Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Mikrofabrikation von Geräten, die zur mechanischen Stimulation von Zellen verwendet werden, zwei- und dreidimensionale Kulturumgebungen. Dies wird durch die Verwendung einer mehrschichtigen Sandwichform- und Stapeltechnik erreicht, um eine Reihe von vertikal betätigten Mikropfosten herzustellen. In einem zweiten Schritt wird das vertikal betätigte Micro-Post-Array modifiziert, um einen Kulturfilm zu dehnen, der gut kontrollierte Stämme auf die auf dem Film kultivierten Zellen aufbringt.

Alternativ kann das Array so modifiziert werden, dass mikrostrukturierte Biomaterialkonstrukte komprimiert werden, um eine mechanische Stimulation auf Zellen anzuwenden. Kultiviert in einem Array von dreidimensionalen Hydrogelen werden Ergebnisse erzielt, die die gleichzeitige Anwendung einer Reihe von zweidimensionalen Echo-, biaxialen und dreidimensionalen Kompressionsdehnungen über das Array zeigen, basierend auf der Bildanalyse von fluoreszierenden treuhänderischen Markern. Hallo, ich bin Chris Mariahs aus den Labors von Craig Simmons und U Sun am Department of Mechanical and Industrial Engineering und am Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering an der University of Toronto.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Mikrogeräten, mit denen Zellen mechanisch stimuliert werden. Mit diesem Verfahren untersuchen wir in unserem Labor, wie Zellen in In-vitro-Kulturen auf eine Vielzahl von mechanischen Kräften reagieren. Also lasst uns loslegen.

Der Prozess der Herstellung von Sandwichformen umfasst das Aufbringen einer Überkopftransparenz auf nicht ausgehärtetes Polydimethylsloane oder PDMS auf einem SU-Acht-Master. Das Sandwich wird in einen Stapel aus Schaumstoffglas und Metall gelegt und in einem Ofen unter Kompression ausgehärtet. Schließlich wird der Stapel zerlegt und die Transparenz abgezogen, wobei die gemusterte PDMS-Schicht erhalten bleibt.

Um diesen Prozess zu beginnen, mischen Sie PDMS, Monomer und Vernetzer gründlich. Im Standardverhältnis von 10 zu eins scheiden Sie drei Milliliter des nicht ausgehärteten PDMS-Gemisches auf einen zuvor hergestellten SU-Acht-Master ab und DGAs das Polymer in einer Vakuumkammer. Legen Sie anschließend das Schaumstoffpad und den SU eight master auf eine Grundplatte aus Plexiglas.

Senken Sie die glatte Seite einer Inkjet-Folie vorsichtig auf das nicht ausgehärtete PDMS ab und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Positionieren Sie dann einen Objektträger aus siloisiertem Glas auf der Transparenz unter dem zweiten Schaumstoffpolster und einer Plexiglas-Deckplatte. Klemmen Sie das Sandwich mit einer C-Klemme zusammen.

Härten Sie das PDMS-Sandwich mindestens vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius im Ofen. Nach dem Aushärten das Sandwich aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen. Entfernen Sie nach dem Abkühlen die Klemme und zerlegen Sie das Sandwich.

Ziehen Sie die Folie vorsichtig vom SU eight Master ab und behalten Sie die patentierte PDMS-Folie bei. Schneiden Sie die Kanten der Musterfolie ab, um überschüssiges PDMS zu entfernen, und lagern Sie die Musterebenen in einer staubfreien Umgebung, bis sie einsatzbereit sind. Der nächste Teil dieses Protokolls beinhaltet die Konstruktion einer mikrogefertigten Anordnung von vertikal betätigten Pfosten.

Für die Herstellung des Arrays der Mikropfosten ist ein mehrschichtiger Herstellungsprozess erforderlich. Die unterste, am stärksten gemusterte PDMS-Schicht wird durch die Herstellung von Sandwichformen hergestellt. Für diese Experimente wurden kreisförmige Muster mit einem Durchmesser von 600 bis 1.200 Mikrometern verwendet.

