Name: Strategies for Study of Neuroprotektion von Cold-Vorkonditionierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Methode der kalten Vorkonditionierung zur Untersuchung neuroprotektiver Mechanismen in Hippocampus-Schnittkulturen von Ratten. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse zytokinvermittelter Signalwege.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS-19108), die Migräne Research Foundation und das Weiße Stiftung Richard P. Kraig finanziert. Frau Marcia P. Kraig in Herstellung von Nährmedien und Wartung von Slice Kulturen unterstützt. Wir bedanken uns bei Yelena Grinberg für ihre Kommentare und Revisionen auf eine endgültige Version dieses Artikels.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

Zwei grundlegend wichtige Konzepte wichtig, Abgrenzung der Cytokine Signaling System in kalt-Vorkonditionierung Neuroprotektion beteiligt sind in Abb. 6 und 7 dargestellt. Erstens sind Zytokine extrem niedrigen Konzentration Signalmoleküle im normalen Gehirn. Dennoch haben physiologische Zytokin-Konzentration ändert ein immenses Potenzial zur Hirnstruktur und-funktion (dh Phänotyp) wegen ihrer Fähigkeit, die Genexpression verändern (Abbildung 6) zu ändern. Darüber hinaus sind Zytokine hochredundanten und pleiotrope in die mehrere Zytokine können ähnliche Effekte und ein einzelnes Zytokin variable Effekte (Abbildung 7) haben können. So muss sich genau feststellen das angeborene Zytokin-Basen zur Neuroprotektion vor Kälte-Vorkonditionierung (oder anderen physiologischen Vorkonditionierung Stimuli), Composite-Analyse der damit zusammenhängenden Signalisierung Variablen bestimmt werden. Dies geschieht über Multiplex-Assay-Strategien durchgeführt. Dies wird zunächst der Zytokin "Signatur" kalt-Vorkonditionierung Neuroprotektion. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Power of Cytokine Signaling Gehirn. Die Abbildungen vermitteln die immense Signalwirkung von physiologischen Konzentrationen von Gehirn Zytokine im Vergleich zu den Konzentrationen anderer allgemein anerkannten Kollegen. Konzentration ist als der Kehrwert der Entfernung dargestellt, beginnend mit einer einzigen Katze Whisker als Bezugspunkt. Natrium (10 -1 M durch ein Körnchen Pfeffer dargestellt) und Kalium (10 -3 M durch eine Tomate dargestellt) sind in den interstitiellen Raum des Gehirns auf einem Niveau von rund 150 und 3 mm, bzw., und haben allgemein anerkannten Rollen in neurale Zellen elektrophysiologische Funktion. Auch pH-Wert (dh ~ 10 -7 M Ebenen der Wasserstoff-Ionen und illustriert, wie 780 Meter entlang Chicagos Seeufer) und Kalzium (dh ~ 10 -8 M Ebenen dargestellt als 7,8 km von einem Satelliten Google Bild entlang Chicagos Seeufer von McCormick gesehen Place to Promontory Point in Hyde Park in der Nähe der University of Chicago). Darüber hinaus beeinflussen Neurotransmitter freigesetzt interstitiellen Raum über diese Konzentrationen lokalen Hirnregion Aktivität. Im Gegensatz dazu können Zytokine (gezeigt als der Abstand von der Erde zum Mars) verändern Hirnfunktionen bei Konzentrationen mehr als 10 Millionen Mal weniger. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Interactive Signalisierung von angeborenen Zytokin Wege. Zytokine sind hoch redundant und pleiotrope in die mehrere Zytokine können ähnliche Effekte und einem Zytokin kann mit unterschiedlichen Auswirkungen. Diese Vielfalt resultiert aus komplexen interaktiven signalisiert, dass auf der Ebene der Liganden, Rezeptoren und Phosphoproteine ​​auftritt. Weitere Komplexität resultiert aus der Tatsache, dass Gehirn von verschiedenen Zelltypen, wobei jede Lage von Zell-spezifische angeborene Zytokin, Rezeptor und die damit verbundenen Phosphoprotein Veränderungen besteht. Zur Veranschaulichung hier sind nur angeborene Zytokin-Signalwege (abgeleitet von Immunzellen Studien) gezeigt. Der Einfachheit halber wird das Gehirn als eine einzelne Zelle (weiße Linie) zeigt die mögliche Wechselwirkungen für angeborene Zytokine (IL-1α und IL-1β (hier bezeichnet als IL-1α / β), TNF-α, IL-6 gezogen, IFN-γ und IL-10), Rezeptoren (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR und IL-10R) und Phosphoproteine ​​(dh Kinasen ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) und JNK) und Transkriptionsfaktoren (ATF-2, NFKB und STAT3). Zum Beispiel, TNF-α-Signale via TNFR1 auf JNK, p38-MAPK und ERK1 / 2, die die Genexpression auslöst via ATF-2. TNF-α verändert auch die Genexpression direkt durch NFKB Aktivierung. Gemeinsam Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren evozieren erhöht (Pfeil) und zurück (blunt end) Expression von Zytokinen und deren Rezeptoren wie angegeben. Wichtig ist, zeigen diese Wege, die Änderungen in einem Zytokin (zB TNF-α) beeinflussen die Produktion von anderen (zB IL-1β) Zytokine. So muss sich genau feststellen das Zytokin-Basen zur Neuroprotektion vor Kälte-Vorkonditionierung, Composite Analyse der damit zusammenhängenden Signalisierung Variablen bestimmt werden. Dies wird zunächst der angeborenen Zytokin "Signatur" kalt-Vorkonditionierung. (Das Bild wurde aus Daten von Referenz Nr. 25 zusammengestellt.)

