Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Vorrichtungen zur mechanischen Stimulation von Zellen in zwei- und dreidimensionalen Kulturgegebenheiten mikrotechnisch herzustellen. Dies wird durch eine mehrschichtige Sandwich-Form- und Stapeltechnik erreicht, mit der ein Array vertikal angesteuerter Mikrosäulen erzeugt wird. In einem zweiten Schritt wird das Array aus vertikal angesteuerten Mikrosäulen modifiziert, um einen Kulturfilm zu dehnen, wodurch gut kontrollierte Dehnungen auf Zellen ausgeübt werden, die auf dem Film kultiviert werden.

Alternativ kann das Array so modifiziert werden, dass mikrostrukturierte Biomaterialkonstrukte komprimiert werden, um mechanische Reize an Zellen anzulegen. Die Kultivierung in einem Array aus dreidimensionalen Hydrogelen führt zu Ergebnissen, die anhand der Bildanalyse fluoreszierender Markierungspunkte die gleichzeitige Anwendung einer Bandbreite zweidimensionaler, echokardiographisch biaxialer und dreidimensionaler Kompressionsdehnungen über das gesamte Array hinweg zeigen. Hallo, ich bin Chris Mariahs aus den Laboren von Craig Simmons und U Sun am Department für Maschinenbau und Industrietechnik sowie am Institut für Biomaterialien und Biomedizinische Technik an der University of Toronto.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung mikroskopischer Vorrichtungen, die zur mechanischen Stimulation von Zellen verwendet werden. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie Zellen in der in-vitro-Kultur auf eine Vielzahl mechanischer Kräfte reagieren. Beginnen wir also.

Der Prozess der Sandwich-Formherstellung umfasst das Auflegen einer Overhead-Folie auf ungehärtetes polydimethylsiloxan oder PDMS auf einem SU-8-Master. Der Sandwich wird in einen Stapel aus Schaumglas und Metall gelegt und im Ofen unter Druck gehärtet. Schließlich wird der Stapel auseinandergenommen und die Folie abgezogen, wobei die strukturierte PDMS-Schicht zurückbleibt.

Um diesen Prozess zu beginnen, mischen Sie PDMS, Monomer und Vernetzer gründlich. Tragen Sie im üblichen Verhältnis von 10 zu 1 drei Milliliter der ungehärteten PDMS-Mischung auf eine zuvor hergestellte SU-8-Form und DGAs das Polymer in einer Vakuumkammer auf. Anschließend platzieren Sie das Schaumstoffpad und die SU-8-Form auf einer Plexiglas-Grundplatte.

Senken Sie die glatte Seite einer Tintenstrahl-Transparenz vorsichtig auf das ungehärtete PDMS ab und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Positionieren Sie dann einen silanisierten Glasobjektträger oberhalb der Transparenz unter dem zweiten Schaumstoffpad und einer Plexiglasschutzplatte. Klemmen Sie das Sandwich mit einem C-Clamp fest zusammen.

Heizen Sie das PDMS-Sandwich im Ofen bei 80 Grad Celsius mindestens vier Stunden lang aus. Entfernen Sie das Sandwich nach dem Aushärten aus dem Ofen und lassen Sie es abkühlen. Nach dem Abkühlen entfernen Sie die Klammer und nehmen das Sandwich auseinander.

Lösen Sie die Transparentfolie vorsichtig von der SU-8-Masterform, wobei der strukturierte PDMS-Film erhalten bleibt. Schneiden Sie die Ränder des Strukturfilms zurecht, um überschüssiges PDMS zu entfernen, und lagern Sie die Strukturebenen in einer staubfreien Umgebung, bis sie verwendet werden. Der nächste Abschnitt dieses Protokolls beschreibt den Aufbau eines mikrofabrizierten Arrays aus vertikal bewegten Säulen.

Um das Array aus Mikroposts herzustellen, ist ein mehrschichtiger Herstellungsprozess erforderlich. Die unterste strukturierte PDMS-Schicht wird mittels Sandwich-Formherstellung präpariert. Für diese Experimente wurden kreisförmige Muster mit Durchmessern zwischen 600 und 1.200 Mikrometern verwendet.