Um die PDMS-Schicht auf einen sauberen Objektträger zu übertragen, verwenden Sie eine Koronaentladungseinheit, um das PDMS und die Glasoberflächen mit Sauerstoffplasma zu behandeln. Bringen Sie dann die beiden Flächen in Kontakt miteinander. Legen Sie den Stapel 10 Minuten lang bei 80 Grad Celsius auf eine heiße Platte, um den Klebevorgang abzuschließen.

Ziehen Sie die Transparenz ab und entsorgen Sie sie. Dieses Verfahren stellt sicher, dass sich die gemusterte PDMS-Folie niemals von einem starren Substrat löst, was ein Schrumpfen der einzelnen Schichten verhindert. Die zweite sandwichgeformte Schicht wird als Negativnachbildung der gewünschten Membran- und Pfostenstruktur ausgebildet.

In dieser Demonstration wurden kreisförmige Pfosten mit einem Durchmesser von 500 Mikrometern verwendet, um diese Schicht zu bilden. Zuerst wird die Negativ-Replik-Form mit doppelseitigem Klebeband vorübergehend auf einem Objektträger befestigt und in einem Vakuum isoliert, um nicht ausgehärtetes PDMS auf das Sandwich abzulagern, die Formschicht zu entgasen und 45 Sekunden lang zu schleudern. Bei 1000 Umdrehungen pro Minute, die eine Betätigungsmembran von 60 Mikrometern Dicke ergibt, härtet die mit Schleuderung beschichtete PDMS-Schicht bei 80 Grad Celsius für etwa 20 Minuten teilweise aus oder bis das PDMS klebrig ist, sich aber nicht dauerhaft verformt. Entfernen Sie bei Berührung den Objektträger und das doppelseitige Klebeband von der teilweise ausgehärteten PDMS-Schicht und der transparenten Folie. Befestigen Sie sie auf einem Paar Objektträger und Plasma.

Behandeln Sie das teilweise ausgehärtete PDMS, invertieren Sie das PDMS und setzen Sie es in einen individuell angefertigten Aligner ein. Der Aligner besteht aus einem Vakuumfutter, das auf einem Mikromanipulator montiert ist. Anschließend wird die erste PDMS-Schicht mit dem Plasma behandelt und dann auf einem Drehtisch unter dem Vakuumfutter platziert.

Beobachten Sie die Ausrichtung zwischen den beiden Schichten mit einem Avatar-Bildverarbeitungssystem mit 12-fachem Zoom. Richten Sie die Schichten mit dem Manipulator aus und bringen Sie sie vorsichtig in Kontakt. Üben Sie leichten Druck mit einem Finger aus, um die Schichten zusammenzukleben.

Entferne dann das Sandwich vom Aligner. Entfernen Sie die Glas-Handhabungsobjektträger und stellen Sie sicher, dass die Schichten in vollem Kontakt miteinander stehen. Einen Ofen bei 80 Grad Celsius für weitere 30 Minuten aushärten.

Nach 30 Minuten kann die transparente und siloisierte PDMS-Form vom Gerät abgezogen und entsorgt werden. Das Gerät wird dann mindestens vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius vollständig ausgehärtet, um Experimente mit Zellen durchzuführen, die auf einem sich verformenden zweidimensionalen Substrat kultiviert wurden. Das Mikroaktuator-Array wird modifiziert, indem eine dritte PDMS-Schicht mit dem Gerät verbunden wird.

Die dritte PDMS-Schicht besteht aus einem zweischichtigen Aufbau. Der untere Kreis entspricht der Größe des Betätigungshohlraums unter den betätigten Mikropfosten. Der Durchmesser des oberen Kreises ist 100 Mikrometer größer als der Durchmesser der Ladesäulen.

Ein 200 Mikrometer breiter Mikrokanal verbindet diese Merkmale mit einem Verbindungsbereich und wird zur Schmierung der Ladepfosten und der Kulturfolie verwendet. Um das Gerät für die 2D-Kultur zu modifizieren, stellen Sie zunächst die Steckverbinder her und verbinden Sie sie mit ihm, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Dann schleudern Sie eine 10 bis 15 Mikrometer dicke Schicht PDMS auf die glatte Seite eines transparenten Härtungsmittels.