Vorbereitung der Scheiben Kulturen <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Millicell-CM Zellkultureinsätze (30 mm) </td><td> Thermo Fisher </td><td> PICM0-3050 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle </td><td> Invitrogen </td><td> 21010 </td><td></td></tr><tr><td> Earle s Balanced Salt Solution </td><td> Sigma </td><td> E2888 </td><td></td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15295 </td><td></td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> BSL-1 Dunstabzug </td><td> Bäcker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> McIlwain Gewebe Chopper </td><td> Brinkmann </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Teflonscheiben </td><td> Brinkmann </td><td> 023-49-310-1 </td><td></td></tr><tr><td> Spachtel </td><td> Thermo Fisher </td><td> 14 bis 373-25A </td><td></td></tr><tr><td> Curved Iris Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 14091-09 </td><td></td></tr><tr><td> Lange, gerade Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 14002-14 </td><td></td></tr><tr><td> Lange Pinzette </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-40 </td><td></td></tr><tr><td> Abgewinkelt Pinzette </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11808-02 </td><td></td></tr><tr><td> Short Zange </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-38 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Inox Pinzette </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Iris spatulae </td><td> Feine Science Tools </td><td> 10094-13 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 15 mm Petrischalen </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-757-148 </td><td></td></tr><tr><td> 60 x 15 mm Petrischalen </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08 bis 757-100B </td><td></td></tr><tr><td> Wilde M8 Stereomikroskop </td><td> Wild Heerbrugg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gey s Balance Salzlösung </td><td> Sigma </td><td> G9779 </td><td></td></tr><tr><td> Blak-Ray kurzwellige ultraviolette messend </td><td> UVP </td><td> J-225 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well Falcon Kulturschalen </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08 bis 772-1B </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103</td><td></td></tr><tr><td> B27 ergänzen </td><td> Invitrogen </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> Gem21 Neuroplex </td><td> Zwilling Bioproducts </td><td> 400-160-010 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2-Analyzer </td><td> Bacharach </td><td> # 2820 </td><td></td></tr></tbody></table> Pre-Screening für Vitality von Slice Kulturen <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Sytox Grün </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td></td></tr><tr><td> DMIBRE inversen Mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Cold-Vorkonditionierung <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> BSL-2 Dunstabzug </td><td> NuAire </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Exzitotoxische Injury <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> CoolSnap fx-CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoroscein </td><td> Invitrogen </td><td> F36915 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph Software </td><td> Molecular Devices </td><td> v. 7.5.04 </td><td></td></tr><tr><td> 100 pm tief Hämazytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> N-Methyl-D-Aspartat </td><td> Calbiochem </td><td> 454575 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaStat Software </td><td> Systat Software Inc. </td><td> v. 3.5 </td><td></td></tr></tbody></table> Co-Behandlungen mit Cold-Vorkonditionierung angewendet <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> sTNFR1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 425-R1-050 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA Isolation <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RNal ater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Micro RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74004 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Fischer </td><td> 03446-100 </td><td></td></tr><tr><td> Diposable 1,5 RNAse-freie Pestle </td><td> South Jersey Precision Werkzeug-und Formenbau, Inc. </td><td> 749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N261A </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl] aminomethan </td><td> Sigma </td><td> T3069 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-Hydrat </td><td> Sigma </td><td> # E7889 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA Quantifizierung <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RiboGreen Assay </td><td> Invitrogen </td><td> R11491 </td><td></td></tr><tr><td> Hefe tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Zentrifugenröhrchen </td><td> USA Scientific </td><td> 16155500 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well fluoreszierenden Testplatte </td><td> Nunc </td><td> DK-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-Platte fluoreszierenden Lesegerät </td><td> Tecan </td><td> Safire II </td><td></td></tr></tbody></table> Quantitative PCR <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> iScript Reverse Transkription-Kit </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8891 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7563 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq-Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> RNA UltraSense 11732-927 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler Thermocycler </td><td> Bio-Rad </td><td> iCycler Optische Module </td><td></td></tr><tr><td> iCycler System-Software </td><td> Bio-Rad </td><td> V. 3.1 </td><td></td></tr></tbody></table> Quantitative PCR für Microarrays <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RNase AWAY </td><td> Molecular BioProducts </td><td> # 7000 </td><td></td></tr><tr><td> RT 2 First Strand Kit </td><td> SABiosciences </td><td> C-03 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green-basierten PCR-Mix </td><td> SABiosciences </td><td> PA-011 </td><td> Spezifisch für iCycler </td></tr><tr><td> RT 2 Profiler PCR Array </td><td> SABiosciences </td><td> PARn-011A </td><td></td></tr></tbody></table> Proteomic Assay <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog/ Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Zell-Lyse-Kit </td><td> Bio-Rad </td><td> 171-304011 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> Fisher Scientific </td><td> Micro 7 </td><td></td></tr><tr><td> BSA-Protein Lager </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0007 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> Immuno 96 MicroWell Platten </td><td> Nunc </td><td> 449824 </td><td></td></tr><tr><td> Dichtband </td><td> Bio-Rad </td><td> 2239444 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-Platten-Lesegerät </td><td> Perkin Elmer </td><td> 1420-mulilabel Zähler </td><td></td></tr><tr><td> Bioplex Rat TNF-α Cytokinassay </td><td> Bio-Rad </td><td> X0000001T </td><td></td></tr></tbody></table> Immunfärbung <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog / Modellnummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> Alfa Aesar </td><td> 43368 </td><td></td></tr><tr><td> Lysin </td><td> Sigma </td><td> L-6001 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumphosphat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374-1 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumperiodat </td><td> Sigma </td><td> S-1878 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma </td><td> S-2002 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid (30%) </td><td> Sigma </td><td> H1009 </td><td></td></tr><tr><td> Ziegenserum </td><td> Colorado Serum Unternehmen </td><td> CS 0920 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T-8787 </td><td></td></tr><tr><td> Färbeschalen </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 14511 </td><td></td></tr><tr><td> Plattenschüttler </td><td> Lab-Line Instruments, Inc. </td><td> 3520 </td><td></td></tr><tr><td> Nr. 1 Filtrierpapiere (185 mm) </td><td> Whatman </td><td> 1001-185 </td><td></td></tr><tr><td> 3,3-Diaminobenzidin </td><td> Sigma </td><td> D8001 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xylol </td><td> Fisher Scientific </td><td> X3S-4 </td><td></td></tr><tr><td> Permount Eindeckmittel </td><td> Fisher Scientific </td><td> SP15-100 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> cm 3 050 S </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 27050 </td><td></td></tr><tr><td> Fine-Spitze Pinsel </td><td> Ted Pella </td><td> 11806 </td><td></td></tr><tr><td> PAP blockiert Stift </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> SFX-Signal Enhancer </td><td> Invitrogen </td><td> A31631 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

