der Lage sein Datensatz aus Zellen mit Wildtyp-Kanäle transfizierten Strom. Für GIRK Kanälen messend in der extrazellulären Lösung mit 20 mM K + (und 145 mM K + intrazellulären) sollten sie stark nach innen Berichtigung und eine Umkehr Potenzial von ~ -50 mV, die eine wesentliche Eigenschaft von Kalium-Kanälen ist zu zeigen. Die Wildtyp-Strom stark ansteigen auf Carbachol Anwendung (3-5 mal mehr basalen Strom) und reagieren ähnlich wie die 100 mM Ethanol. Hinweis: das Zeichen Konvention für Elektrophysiologie ist, dass nach innen gerichteten Strom negativ ist und nach außen laufenden positiv ist. Für die L257W-Mutation in der Alkohol-Bindungstasche von GIRK2, werden Sie abgeschwächte Reaktionen sowohl Carbachol und Ethanol zu sehen. Dies deutet darauf hin, dass L 257 in Alkohol und G-Protein-Aktivierung GIRK2 Kanäle beteiligt ist. Weitere Beispiele für die Ergebnisse der GIRK2 Mutagenese, siehe jüngste Veröffentlichung von Aryal et al. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Window of Clampfit 8,0 zeigt die Daten-Datei für Wildtyp-GIRK2 Aufnahme. Obere linke Tafel zeigt überlagert fegt in Reaktion auf eine Rampenspannung Protokoll in Gegenwart von verschiedenen externen bah-Lösungen erfasst. Cursor 1 ist bei -100 mV positioniert. Die Cursor-Werte sind, um die Tabelle (rechts) geschrieben. Untere linke Tafel zeigt das Diagramm der Sweep Anzahl vs, Strom. Notieren Sie sich die Zunahme des Stroms (Auslenkung nach unten) mit Ethanol (EtOH) und Carbachol (Carb) und Strom-Hemmung mit Ba 2 +. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Window of Clampfit 8,0 zeigt die Daten-Datei für eine Mutante GIRK2-L257W Aufnahme. Beschreibungen sind die gleichen wie in Abbildung 1. Beachten Sie den Verlust von Carbachol (Carb) Aktivierung und Reduktion von EtOH-induzierte Ströme in der Mutante Kanäle.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

Site-Mutagenese ist ein klassischer Ansatz zur Struktur-Funktions-Beziehungen von Ionenkanälen zu untersuchen. Es beruht auf der Prämisse, dass durch Änderung einer kritischen Rest des Ionenkanals man in der Lage zu ausgeprägten Veränderungen in den Kanal-Funktion zu beobachten beruhen. Im Gegensatz dazu können viele Mutationen in nicht-kritische Position ohne größere Störungen auf den Kanal-Funktion eingeführt werden. Typischerweise wird der Rückstand in Frage zuerst zu Alanin, eine kleine, nicht-polare Aminosäure, die durch Mutation von Tryptophan, der größten der Aminosäuren 2 gefolgt mutiert. Wenn der Rückstand ist wichtig, um den Kanal-Funktion, werden beide Mutationen verändern Kanal Aktivität. Wenn eine weniger wichtige Rest mutiert ist, sind die Auswirkungen der Mutation, vor allem zu Alanin oft unauffällig. Tryptophan-Mutationen sind eher Veränderungen aufgrund sterischer Hindernisse mit dem Tryptophan Größe verbundenen verursachen. Oft kann, wenn die strukturellen Informationen fehlt, systematische Mutation zu Alanin oder Tryptophan in einem Fragment des Kanals (Alanin-oder Tryptophan-Scan) verwendet, um kritische Rückstände zu lokalisieren. Es ist wichtig zu beachten, dass mehrere Klone mit unterschiedlichen Punktmutationen in parallel damit für die Prüfung mehrerer Rückstände innerhalb relativ kurzer Zeit hergestellt werden können. In jüngster Zeit haben mehrere Kristallstrukturen der Kanäle zur Verfügung stehen 3,4,5. Sie können verwendet werden, um mögliche Schlüssel Rückstände getestet mit dem Ansatz in diesem Protokoll beschrieben werden vorzuschlagen. Messungen an Wildtyp-Kanal sollte immer begleiten die Messung eines mutierten Kanal als eine positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass die Transfektion und elektrophysiologischen Experimenten richtig fertig waren dienen. Punktmutationen können mangels eines funktionierenden Strom ein Strom ähnlich dem Wildtyp-oder eine veränderte Regulierung der Kanal-Aktivität führen. Mangelnde messbarer Strom kann durch unsachgemäße Faltung oder verändert Menschenhandel. In