Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

Hallo, ich bin Raja Ti und promoviere am Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Ich werde Sie durch die Schritte führen, die an der 3D-Illustration der östlichen Modifikation beteiligt sind, die DNA-Schäden und chromatische Kondensation in einer neuen Herzzelle markierte. Die DNA ist um nukleare Zonen gewickelt.

Jedes Nukleosom besteht aus vier verschiedenen Arten von Histonen, H zwei A, H zwei b, H drei und H vier radi. Die Bildung von DNA-Brüchen ist durch PHO von H zwei X gekennzeichnet. Dieses pho von H zwei X kommt hauptsächlich in Kreatin vor, das durch die Methylierung von H drei K vier gekennzeichnet ist. Jetzt schauen wir uns die 3D-Illustration der Modifikationen in Ihrer Zellimmunmarkierung mit der Pho-Schicht H zwei X und der methylierten H Drei K vier an.

Fangen wir an. Wir beginnen damit, den E-Verlauf der Zellsuspension in 15 mil zu legen. Falcon Tuben S werden zweimal mit PB-Beduftung bei einem 50 G und Resus gewaschen.

Suspendieren Sie in einem neuen Medium, um die unmittelbare Wirkung von Strahlung auf zelluläre Ereignisse zu sehen. Halten Sie die Zellen vor und während der Bestrahlung fünf bis 10 Minuten lang auf den Augen. Setzen Sie die Zellen entweder Gamma- oder Röntgenstrahlung aus Nach der Bestrahlung geben Sie drei Milliliter der Zellsuspension in jedes GU von sechs ab.

Well-Platte für Peak Gamma H, zwei X inkubieren Zellen zwischen 30 Minuten und einer Stunde bei 37 Grad Celsius. Wir verwenden die Cytosin-Mission, um die nicht adhärenten Zellen auf Objektträger zu platzieren. Achten Sie bei der Montage des Cytosin-Clips darauf, dass der gesamte Filterstrang mit dem Trichter übereinstimmt.

Geben Sie einen 50-Mikroliter ab, tupfen Sie diese Zellsuspension ab. In jedes Cytosin-Finale legen Sie die Cytosin-Clips in die Cytosin-Mission und drehen Sie sie fünf Minuten lang mit 500 U/min. Entfernen Sie die Cytosin-Clips und trennen Sie die Objektträger von der Filterkarte. Lassen Sie die Zellen nicht zu lange an der Luft trocknen, da dies den Hintergrund bei der Fluorescein-Färbung beeinflussen kann.

Mit einem Flüssigkeitsblockierstift werden Kreise um jeden Abstrich gezeichnet, wobei wir die Zellen mit einem 4%-Paraform-Kopf fünf Minuten lang bei Raumtemperatur fixieren. Im Vergleich zu Ethanol oder OL wurde eine bessere Fixierung mit 4%Paraform-Kopf beobachtet. Wind gleitet mit PPS-Perme-Zellen mit Triton X 100 bei Raumtemperatur für fünf Minuten.

Im Vergleich zu Twin 80 konnten wir mit Triton X 100 ein besseres Signal in Zellen beobachten. Beobachten Sie Zellen mit PP S3 mal für jeweils fünf Minuten. Blockieren Sie die Zellen einer Person BSA für 10 Minuten bei Raumtemperatur und wiederholen Sie dies dreimal im Vergleich zu anderen Blockierungsmitteln und -zeiten.

BSA erwies sich als am effizientesten Bei der Minimierung der unspezifischen Bindung von Primärantikörpern haben wir zwei Primärantikörper verwendet, die einer zu 500 mit 1 %BSA bei etwa 50 Mikrolitern Primärantikörper auf jeden Objektträger verdünnt wurden. Die Inkubation des Primärantikörpers bei Raumtemperatur für 60 Minuten reduziert die Hintergrundfärbung im Vergleich zur Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dreimal fünf Minuten lang mit PBS.

Alexa Etage 4 88, gute Anti-Maus und Alexa Etage 5 46 Wort Anti-Kaninchen. Sekundäre Antikörper wurden verwendet, um verschiedene Marker gleichzeitig zu halten. Verwenden Sie Antikörper, die in verschiedenen Spezies gezüchtet wurden.

Geben Sie etwa 50 Mikroliter verdünnten Sekundärantikörper zu jedem Objektträger. Inkubieren Sie die Zellen 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Es wird empfohlen, die Zellen in der Feuchtkammer zu inkubieren, da dies verhindert, dass Zellen und Antikörper die Waschobjektträger mit PB S3 dreimal für jeweils fünf Minuten trocknen.

Jedem Objektträger wurden 50 Mikroliter einer Verdünnung von Topo Drei in PBS von eins zu 500 zugesetzt. Waschen Sie die Objektträger dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit von den Objektträgern und fügen Sie Antifa-Lösung hinzu.

Es wird empfohlen, die Zellen vor der Zugabe von Antifa-Lösung nicht vollständig zu trocknen. Legen Sie ein Deckglas auf die Folie. K sollte eingenommen werden, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.

Lassen Sie die Objektträger über Nacht in einer dunklen, feuchten Kammer liegen. Versiegeln Sie den Objektträger mit Nagellack, um das Austrocknen der Zellen zu verhindern. Bilder, die an einem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden, zeigen.