strategies for study of neuroprotektion von cold-vorkonditionierung

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurologische Verletzungen ist eine häufige Ursache von Morbidität und Mortalität von Narkose und chirurgischen Prozedere, dass durch die Entwicklung wirksamer gelindert werden könnte, einfach zu verwalten und sicher Vorkonditionierung Behandlungen. Wir versuchen, die neuronalen Immunsystems Signalisierung für Kälte-Vorkonditionierung als Mittel, um neue Targets für therapeutische Entwicklung zu identifizieren, um Gehirn vor Verletzungen schützen Beginn zu definieren. Low-Level-pro-inflammatorischen Mediators Änderungen der Signalgebung im Laufe der Zeit sind für Kalt-Vorkonditionierung Neuroprotektion unerlässlich. Diese Signalisierung ist im Einklang mit den Grundprinzipien der physiologischen Klimaanlage hormesis, was bedeutet, dass irritative Reize einen Schwellenwert Größenordnung erreichen mit genügend Zeit zur Anpassung an die Reize für den Schutz sichtbar zu machen müssen. Dementsprechend erfordert Abgrenzung des Immunsystems Signalisierung in kalt-Vorkonditionierung Neuroprotektion beteiligt, dass biologische Systeme und experimentelle Manipulationen und technischen Kapazitäten sind sehr gut reproduzierbar und empfindlich. Unser Ansatz ist es, Hippocampus Scheibe Kulturen als den Einsatz in vitro Modell, das sich eng an ihre in-vivo-Pendants mit Multi-synaptischen neuronale Netze von reifen und ruhenden macroglia / Mikroglia beeinflusst. Diese Gliazellen Zustand ist besonders wichtig für Mikroglia, da sie die wichtigste Quelle von Zytokinen, die wirksam sind in der Femtomolbereich sind. Auch, Slice Kulturen in vitro kann für mehrere Wochen aufrechterhalten werden, was genügend Zeit, um die Aktivierung Reize hervorrufen und zu bewerten adaptive Reaktionen. Schließlich können Umgebungsbedingungen genau kontrolliert werden mit slice Kulturen, so dass Cytokine Signaling von Kalt-Vorkonditionierung kann gemessen werden, nachgeahmt werden, und moduliert werden, um den kritischen Knoten Aspekte zu sezieren. Cytokine Signaling System analysiert erfordern den Einsatz von empfindlichen und reproduzierbaren Multiplex-Techniken. Wir verwenden quantitative PCR für TNF-α zum Screening auf Mikroglia-Aktivierung durch quantitative real-time qPCR Array-Screening, um Gewebe-weiten Zytokin Veränderungen zu bewerten gefolgt. Letzteres ist eine sehr sensitive und reproduzierbare Mittel, um mehrere Zytokin-Systems zu messen Änderungen der Signalgebung gleichzeitig. Wesentliche Änderungen sind mit gezielten qPCR und dann Proteindetektion bestätigt. Wir Sonde für die Gewebe-basierte Zytokin-Protein Veränderungen mit Multiplex-Mikrosphären durchflusszytometrischen Assays unter Verwendung von Luminex-Technologie. Cell-spezifischen Zytokin-Produktion ist mit Doppel-label Immunhistochemie bestimmt. Zusammengenommen können diese Hirngewebe Vorbereitung und Stil zu verwenden, gekoppelt an die vorgeschlagenen investigative Strategien, die optimale Vorgehensweise zur Identifizierung potentieller Ziele für die Entwicklung neuartiger Therapeutika, die die Vorteile von Kälte-Präkonditionierung imitieren konnte.