einem solchen Fall kann es sinnvoll sein, um herauszufinden, ob der Kanal richtig Verkehre auf der Oberfläche mit einem Biotinylierung Assay oder Immunfluoreszenzfärbung gegen extrazelluläre Tag (ohne Zellpermeabilisierung) zwischen nicht-funktionalen Kanäle auf der Plasmamembran und Kanäle im Inneren der Zelle beibehalten zu unterscheiden . Schließlich ist es ratsam, nicht nur basale Aktivität des Kanals, sondern auch Folgen der Mutation auf dem Kanal Regelung zu untersuchen. Verschiedene Mechanismen der Modulation des Kanals Funktion könnte in Abhängigkeit von den Ionenkanal von Interesse, einschließlich Regulierung durch G-Proteine, PIP2, Ionen, ATP-Konzentration, Phosphorylierung (mit Tyrosin, Serin oder Threonin-Mutation), Ubiquitinierung oder Sumoylierung (mit Lysin Mutation) untersucht werden und direkte Kanalöffner oder Blocker.

<table><tbody><tr><td>Chemikalien</td><td>Sigma</td><td>Variiert</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Präparations-Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin-Hydrobromid</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Poly-L-Lysin kann ebenfalls verwendet werden</td></tr><tr><td>Maxi-Präparations-Kit</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange XL II Kit für gezielte Mutagenese</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>Kapillar-Glasmikropipetten aus Borosilikat – Standardwand</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;Invertiertes Fluoreszenzmikroskop&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophysiologie</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>Jedes invertierte DIC&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;Mikroskop mit Fluoreszenz</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B Verstärker</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionsystem</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Perfusions-MM-6</td><td></td></tr><tr><td>Digitalisierer</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 Digitalisierer</td><td></td></tr><tr><td>Manipulatoren</td><td>Sutter Instruments</td><td>Manipulator: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenzieher</td><td>Narishige</td><td>PC10 vertikaler Elektrodenzieher</td><td></td></tr><tr><td>Isolationstisch</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Lufttisch</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagenese und funktionale analyse von ionenkanälen heterolog in säugerzellen exprimierten

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Wir werden zeigen, wie die funktionalen Auswirkungen der Einführung einer Punktmutation in einem Ionenkanal-Studie. Wir studieren G Protein-gekoppelten innerlich Behebung Kalium (bezeichnet als GIRK) Kanäle, die wichtig sind für die Regelung der Erregbarkeit der Neuronen. Es gibt vier verschiedene Säugetier-GIRK Kanal-Untereinheiten (GIRK1-GIRK4) - konzentrieren wir uns auf GIRK2, weil es ein Homotetramer Formen. Die Stimulation der verschiedenen Typen von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), wie die Muskarin-Rezeptor (M2R), führt zur Aktivierung von GIRK Kanäle. Alkohol auch direkt aktiviert GIRK Kanäle. Wir werden zeigen, wie man eine Aminosäure durch eine gezielte Veränderung eines oder mehrerer Nukleotide in der cDNA für die GIRK Kanal mutieren. Diese mutierte cDNA-Sequenz wird in Bakterien amplifiziert, gereinigt, und das Vorhandensein der Punktmutation wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden. Die cDNAs für die mutierten und Wildtyp-GIRK Kanäle in humanen embryonalen Nierenzellen HEK293T Zellen in vitro kultiviert transfiziert werden. Schließlich wird whole-cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie benutzt, um die makroskopischen Kalium Ströme durch die ektopische Expression eines Wildtyp-oder mutierte GIRK Kanäle zu untersuchen. In diesem Experiment untersuchen wir die Wirkung einer L257W-Mutation in GIRK2 Kanäle auf M2R-abhängig und Alkohol-abhängige Aktivierung.