Der dünne PDMS-Film wird mindestens vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius getestet. Der nächste Schritt besteht darin, ein Vakuum auf die Aktuatoren anzuwenden und die PDMS-Schicht mit dem Gerät zu verbinden. Um dies zu erreichen.

Wenden Sie zunächst ein niedriges Vakuum an die Aktuatoren an, um die Anordnung der Stifte, der Plasmabehandlung und -bindung zu verringern. Der spinnbeschichtete PDMS-Film auf die betätigte Mikrovorrichtung, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, die Stifte und der Kulturfilm bleiben für kurze Zeit hydrophil. Schließen Sie dann die Gleitmittelspritze an das Gerät an und füllen Sie die Schmierkanäle mit einer 90%igen Glycerinlösung in deionisiertem Wasser.

Zusätzlich zur Schmierung erhält diese Formulierung die Hydrophilie des PDMS unbegrenzt aufrecht und reduziert die Reibungskoeffizienten. Stellen Sie das Gerät auf eine heiße Platte bei 40 Grad Celsius und injizieren Sie weiterhin Schmiermittel in den Kanal, wodurch ein geringer Druckanstieg entsteht. Nach einigen Minuten waren die Luftblasen durch das PDMS diffundiert und alle Oberflächen werden geschmiert.

Für den letzten Schritt entfernen Sie den Unterdruck und lassen die Stifte mit einem Skalpell los. Schneiden Sie um die dünne PDMS-Folie herum. Ziehen Sie die Transparenzrückseite vorsichtig von der Plasmabindung des Geräts ab.

Eine handgeschnittene PDMS-Dichtung um den Gerätekulturbereich. Sterilisieren Sie das Gerät, indem Sie es fünf Minuten lang in 70 % Ethanol einweichen, gefolgt von einer Behandlung unter keimtötendem UV-Licht in einer biologischen Sicherheitswerkbank für 45 Minuten. Plasma, behandeln Sie die Oberfläche und inkubieren Sie mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kollagen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Nach der Inkubation über Nacht waschen Sie das Gerät mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS und Samenzellen bei 10 bis 15.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Gemäß den Standard-Zellkulturprotokollen kann das Mikroaktuator-Array modifiziert werden, um Experimente für Zellen durchzuführen, die in dreidimensionalen photostrukturierten Hydrogelkonstrukten kultiviert wurden. Zunächst wird eine mehrschichtige PDMS-basierte Plattform hergestellt.

Nachdem die Basisplattform mit einem Meth bedeckt wurde, wird eine zugehörige Hydrogel-Vorläuferlösung aus Glas injiziert. Dann wird ein reservierbares Photopolymer-Biomaterial in das Array mikrostrukturiert und die verbleibende Vorläuferlösung wird weggespült. Das Array der vertikal betätigten Ladepfosten kann dann verwendet werden, um mechanische Druckkräfte auf Zellen auszuüben, die in dreidimensionalen Biomaterialien kultiviert wurden, wobei die Bereiche um die Pfosten herum mit Klebeband abgedeckt werden, die das Gerät mit Paralin C in einem PDS 2010 Labor COTER two-System überziehen.

Dadurch wird die Polymerisationskinetik für das Biomaterialsystem verbessert. Entfernen Sie das Gerät nach der Beschichtung aus dem Beschichtungssystem und ziehen Sie das Klebeband ab, wobei Sie eine konforme Schicht aus Paralin C über den Pfosten verbleiben. Dann Meth ACRL Glas Deckfolie durch Eintauchen in eine Lösung von 2 % Volumen pro Volumen von Methacrylat mit drei Trimeth Oxy Profil in 95% Ethanol für zwei Minuten.