Wir versuchen, die neuronalen Immunsystems Signalisierung für Kälte-Vorkonditionierung als Mittel, um neue Targets für therapeutische Entwicklung zu identifizieren, um Gehirn vor Verletzungen schützen Beginn zu definieren. Wir präsentieren Strategien für solche Arbeiten, die biologische Systeme, experimentelle Manipulationen sowie technische Fähigkeiten, die in hohem Maße reproduzierbar und empfindlich sind, erfordern.

Strategies for Study of Neuroprotektion von Cold-Vorkonditionierung

Neurologische Verletzungen sind eine häufige Ursache für Morbidität und Mortalität infolge von Allgemeinanästhesien und damit verbundenen chirurgischen Eingriffen, die durch ... gemindert werden könnten.

Neurologische Verletzungen sind eine häufige Ursache für Morbidität und Mortalität unter Vollnarkose. Das Ziel der in diesem Video vorgestellten Arbeit besteht darin, den Einfluss einer Kälte-Präkonditionierung auf die neuronale Immunsignalkette bei Ratten zu untersuchen, um neuartige therapeutische Ansatzpunkte zum Schutz des Gehirns vor Eintritt der Verletzung zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem gesunde und lang lebende Hippocampus-Schnittkulturen von erwachsenen Ratten hergestellt werden.Die Kulturen werden einer Kälte-Vorbehandlung ausgesetzt, um eine immunbasierte Neuroprotektion zu induzieren. Anschließend wird Anci-Toxin hinzugefügt, und die Schnittkulturen werden abgebildet. Die Bildanalyse legt nahe, dass die Kälte-Vorbehandlung zu einer drastischen Verringerung des Ausmaßes des selektiven neuronalen Zellverlusts führt.Mein Name ist Richard Craig, und dies ist Heidi Mitchell. Wir stammen von der Universität Chicago, Abteilung für Neurologie, und heute werden wir Ihnen beschreiben, wie die Schnittkulturpräparation genutzt werden kann, um Fragen zur Neuroprotektion im Zusammenhang mit schwachen proinflammatorischen Immunsignalen als Mittel, das Gehirn widerstandsfähiger gegenüber Gehirnerkrankungen zu machen, zu beantworten. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in diesem Verfahren sind, Schwierigkeiten, da sichergestellt werden muss, dass die Kulturen langfristig vital und gesund bleiben und in der Lage sind, schwache proinflammatorische Signalvorgänge anzuzeigen.Heidi wird Ihnen nun eine Reihe von Verfahren zeigen, die wir im Labor anwenden, um diese Hürden zu überwinden, sodass eine schwache proinflammatorische Signalübertragung als Ansatzpunkt zur Entwicklung von Neuroprotektiva für das Gehirn gemessen werden kann. Die folgenden Experimente sollten in einem sauberen Laborkittel und sterilen Handschuhen, die über die Kittelärmel gezogen sind, durchgeführt werden. Beginnen Sie damit, alle für den Eingriff benötigten Gegenstände in einer BSL-Stufe-1-Laminar-Flow-Werkbank zu platzieren, einschließlich einer McIlwain-Gewebehackmaschine mit zugehörigen Teflon-Einsätzen, einer Rasierklinge, chirurgischen Instrumenten und Petrischalen für die Dissektion.Die Haube sollte sich in einem nach HIPAA-Richtlinien gefilterten Kulturraum mit Überdruck befinden, in dem die Luft mindestens 30 Minuten vor Versuchsbeginn durch eigenständige Luftreinigungsventilatoren mit UV-Licht gereinigt wird. Stellen Sie eine Kühlplatte für die Dissektion in die Haube und schließen Sie sie an ein nahegelegenes Wasserbad in der Zellkulturhaube an. Geben Sie einen Millizell-Insert in jedes Loch einer 6-Loch-Platte und fügen Sie 1,1 Milliliter Kulturmedium hinzu. Stellen Sie die Schale in einen Inkubator bei 36 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit für mindestens 20 Minuten. Halten Sie die Rattenwelpen warm, bis sie benötigt werden, indem Sie sie unter eine Wärmelampe legen. Betäuben Sie den Welpen, indem Sie ihn in 100 % Kohlendioxid platzieren. Sobald der Welpe betäubt ist, tauchen Sie ihn in 100 % Ethanol, trennen dann den Kopf ab und legen den Körper in eine 100-Millimeter-Petri-Schale und den Kopf in eine andere.Verwenden Sie anschließend gebogene Iris-Scheren, um den Schädel mit einem medianen Schnitt und zwei seitlichen Schnitten links und rechts hinter den Augen zu öffnen. Benutzen Sie gekröpfte Pinzetten, um den überliegenden Schädel zurückzuklappen, und einen Spatel, um mit dem Herausheben des Gehirns zu beginnen. Entfernen Sie das Gehirn, indem Sie die