Wir werden zeigen, wie man die Wirkung einer einzelnen Punktmutation auf die Funktion eines Ionenkanals zu studieren.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

Wir werden demonstrieren, wie die funktionellen Auswirkungen der Einführung einer Punktmutation in einem Ionenkanal untersucht werden. Wir untersuchen G-Protein-gesteuerte, einwärts gleichrichtende ...

G-Protein-gesteuerte, einwärts gerichtete Kaliumkanäle oder GRK sind wichtig für die Regulation der Erregbarkeit von Neuronen. GKs können sowohl durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), wie beispielsweise den muskarinischen Rezeptor M2R, als auch durch Alkohol aktiviert werden, um die Auswirkungen von Mutationen in der GERK-Alkohol-Bindungsstelle zu untersuchen. Nach ihrer Aktivierung wird eine einzelne Punktmutation mittels gezielter Mutagenese in die GRK-cDNA eingeführt; gereinigte GERK-Konstrukte werden zusammen mit YFP-Konstrukten in Säugerzellen transfiziert, und die Transfektionseffizienz wird mittels Fluoreszenzbildgebung bewertet.Mithilfe der Ganzzell-Patch-Clamp-Analyse wird anschließend der alkohol- und G-Protein-abhängige Aktivierungsvorgang verglichen. Diese visuelle Experimentdarstellung vermittelt Ihnen wichtige Informationen dazu, wie die Funktion von LY-Kanälen untersucht werden kann. Heute befassen wir uns mit der Frage, wie Alkohol Gruppenkanäle aktiviert.Die hier gezeigte ortsspezifische Neogenesetechnik kann Einblicke in die Funktion von Ionenkanälen liefern. Diese Technik kann auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen bekannt ist, dass eine Mutation in einem Gen eine menschliche Erkrankung verursacht. Diese dienen als Demonstration, da die Patch-Clamp-Technik an heißen Zellen entscheidend ist, weil viele Schritte Präzision, eine korrekte elektronische Kompensation und Übung erfordern, um verwertbare Daten zu erzeugen.Die für die Transfektion in diesem Protokoll verwendete DNA wird wie folgt hergestellt. Zunächst wird das GRK-Untereinheit-DNA aus der PCR direkt in das Säugetierexpressionssystem kloniert. Punktmutationen im Plasmid PC DNA 3.1 werden mithilfe entsprechend gestalteter Primer zusammen mit dem Quick-Change-XL-Zwei-Stellen-gerichteten Mutagenesekit eingeführt.Mithilfe dieses Systems wird eine PCR durchgeführt, bei der das gesamte Plasmid repliziert wird und Punktmutationen, die durch die Primer kodiert sind, eingefügt werden. Nach der PCR werden die replizierten Plasmide mit dem Restriktionsenzym DPN I verdaut und anschließend mittels Hitzeschock in XL10-Gold-ultrakompetente E. coli transformiert. Die transformierten Bakterien werden auf LB-Agarplatten mit Ampicillin kultiviert; Bakterien, die das Plasmid enthalten, sind ampicillinresistent und bilden Kolonien aus.Die isolierten Kolonien werden entnommen und in Minikulturen vermehrt. Es werden Minipräparationen durchgeführt, um die Plasmid-DNA zu isolieren. Anschließend wird die DNA sequenziert, um erfolgreich transformierte Mutanten zu identifizieren.E. coli werden in größerer Menge kultiviert und Maxi-Präparationen durchgeführt, um größere Mengen an Plasmid-DNA herzustellen; impfen Sie jeweils etwa 1 × 10⁵ HEC 293T-Zellen in zwei verschiedene Wells einer 12-Well-Platte an, eine für das Mutantengen und eine für die Kontrolle. Inkubieren Sie die Wildtyp-Kanäle bei 37 °C.Nach acht bis 