Die bessere räumliche Auflösung ist verschwunden und für die Bildaufnahme wurden Heliumlaser verwendet. Ein Objekt mit 63 Ölemissionen ist gegenüber Objektiven mit höherer oder niedrigerer Vergrößerung bevorzugt. Ein Zoomfaktor von drei oder vier erzeugt ein Bild mit besserer Auflösung.

Für die FO-Abrechnung von vielen Zellen ist es vorzuziehen, eine Scangeschwindigkeit von acht und eine Bildgröße von 1024 Pixelzellen zu verwenden. Bei der Bildgebung für mehrere Kanäle wird im Vergleich zum Frame-Scan eine sequentielle Zeilenscan-Erfassung empfohlen. Um ein Ausbleichen der Probe zu vermeiden, werden die Detektorverstärkung und der Verstärker-Offset angepasst, um die Mäuse- und Signalsättigung zu reduzieren.

Da die Größe des Kama HX X four kleiner als 0,5 Mikrometer sein kann, wird empfohlen, Bilder mit mindestens 0,5 Mikrometer aufzunehmen. Bilder mit Schrittweite entlang der Jet-Achse sind in einem Jet-Serienmuster erforderlich, bei dem das Muster "Zuerst markieren" und "Verlorenes Muster markieren" verwendet wird. Um die räumliche Beziehung zwischen verschiedenen Proteinen zu veranschaulichen, wird empfohlen, eine Scangeschwindigkeit von sechs mit einer Bildgröße von 2048 und 2 48 Pixeln zuerst mit Metamor zu verwenden.

Die zweite kann aus Bildern gezählt werden, die mit verschiedenen konfokalen Mikroskopen aufgenommen wurden. Öffnen Sie gamma hgx-Bild-Tags entweder direkt über das Dateimenü oder mithilfe von Rechnungsnummern. Schilder. Gehen Sie zum Prozessmenü und wählen Sie Arithmatik stapeln.

Wählen Sie die maximale Projektion und wählen Sie die Pläne aus, die einbezogen werden sollen. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie nun Top Hat und wählen Sie Gamma H zwei X Bild als Quellbild anwenden.

Der Top-Hat-Filter und das resultierende Bild sind ein binäres Bild mit weniger Rauschen und reduzierter Variation der Brennschärfe. Gehen Sie zu Regionen und wählen Sie das Zeichenwerkzeug Region und zeichnen Sie Regionen um die Kerne. Gehen Sie zu Prozess, Menü und Verkaufsschwellenbild.

Wählen Sie den Einschlussschwellenwert und legen Sie den unteren und einen höheren Schwellenwert fest. In der Regel sind es die Schwellenwerte, die sich auf die Zahl vier auswirken. Der optimale Schwellenwert ist derjenige, der die Einbeziehung des Hintergrunds minimiert und die Einbeziehung des Vorstoßes maximiert.

Dies lässt sich am besten erreichen, indem die Anzahl der Streifzüge mit unterschiedlichen Schwellenwerten gezählt wird. Und dann vergleichen Sie die Streifzugsnummer mit der Zählung mit bloßem Auge. Wählen Sie DPI-Bild und gehen Sie zum Menü "Regionen" und wählen Sie die Option "Regionen übertragen".

Jetzt haben wir entsprechende Streifzugs- und Nuklearbilder zur Auszählung bereit. Die meisten nuklearen Regionen werden auf den Zylinder übertragen. Gehen Sie zum Menü "Messen" und wählen Sie "Integrierte Analyse" oder "IMA", wählen Sie "Alle Regionen messen" und klicken Sie auf "Messen", um die FTE-Nummer zu erhalten.

Jetzt können die FTE-Zahlen aus jeder Region mit der Option "Protokolldaten" in eine Tabelle exportiert werden. Öffnen Sie die zuvor erstellten Jet-Projektor-Bilder für jeden Kanal. Gehen Sie zur Anzeige und wählen Sie Farbausrichtung.

Wählen Sie für jeden Kanal die entsprechenden Quellbilder aus, um ein Bildbild für alle drei Kanäle zu erstellen. Die Zeilenanalyse wird durchgeführt, um die räumliche Positionierung verschiedener Marker im Zellkern zu veranschaulichen. Gehen Sie zum Befehl Werkzeugleisten messen, und wählen Sie Zeilenscan-Analyse Trockenlinie über die Zelle.

Dadurch wird ein Diagramm erstellt, das die Fluoreszenzintensität jedes Kanals entlang der Linie zeigt und den Abstand der verschiedenen Marker zueinander darstellt. Um ein 3D-Bild aus einem Stapel zu erstellen, gehen Sie zum Menü Zu einem Stapel und wählen Sie 3D-Rekonstruktion. Wählen Sie Maximum für den 3D-Rekonstruktionstyp aus.

Wählen Sie den Rotationsplan, wählen Sie den Düsenkalibrierungsabstand. Normalerweise gibt der Benutzer ein, klickt auf OK, um eine 3D-Rekonstruktion zu erstellen. Und damit ist unser Protokoll für Immunfluor und Färbung und Bildanalyse abgeschlossen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das konfokale Immunfluoreszenzmikroskop zwei Techniken für die dreidimensionale Darstellung verschiedener C-Marker und Gamma H zwei X foy im Zellkern ist. Danke fürs Zuschauen.