Nervus-trigeminus-Aste mit dem Spatel durchtrennen, und legen Sie das Gehirn in die untere Hälfte einer 60-Millimeter-Petri-Schale, die 10 Milliliter sterile, kalte, mit Glukose angereicherte Gaze-balancierte Salzlösung enthält.Verwenden Sie anschließend die Nummer fünf IOx-Präparierzange unter einer Nummer zwei Iris-Spatel, um die Hippocampi aus jeder Hemisphäre zu isolieren, und legen Sie sie zur Verwendung mit dem McIlwain-Schneider auf eine Teflonplatte. Verteilen Sie mit der Spatel das Medium von dem Gehirngewebe weg und schneiden Sie die Hippocampi mit dem Schneidegerät bei einer Schnittdicke von 350 bis 400 Mikrometern. Schneiden Sie die Hippocampi mit einem Ein-Milliliter-Perpet rasch senkrecht zu ihrer Längsachse. Spülen Sie die frisch geschnittenen Schnitte von den Teflon-Einlagen ab und in die obere Hälfte einer 60-Millimeter-Petri-Schale, die kalte gaze BSS enthält. Legen Sie die Schnitte unter ein Stereomikroskop und untersuchen Sie sie. Identifizieren Sie alle Schnitte, die einen intakten Gyrus dentatus und eine parametrale Zellschicht aufweisen.Platzieren Sie anschließend vorsichtig die drei größten Schnitte auf einem Insert und bereiten insgesamt 12 Schnitte pro Probe vor. Stellen Sie die Inserts in ein Sechs-Loch-Tablett und inkubieren Sie bei 36 Grad Celsius, wobei alle drei bis vier Tage das Wachstumsmedium erneuert wird. Ersetzen Sie dazu das alte Medium durch frisches, warmes Medium.Bringen Sie die Zellen nach sieben Tagen in den 36-Grad-Inkubator zurück. Ersetzen Sie das Medium durch 1,1 Milliliter serumfreies, ergänztes Neurobasal-Medium. Untersuchen Sie am Tag 18 die Vitalität der Schnittkulturen.Beginnen Sie damit, 1,1 Milliliter Ox Poel in sechs-Well-Kulturschalen zu geben. Stellen Sie die Schale in den Inkubator, um sie auf 36 Grad Celsius aufzuwärmen. In der Zwischenzeit schalten Sie eine fluoreszierende Lichtquelle mit einem Fitzy-Filter für das Mikroskop ein und lassen Sie sie mindestens 20 Minuten lang aufwärmen.Dies gewährleistet eine gleichmäßige Lichtintensität. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Schnittkultur-Einlagen 10 Minuten lang in das inox-Medium zu geben. Danach überführen Sie sie zurück in das SIM-Freimedium.Platzieren Sie den Kultur-Insert auf dem Mikroskoptisch und markieren Sie die Orientierung, um irreversiblen Schäden an einer parametralen Schicht zu erkennen. Stellen Sie die Kulturen auf einer sterilen Oberfläche eines invertierten Mikroskops unter fünfmaliger Vergr&ouml;&szlig;erung bereit, wobei die Schnitte in einer &auml;hnlichen Orientierung wie bei der Vorscreening-Untersuchung gehalten werden.Wechseln Sie zum FIT CX-Emissionsfilterwürfel. Wählen Sie Kulturen aus, die weniger als 30 cytx-positive Zellen im ca.-Bereich aufweisen, für die Kälte-Präkonditionierung. Geben Sie 1,1 Milliliter serumfreies Medium in eine sechswellige Kulturschale und stellen Sie die Schale für mindestens 20 Minuten in einen 30-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit, um das Medium nach Ablauf der 20 Minuten zu equilibrieren.Entfernen Sie das Equilibriermedium aus dem Inkubator. Überführen Sie die Kulturinserts mit den Schnitten vom normalen serumfreien Medium in das 30-Grad-Medium. Anschließend stellen Sie sie nach der Inkubation 90 Minuten lang in die 30-Grad-Inkubator.Bringen Sie die Gewebeschnittdirte zurück in das normale serumfreie Medium und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 36 Grad. Beginnen Sie die Vorscreening-Phase für den experimentellen Einsatz der Gewebeschnittdirte, indem Sie die Kulturinserts 20 Minuten lang in das Cyt-Medium überführen. Während die Schnitte inkubieren, schalten Sie die Ultraviolett-Lampe und eine CCD-Kamera ein und lassen Sie diese 20 Minuten lang aufwärmen.Falls erforderlich, reinigen Sie den CCD-Sensor mithilfe der Software, indem Sie ihn 50 Zyklen lang dem Licht aussetzen. Geben Sie dann eine Pepeta-Lösung aus 10 Mikrolitern Fluorescein in 90 Mikrolitern PBS auf ein 100 Mikrometer tiefes Hämocytometer und platzieren Sie dieses auf dem Mikroskopständer. Passen Sie mithilfe der Software die Belichtungszeit so an, dass der Dynamikbereich 1000 von 4.096 beträgt.Als Nächstes stellen Sie die Schale mit kalten präkonditionierten Gewebeschnitten auf das Mikroskop und nehmen Bilder