24 Stunden heften sich die Zellen an ihren Untergrund an und sind bereit für die Transfektion. Transfizieren Sie die Zellen gemäß den Herstelleranweisungen mit Lipo 2000 unter Verwendung von 0,2 Mikrogramm Kanal-cDNA, 0,4 Mikrogramm M2R-Rezeptor-cDNA und 0,04 Mikrogramm YFP-cDNA. Um erfolgreich transfizierte Zellen zu identifizieren, inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.Nach Ablauf der gewünschten Inkubationszeit die Zellen auf den Objekttisch eines invertierten Fluoreszenzmikroskops geben, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Fluoreszierende und DIC-Bilder vergleichen, um den Prozentsatz transfizierter Zellen zu ermitteln. Die Kulturschale anschließend in den Inkubator zurückbringen.Reinigen Sie 12 Millimeter große Glasobjektträger und lagern Sie sie bis zur Verwendung in Ethanol. Entfernen Sie den restlichen Ethanol durch Flammen im sterilen Schrank. Legen Sie die Objektträger in eine 24-Loch-Platte und beschichten Sie sie mit 0,2 Milligramm pro Milliliter.Poly-D-Lysin 24 Stunden nach der Transfektion die Zellen abspalten und 4 × 10³ Zellen pro Vertiefung auf vier bis acht Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit mit Poly-D-Lysin beschichteten Glas-Deckgläsern ausplattieren. Weitere 24 bis 48 Stunden inkubieren, bevor das Ganzzellen-Patch-Clamp-Verfahren durchgeführt wird. Patch-Elektroden mit einem zweistufigen vertikalen Ziehgerät und Borosilikat-Elektroden-Glas herstellen.Im Idealfall weist die fertige Elektrode einen Widerstand von drei bis sieben Megaohm auf und bedarf keiner weiteren Bearbeitung wie einer Hitzepolitur. Für das Patch-Clamp-Verfahren geben Sie eine Deckglaspräparation mit transfizierten Zellen in eine 35-Millimeter-Schale, die 20 Millimolar Kalium oder 20 K äußere Lösung enthält. Stellen Sie die Schale auf den Objekttisch eines invertierten Fluoreszenzmikroskops.Die hier verwendete Patch-Clamp-Anordnung arbeitet mit einem Perfusionsystem. Dieses System enthält die extrazellulären Lösungen, die den Zellen zugeführt werden und über Schläuche, die an ein Verteilerstück angeschlossen sind, gravitativ fließen. Jede Lösung wird über ein magnetisch betätigtes Pinzettenventil ferngesteuert geregelt.Verwenden Sie DIC, um zu fokussieren und Zellen zu finden. Wechseln Sie zum YFP-Filter, um die YFP-positiven Zellen zu lokalisieren. Sobald die YFP-positiven Zellen identifiziert wurden, positionieren Sie die Spitze des Perfusionsystems 20 bis 30 Mikrometer oder zwei bis drei Zelllängen entfernt von der neurofluoreszenten Zelle.Füllen Sie eine Elektrode mit intrazellulärer Elektrolytlösung. Entfernen Sie mit einer Spritze und einer flexiblen Nadel vorsichtig Luftblasen aus der Elektrodenspitze, indem Sie leicht dagegenklopfen. Befestigen Sie die Elektroden am Kopfverstärker eines AXO Patch 200 B Verstärkers.Überprüfen Sie erneut, ob die Einstellungen am Verstärker einer Konfiguration entsprechen. Der Ganzzellenschalter ist auf Beta gleich eins eingestellt, und der Tiefpassfilter ist auf 10 Kilohertz eingestellt. Wenden Sie mit der Spritze und der Klemme positiven Druck an, um die Elektroden spitze sauber zu halten.Verwenden Sie dann einen Mikromanipulator, um die Elektrodenpitze in das Bad zu bringen, und bewegen Sie sie über die Zelle. Schalten Sie den Verstärker in den V-Track-Modus und den Messknopf auf