Spülen Sie den Bezug aus. 100 % Ethanol einfüllen, anschließend bei 100 Grad Celsius backen, dabei Methacrylatgruppen auf der Oberfläche belassen. Gießen Sie einen 200 Mikrometer dicken PDMS-Abstandhalter.

In einer Petrischale filmen und in kleine Stücke schneiden. Plasmakleben Sie vier dieser kleinen Abschnitte um den Rand des meac-bezogenen Deckglases. Dann kleben Sie die Zwischenräume mit dem Plasma an die PDMS-Bereiche des Geräts, die die Lene C-beschichtet abdecken.

Zum Schluss sterilisieren Sie das Gerät, indem Sie es in 70%igem Ethanol waschen und in einer biologischen Sicherheitswerkbank 45 Minuten lang keimtötendem oder UV-Licht aussetzen. Zur photolithographischen Strukturierung der zellbeladenen PEG-Hydrogele in die Geräte. Bereiten Sie die Vorläufer- und Photoinitiatorlösungen wie im schriftlichen Protokoll beschrieben vor und mischen Sie sie gründlich, um eine Lösung mit einer Konzentration von 0,4 Gew.-% pro Volumen des Photoinitiators zu erhalten.

Filtrieren Sie die Mischung durch einen 0,45-Mikron-Spritzenvorsatzfilter, um Partikel und Trypsin-Eiszellkulturen zu sterilisieren und zu entfernen, und bereiten Sie eine Zellsuspension in Kulturmedien mit der doppelten Zellendkonzentration vor. Mischen Sie dann die Zellsuspension und die gefilterte Hydrogel-Vorläufer-Photoinitiatorlösung im Verhältnis eins zu eins. Injizieren Sie die Lösung mit einer langen 25-Gauge-Nadel in das Mikrogerät.

Vermeiden Sie sorgfältig das Einfangen von Blasen im Gerät. Richten Sie eine gedruckte Transparenzmaske an Ausrichtungsmarkierungen auf der Geräteoberfläche aus. Richten Sie ein UV-Beleuchtungssystem ein, um eine UV-Dosis von 365 Nanometern Wellenlänge von 17,5 Milliwatt pro Quadratzentimeter an der Geräteoberfläche bereitzustellen.

Beleuchten Sie das Hydrogel nach dem Aufleuchten 195 Sekunden lang durch die Maske. Waschen Sie die nicht polymerisierte Hydrogel-Vorläuferlösung mit PBS ab und ersetzen Sie das PBS durch Nährmedien, betätigen Sie die Ladepfosten, um die Hydrogelkonstrukte zu komprimieren. Hier wird ein fertiges Beispielgerät für die 2D-Mechano-Stimulationskultur gezeigt.

Roter Farbstoff wird verwendet, um die Betätigungsdruckzufuhrkanäle zu markieren, und blaues D wird verwendet, um die Dehnungscharakterisierung der Schmierkanäle zu markieren. Experimente können verwendet werden, um die angelegten Dehnungsfelder zu bestimmen, indem die Bewegung der fluoreszierenden Kügelchen auf den Substraten verfolgt wird. Rote Punkte stellen die ungeformte Position der Perlen dar, während grüne Punkte die verformten Stellen darstellen.

Hier ist ein Beispielgerät für dreidimensionale Druckexperimente zu sehen, bei dem grüner Farbstoff zur Markierung von Betätigungsdruckkanälen verwendet wird. Die Draufsicht auf das Mikro-Post-Array zeigt das Hydrogel-Konstrukt, das auf der Post-Seite gemustert ist, rekonstruierte Bilder von fluoreszierenden Kügelchen im Hydrogel-Konstrukt. Im Ruhezustand und bei 55 Kilopascal Betätigungsdrücken wird der Prozess der Stammcharakterisierung in einem dreidimensionalen Kultursystem demonstriert.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Geräte herstellen können, mit denen Zellen in zwei- oder dreidimensionalen Kultursystemen mechanisch stimuliert werden können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Geräte so sauber und staubfrei wie möglich zu halten und Geduld zu haben, insbesondere während der Ausrichtungsschritte. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.