auf. Diese werden verwendet, um das Hintergrundfluoreszenzniveau zu bestimmen, das von der Fluoreszenz der verletzten Schnitte abgezogen wird. Falls die Kältepräkonditionierung selbst Zellen verletzt hat, werden im Anschluss Zellen mit erhöhter Fluoreszenz sichtbar sein.Um die Wirkung einer exotoxischen Schädigung zu untersuchen, überführen Sie die Inserts in serumfreies Medium, das 20 bis 50 Mikromolar und MDA enthält und mindestens 20 Minuten lang auf 36 Grad Celsius temperiert wurde. Inkubieren Sie 60 Minuten bei 36 Grad Celsius; NMDA ahmt nach der Inkubation die Wirkung des Neurotransmitters Glutamat nach. Spülen Sie das NMDA von den Inserts ab, indem Sie jeden Insert dreimal in drei getrennten 60-Millimeter-Schalen eintauchen.Jeweils mit 10 Milliliter neurobasalem Medium, das auf 36 Grad Celsius erwärmt wurde. Verwenden Sie nicht mehr als drei Inserts pro Satz von 360 Millimeter-Waschschalen. Nach dem Waschen legen Sie die Inserts in eine Schale mit frischem Medium und stellen sie in den 36-Grad-Inkubator zurück.Nach 24 Stunden kalibrieren Sie die Kamera wie zuvor mit einem Fluorescein-Standard. Danach bringen Sie die Kulturen für 20 Minuten in OX-Medien, bevor Sie Bilder aufnehmen. Wenn die Verletzungsgrade einen Tag nach der Verletzung gering sind, verlängern Sie das Experiment nach Bedarf auf zwei bis drei Tage, um die Verletzung mithilfe der Metamorph-Software zu quantifizieren.Definieren Sie einen interessierenden Bereich um die CA1-Region, um die Intensität einer ausgewählten Region für die Verletzung zu messen. Kopieren und fügen Sie den interessierenden Bereich von der Verletzung in das Hintergrundbild ein. Geben Sie anschließend die Werte aus der Verletzung und dem Hintergrund in Excel mithilfe statistischer Software ein.Quantifizieren Sie den Zähler minus Hintergrund für Kontroll- und kalte präkonditionierte Kulturen, und führen Sie den geeigneten statistischen Test durch, um die Schädigung in der experimentellen Gruppe mit der Kontrollgruppe zu vergleichen, die stets in jedem experimentellen Durchlauf enthalten sein sollte. Dieses Bild zeigt eine typische Färbung einer ausgereiften hippokampalen Schnittkultur nach 21 Tagen Kultur in vitro. Die in Grün dargestellte neue Endmarkierung dient zur Veranschaulichung der Zytarchitektur der Hauptneurone.Parametale Neurone sind in den Bereichen CA1 und CA3 des Hippocampus sowie Dentategyrus zu sehen, oder DG-Neurone sind hier links zu erkennen. Der Bereich CA1 in höherer Vergr&ouml;&szlig;erung zeigt die verzweigte Morphologie ruhender Mikrogliazellen. In reifen Schnittkulturen wurden die Zellen mit dem Oberfl&auml;chenmarker f&uuml;r Mikrogliazellen, CD11b, markiert. Diese Abbildung zeigt die Effekte einer K&auml;ltevorbehandlung, der neuroprotektiven Wirkung und Hippocampale Schnittkulturen, die mit dem Cytx Green Marker f&uuml;r tote Zellen inkubiert wurden.Die Vorscreen-Bilder auf der linken Seite zeigen hier keine Verletzung des Arteria-cerebri-anterior-Gebiets. Sham-Kontrollkulturen sind oben dargestellt, kalorisch präkonditionierte Kulturen unten. Die Bilder der mittleren Reihe zeigen die relative Verletzung der Schnittkulturen 24 Stunden nach Exposition gegenüber 20 Mikromolar NMDA.Beachten Sie, dass die Verletzung in der Scheinkontrollgruppe größer ist als bei den Kulturen, die einer Kältevorbehandlung (labelt als cp) ausgesetzt wurden. Die relative Verletzungsskala in Farbkodierung ist in der oberen linken Abbildung dargestellt. Üblicherweise werden die Kulturen anschließend einer maximalen Schädigung ausgesetzt, beispielsweise durch 20 Mikromolar MDA über Nacht, um die neuronale Schädigung auf maximalem Niveau zu erreichen und die relative Schädigung durch Kältevorbehandlung im Vergleich zur Scheinkontrolle als Verhältnis der Schädigung zur maximalen Schädigung anzugeben.Jedoch kann die Exposition gegenüber maximalen Verletzungsreizen möglicherweise nicht ausreichen, um die Neuroprotektion durch Präkonditionierung zu überwinden. Daher spiegeln Verhältnisse von Verletzung zu maximaler Verletzung möglicherweise die Neuroprotektion durch Präkonditionierung nicht genau wider. Dies zeigt sich in den Bildern auf der rechten Seite, die aufzeigen, dass die maximalen Werte der Kältepräkonditionierung unter denen der Scheinkontrollen