V-Track. Verwenden Sie anschließend das Pipetten-Offset-Potentialmessgerät am Verstärker, um das Pipettenpotential zu nullen, indem Sie die am Messgerät des Verstärkers angezeigte Spannung auf 0,00 bringen.Wechseln Sie alternativ in den Spannungs-Klemm-Modus am Verstärker und wählen Sie die Testimpuls-Taste, um einen testweisen Spannungsschritt auszulösen. Der rechteckförmige Spannungsschritt erscheint im Dichttest-Fenster der Klemme. Stellen Sie den Pipetten-Offset am Verstärker so ein, dass der Basisstrom auf null Nanoampere eingestellt wird.Der Dichtigkeitstest zeigt den Elektrodenwiderstand an, der zwischen drei und sieben Megaohm liegen sollte. Schließen Sie danach das Fenster für den Dichtigkeitstest. Wählen Sie im Dropdown-Menü den offenen Erwerbsprotokollmodus aus.Danach ein gespeichertes Spannungsprotokoll auswählen. Das hier ausgewählte Protokoll wurde vorab so programmiert, dass es alle zwei Sekunden einen einzelnen Spannungsschritt auf minus 100 Millivolt ausführt und dann auf plus 40 Millivolt ansteigt. Dieses Rampenprotokoll ermöglicht die Beobachtung des Umkehrpotentials und der Eigenschaft der inward-gerichteten Rektifizierung von GK-Kanälen.Für spannungsabhängige Ionenkanäle kann ein rechteckförmiger Spannungsschritt geeigneter sein. Unter Verwendung der Feinjustierung des Mikromanipulators nähern Sie sich der Zelle, lösen den positiven Druck und, nachdem die Zelloberfläche berührt wurde, wird leichter Unterdruck aufgebracht. Überwachen Sie den resultierenden Anstieg des Widerstands im Dichtmess-Test. Sobald der Widerstand im Gigao-Bereich liegt, hat die Elektrode dicht an der Membran abgeschlossen.Dies wird als Giga-Seal bezeichnet. Unter Verwendung einer Spritze negative Druckimpulse anwenden, um die Membran zu durchbrechen und Zugang zur Zelle zu erhalten. Sobald sich die Aufnahme in der Ganzzell-Konfiguration befindet, zeigt der Dichtetest große kapazitive Ströme an, die als Spitzen oder transiente Signale zu Beginn und am Ende des Tests sichtbar sind.Puls im Dichtprüftest. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Membrantest. Notieren Sie im Clamp X den Zugangswiderstand und den Membranwiderstand.Die Membrankapazität in einem Notizbuch überprüfen, indem man die exponentielle Anpassung visuell beurteilt. Die Membrankapazität ist proportional zur Zellgröße und wird verwendet, um die Stromdichtezugriffe zu berechnen. Widerstand und Membranwiderstand dienen dazu, zu beurteilen, ob die Aufzeichnung für eine Fortsetzung geeignet ist.Eine gute Aufnahme zeichnet sich durch einen niedrigen Zugangswiderstand aus. Schließen Sie nun das Membrantest-Fenster und klicken Sie erneut auf die Taste „Seal test“ im Seal-Test-Fenster. Stellen Sie V_out auf minus 40 Millivolt ein, um die Membrankapazität und den Serienwiderstand am Verstärker zu kompensieren. Schalten Sie die Ganzzellkappe ein und justieren Sie die Ganzzellkappe und den Serienwiderstand mehrmals hin und her, bis der transiente Ausschlag minimiert ist und der Strom eine flache Linie aufweist. Falls erforderlich, stellen Sie die Pipettenkapazität mit dem Fast-Cap-Regler am Verstärker nach.Zu viel oder zu wenig Kompensation führt zu einer verbleibenden Kapazitätsüberschwingung. Drehen Sie als Nächstes den Prozentsatz-Vorhersage-Regler auf 60 bis 80 % und stellen Sie den Serie-Widerstand der