liegen.In dieser Studie wurde festgestellt, dass die Verwendung von Verletzungs- zu Maximalverletzungsverhältnissen den neuroprotektiven Effekt einer Kältevorbehandlung verschleiern kann. Dies ist anhand des Schemas ersichtlich, in dem die Scheinverletzung in Rot dargestellt ist und die Verletzung nach einer Kältevorbehandlung in Blau, ein Tag nach NMDA-Belastung. Nach der Kältevorbehandlung wurde der Verletzungsgrad mit drei bestimmt, verglichen mit Grad fünf in der Scheinkontrolle. Dies entspricht einer neuroprotektiven Wirkung von 40 %.Wenn jedoch ein traditionelles Format, das Verhältnisse wie Verletzung zu maximaler Verletzung verwendet, angewendet wird, ist kein Schutz erkennbar. Mit anderen Worten: 50 % für Sham gegenüber 50 % für Kälte-Präkonditionierung. Die quantitative PCR wurde unter Verwendung der hier gezeigten mRNA-Proben durchgeführt.Die TNF-alpha-Spiegel nach Kältevorbehandlung, dargestellt durch die blaue Linie, waren höher als bei den Kontrollen, die durch die grüne, gelbe und violette Linie repräsentiert werden. Dies deutet darauf hin, dass die Kältevorbehandlung eine erhöhte Produktion von TNF alpha im Gehirn auslöst. Um die Ergebnisse der quantitativen PCR und des quantitativen PCR-Arrays zu bestätigen, wurde eine Immunfärbung durchgeführt. Diese Schnittkultur wurde für Interleukin 11 in Rot und ein neues Ende zur Darstellung der Neuronen in Grün aufgearbeitet.Beachten Sie, dass einige Parametallneurone, die durch die Pfeile markiert sind, Interleukin 11 und neue End-Färbung zeigen und in Gelb dargestellt sind. Die Pfeile deuten auf einige kleinere Zellen hin, die vermutlich Astrozyten sind und lediglich eine erhöhte Interleukin-11-Färbung aufweisen. Bei der Abgrenzung des an der Kältevorbehandlung vermittelten neuroprotektiven Zytokinsignalwegs ist es wichtig, einige grundlegende Konzepte zu beachten.Obwohl Zytokine im normalen Gehirn in äußerst geringen Konzentrationen vorliegen, verändern bereits kleine Schwankungen der Zytokin-Konzentrationen die Genexpression. Daher haben Zytokine selbst bei niedrigen Konzentrationen ein enormes Potenzial, die Struktur und Funktion des Gehirns sowie somit das Phänotyp eines Organismus zu beeinflussen. Dieses Konzept wird hier durch den Kehrwert der Distanz dargestellt, beginnend mit einem Katzenbart als Referenzpunkt sowie Natrium, Kalium, pH und Calcium im Vergleich zu TNF alpha.Es ist außerdem wichtig zu bedenken, dass Zytokine stark redundant und pleiotrop sind – mehrere Zytokine können ähnliche Wirkungen haben und ein einzelnes Zytokin kann variable Effekte hervorrufen. Daher muss zur genauen Bestimmung der angeborenen zytokinvermittelten Grundlage des neuroprotektiven Effekts der Kältepräkonditionierung eine zusammengesetzte Analyse verwandter Signalvariablen durchgeführt werden. Dies wird mithilfe von Multiplex-Assay-Strategien erreicht, die das Zytokinprofil der neuroprotektiven Wirkung der Kältepräkonditionierung aufdecken. Sobald diese Methoden beherrscht sind, können die Kulturen in etwa drei Stunden hergestellt und anschließend für experimentelle Untersuchungen verwendet werden.Die Reaktion auf die kalte Vorkonditionierung kann über einen Zeitraum von ungefähr drei Tagen durchgeführt werden. Bei Durchführung dieser Verfahren ist es unerlässlich, sterile Techniken anzuwenden und die Handhabung auf ein Minimum zu beschränken, um die Fähigkeit zur Detektion von schwachen proinflammatorischen Signalen nach diesen Verfahren zu bewahren. Andere Methoden wie proteomische und molekularbiologische Analysen können an den Kulturen angewendet werden, um die Mechanismen aufzuklären, durch die die kalte Vorkonditionierung ihre ernährungsphysiologische und schützende Wirkung auf das Gehirn entfaltet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Es wird vermehrt Hinweise darauf, dass ischämischen Präkonditionierung (PC) - verleiht einen transienten Schutz einer nachfolgenden Beschädigung ischämischen - eine schonende ischämischen Herausforderung an das Gehirn. Wir haben festgestellt, bilateralen Arteria carotis communis Okklusion (BCCAO) als Vorbehandlung Stimulus bis Anfang ischämischen Toleranz (IT), um transiente fokale zerebrale Ischämie (induziert durch Mitte Zerebralarterie, MCAO) induzieren in C57Bl6 / J Mäusen.

Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion als adäquate Vorbehandlung Stimulus zu frühe ischämische Toleranz zu Focal zerebraler Ischämie induzieren

 Bewertung der neuroprotektiven Effekte der sauren Postkonditionierung in einem Mausmodell der zerebralen Ischämie

Quelle: Poinsatte, K., et al., Quantifizierung des neurovaskulären Schutzes nach wiederholter hypoxischer Präkonditionierung und vorübergehendem Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt die Methode der repetitiven hypoxischen Präkonditionierung (RHP), indem eine Maus kontrollierten Hypoxiezyklen ausgesetzt wird, bevor sie einen ischämischen Schlaganfall induziert. Das Experiment untersucht seine Auswirkungen auf die Stabilität der...

Neuronale Anpassung an repetitive hypoxische Präkonditionierung bei Mäusen

Quelle: Brandli, A. Remote Limb Ischemic Preconditioning: Eine neuroprotektive Technik bei Nagetieren. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt ein nicht-invasives Protokoll zur ischämischen Präkonditionierung der Gliedmaßen bei Ratten, um eine systemische Neuroprotektion zu induzieren. Das Verfahren beinhaltet einen kontrollierten arteriellen Verschluss und eine Reperfusion, wodurch zelluläre Stresswege ausgelöst werden, die Schutzfaktoren freisetzen. Diese Faktoren erhöhen die...

Nicht-invasive ischämische Präkonditionierung der Gliedmaßen in einem Rattenmodell zur Neuroprotektion

Remote ischämischen Präkonditionierung (RIP) ist ein Verfahren zur Konditionierung Gewebe vor schädlichen Stress. Wir haben eine Methode der Fern Ischämie an der Hintergliedmaße festgelegt, durch Aufblasen eines Blutdruckmanschette für 5-10 min. Die neuroprotektive Fähigkeiten von RIP in einem Modell der retinalen Degeneration bei Nagern gezeigt.

Remote Limb ischämischen Präkonditionierung: eine neuroprotektive Technique in Nagetiere

Dieses Protokoll beschreibt die wiederholte hypoxische Präkonditionierung oder kurze Exposition gegenüber systemischer Hypoxie, die das Infarktvolumen und die Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem vorübergehenden Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Mäusen reduziert. Es wird auch die duale Quantifizierung des Infarktvolumens und der Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem Schlaganfall beschrieben, um die Wirksamkeit des neurovaskulären Schutzes zu bewerten.

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Chirurgische Verschluss eines distalen Arteria cerebri media Zweig (MCAo) ist ein häufig verwendetes Modell in experimentellen Schlaganfallforschung. Diese Handschrift beschreibt die grundlegende Technik der Dauer MCAo, mit der Einfügung eines seitlichen Schädelfenster kombiniert werden, die die Möglichkeit für eine Längsintravitalmikroskopie in Mäusen bietet.

Lateral Chronic Cranial Fenster Vorbereitung Ermöglicht In Vivo Beobachtung Nach Artery Occlusion Distal cerebri bei Mäusen

Die saure Nachkonditionierung schützt vor der zerebralen Ischämie. Hier stellen wir zwei Modelle vor, um APC auszuführen. Sie werden jeweils durch Übertragung von kortikostriatalen Scheiben auf sauren Puffer nach Sauerstoff-Glukose-Deprivation in vitro und durch Einatmen von 20% CO 2 nach mittlerer zerebraler Arterienverschluss in vivo erreicht .

Experimentelle Modelle zur Untersuchung der Neuroprotektion der sauren Nachkonditionierung gegen zerebrale Ischämie

Komplexe Fortbewegung in naturalistischen Umgebungen erfordern sorgfältige Koordination der Gliedmaßen beinhaltet Regionen des parietalen Kortex. Das folgende Protokoll beschreibt den Einsatz der reversiblen Kühlung-induzierte Deaktivierung die Rolle des parietalen Bereich 5 in Speicher-geführte Hindernis-Vermeidung in der zu Fuß Katze zu demonstrieren.

Reversible Kühlung-induzierte Deaktivierungen kortikalen Beiträge zum Hindernis Speicher in der zu Fuß Katze zu studieren

Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.

In-vitro-Bewertung des Myokardschutzes nach Hypothermie-Vorkonditionierung in einem Human-Herz-Myozyten-Modell

Dieser Artikel beschreibt zwei Methoden der Ganzkörper-Kurzzeit-Hypothermie-Induktion bei Ratten. Die erste, schnelle Induktionsmethode, verwendet eine aktive Kühlung mit Ventilatoren und Ethanolspray für eine schnelle Temperatursenkung. Die zweite Methode ist eine schrittweise Abkühlungsmethode. Dies wird durch die Kombination von Isoflurananästhesie und der Reduzierung der Temperatureinstellungen auf der homöothermischen Wärmematte erreicht. Dies führt zu einer allmählichen Abnahme der...

Kurzzeit-Hypothermie-Induktion bei Ratten unter Verwendung von Modellen für Studien zur Untersuchung klinischer Relevanz und Mechanismen

Erfahren Sie die Methode der kalten Vorkonditionierung zur Untersuchung neuroprotektiver Mechanismen in Hippocampus-Schnittkulturen von Ratten. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse zytokinvermittelter Signalwege.

Strategies for Study of Neuroprotektion von Cold-Vorkonditionierung

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