Ganzzellkapazität und die schnelle Kapazität nach Bedarf erneut ein, um eine flache Linie im Dichttest zu erhalten. Schließlich stellen Sie die Prozentkompensation auf etwa 100 %, ohne die Zelle zu oszillieren, und versuchen dabei, den Impuls durch Nachjustierung der Potentiometer für den Serie-Widerstand der Ganzzellkapazität und der schnellen Kapazität so linear wie möglich zu halten.Nachdem die Widerstands- und Kapazitätskompensation erreicht ist, notieren Sie den eingestellten Wert für den prozentualen Serienwiderstand der Verstärkerkapazität, den Prozentsatz der Kompensationsvorhersage und die Totzeit in einem Laborbuch, schalten Sie das Ventil für die äußere Lösung für die Kontrollbadelektrolytlösung (20 K) ein. Stellen Sie den Tiefpassfilter des Verstärkers auf zwei Kilohertz ein. Beginnen Sie dann mit der Aufnahme der Ströme, indem Sie im Softwareprogramm auf die Schaltfläche „Aufzeichnen“ klicken.Suchen Sie nach der Eigenschaft der inward-gerichteten Rektifikation des Ger-Stroms. Dies zeigt sich als großer inward gerichteter Strom negativ zum Kaliumumkehrpotential, das durch die Nernst-Gleichung EK bestimmt wird, und als kleiner outward gerichteter Strom positiv zu EK. Nach Aufzeichnung einer stabilen Grundlinie bestimmen Sie die rezeptorvermittelte Aktivierung der Ströme durch Zugabe der extrazellulären Lösung mit 20 K+ Carbachol.Wenn die maximale Aktivierung beobachtet wird und der Strom den stationären Zustand erreicht hat, wechseln Sie zurück zur K-Bad-Lösung und warten Sie, bis der Basisstromwert erreicht ist. Als Nächstes wird die Alkoholaktivierung von gert-Strömen untersucht. Wechseln Sie zur äußeren Lösung mit 20 K plus 100 Millimolar Ethanol und warten Sie auf die maximale Antwort.Wechseln Sie dann zurück zur 20-K-Badlösung und warten Sie, bis der Basisstrom erreicht ist. Schließlich wechseln Sie zur 20-K- plus 20-K-Bariumlösung, um die basalen GERT-Ströme zu bestimmen, und warten Sie hier auf die Reaktion. Die Hemmung des GERK-Stroms sollte deutlich sein und während des gesamten Verfahrens bei minus 100 Millivolt am stärksten ausgeprägt sein.Notieren Sie die Tracenummer, die der Applikation unterschiedlicher extrazellulärer Lösungen entspricht. Eine einzelne Clamp-Fit-Datei enthält alle Traces für das gesamte Experiment. Zur Analyse der GK-Daten verwenden Sie die Clamp-FIT-8.2-Software.Gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll wurden zwei verschiedene Großaufnahmen von HEC 2 9 3 T-Zellen aufgezeichnet, die entweder Wildtyp- oder mutierte GK-Kanäle exprimierten, und gemäß den Anweisungen in diesem Video analysiert, wie hier für den Wildtyp GK zwei gezeigt. Das Feld auf der linken Seite enthält ein Fenster mit mehreren überlagerten Strömen, die durch das Spannungsrampen-Protokoll in Gegenwart unterschiedlicher Lösungen erzeugt wurden. Beachten Sie die innere Rektifizierung.Das ist der größere Innenstrom bei minus 100 Millivolt etwa bei 50 Millisekunden auf der Stromspur. Der kleine Auswärtsstrom zwischen null und plus 40 Millivolt etwa bei 200 bis 260 Millisekunden auf der Stromspur stammt von einem endogenen spannungsabhängigen Kaliumkanal. Es ist nicht der Gert-Strom-Cursor.Einer wird über dem maximalen Innenstrom platziert, und die Cursorwerte werden in die Tabellenkalkulation geschrieben. In der Tabellenkalkulation sind die Spurnummer und der Strom bei minus 100 Millivolt zu sehen.Die Daten umfassen den Grundstrom, carbacholinduzierte und alkoholisch hervorgerufene Ströme sowie einen durch Barium gehemmten Strom. Ebenso sind die Stromantworten während einer Spannungsrampe in Gegenwart verschiedener Lösungen dargestellt: 20 k plus 100 Millimolar Ethanol oder 20 k plus fünf Millimolar Carbachol oder 20 k plus Barium für den mutierten Kanal L 2 57 w.Beachten Sie die deutlich kleineren alkohol- und Carbo-Alkohol-induzierten Ströme. Diese Befunde deuten darauf hin, dass dieser Rest eine wichtige Rolle bei der Alkohol- und g-Beta-Gamma-Untereinheiten-vermittelten Öffnung von GK-Kanälen spielt. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Mutation in einem konstruiert und deren Auswirkung auf die Kanalfunktion mithilfe fortschrittlicher elektrophysiologischer Techniken untersucht.Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann diese ortsspezifische Neogenese-Technik innerhalb von zwei bis drei Tagen durchgeführt und auf fünf oder mehr Mutationen skaliert werden. Die Entwicklung dieser Techniken ebnete den Weg dafür, dass Ionenkanal-Biophysiker grundlegende Eigenschaften der Ionenkanalfunktion und -gating untersuchen konnten. Außerdem ermöglichen sie es Forschern, menschliche Erkrankungen zu untersuchen, die durch eine einzelne Mutation in einem Ionenkanal-Gen verursacht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Verfahren zur vollständigen Auflösung des Prototyps spannungsabhängigen Kaliumkanal in Lipid-Membranen beschrieben. Die rekonstituierten Kanäle sind für biochemische Assays, elektrische Aufnahmen, Liganden-Screening und Elektronen kristallographische Untersuchungen geeignet. Diese Methoden können allgemeine Anwendungen auf die strukturelle und funktionelle Studien anderer Membranproteine.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

Der erste Teil dieses Artikels zeigt, wie mutierte Zelllinien ausgewählt werden, die vesikuläre Na+/H+-Austauscher an ihrer Plasmamembran exprimieren. Der zweite Teil enthält Protokolle, die auf intrazellulären pH-Messungen und schneller Ionenaufnahme basieren und zur Bestimmung der Ionenselektivität und der kinetischen Parameter dieser Austauscher verwendet werden.

Funktionelle Charakterisierung von Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Ererbten Arrhythmien werden häufig durch Mutationen verursacht, die die Oberfläche Lieferung eines oder mehrerer Ionenkanäle verändern. Hier passen wir die Durchflusszytometrie-Assays eine Quantifizierung der relativen Gesamt und Zelloberflächenproteinexpression von rekombinanten Ionenkanäle in tsa-201-Zellen exprimiert zu liefern.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl– Kanäle aktiviert.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.

Ein fluoreszenzbasierter Assay des Membranpotentials zur Hochdurchsatz-Funktionsuntersuchung zweier endogener Ionenkanäle in zwei Epithelzelllinien

Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Lernen Sie die Mutagenese und funktionale Analyse von GRK-Ionenkanälen in Säugerzellen. Diese Methode nutzt Patch-Clamp-Elektrophysiologie zur Untersuchung von Punktmutationen und deren Einfluss auf die Kanalaktivierung durch Alkohol.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

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