Um die PDMS-Schicht auf einen sauberen Objektträger zu übertragen, behandeln Sie die PDMS- und Glasoberflächen mit einem Corona-Entladungsgerät mittels Sauerstoffplasma. Bringen Sie danach die beiden Oberflächen in Kontakt miteinander. Stellen Sie den Stapel 10 Minuten lang auf eine Heizplatte bei 80 Grad Celsius, um den Bindungsprozess abzuschließen.

Entfernen Sie die Transparenzfolie und entsorgen Sie sie. Dieser Prozess stellt sicher, dass der strukturierte PDMS-Film niemals von einem starren Substrat gelöst wird, wodurch eine Schrumpfung der einzelnen Schichten verhindert wird. Die zweite gegossene Sandwich-Schicht wird als Negativabdruckform der gewünschten Membran- und Säulenstruktur gebildet.

In dieser Demonstration wurden kreisförmige Säulen mit einem Durchmesser von 500 µm verwendet, um diese Schicht herzustellen. Befestigen Sie zunächst die negative Abformform vorübergehend mit doppelseitigem Klebeband an einem Objektträger und silanisieren Sie sie in einer Vakuumtrockenschrank. Tragen Sie anschließend nicht ausgehärtetes PDMS auf das Sandwich, die Formschicht, auf, entgasen Sie es und führen Sie einen Schleuderbeschichtungsprozess für 45 Sekunden bei 1000 Umdrehungen pro Minute durch, wodurch eine 60 µm dicke Aktuationsmembran entsteht. Härten Sie die beschichtete PDMS-Schicht anschließend teilweise bei 80 °C für etwa 20 Minuten aus, oder bis das PDMS klebrig ist, sich aber nicht dauerhaft verformt, wenn es berührt wird. Entfernen Sie danach den Objektträger und das doppelseitige Klebeband von der teilweise ausgehärteten PDMS-Schicht, bringen Sie die Transparenzfolie an einem Paar von Glas-Handhabungsplättchen an und behandeln Sie sie mit Plasma.

Behandeln Sie das teilweise gehärtete PDMS, drehen Sie es dann um und legen Sie es in einen speziell angefertigten Ausrichter. Der Ausrichter besteht aus einer Vakuumspannvorrichtung, die auf einem Mikromanipulator montiert ist. Behandeln Sie anschließend die erste PDMS-Schicht im Plasma, und platzieren Sie sie auf einer Dreheinheit unterhalb der Vakuumspannvorrichtung.

Überprüfen Sie die Ausrichtung zwischen den beiden Schichten mit einem maschinellen Sichtsystem mit 12-facher Vergrößerung. Richten Sie die Schichten mithilfe des Manipulators aus und bringen Sie sie vorsichtig in Kontakt. Üben Sie mit dem Finger leichtem Druck aus, um die Schichten zusammenzufügen.

Entfernen Sie dann das Sandwich aus dem Aligner. Nehmen Sie die Glas-Handhabungsfolien ab und stellen Sie sicher, dass die Schichten vollständig miteinander in Kontakt sind. Aushärten im Ofen bei 80 Grad Celsius für zusätzliche 30 Minuten.

Nach 30 Minuten können die transparente und siloisierte PDMS-Abformung vom Gerät abgezogen und entsorgt werden. Das Gerät wird anschließend bei 80 Grad Celsius mindestens vier Stunden lang vollständig ausgehärtet, um Experimente mit auf einem verformbaren zweidimensionalen Substrat kultivierten Zellen durchzuführen. Das Mikroaktor-Array wird modifiziert, indem eine dritte PDMS-Schicht mit dem Gerät verbunden wird.

Die dritte PDMS-Schicht besteht aus einer zweischichtigen Struktur. Der untere Kreis entspricht der Größe des Aktivierhohlraums unterhalb der betätigten Mikropfosten. Der Durchmesser des oberen Kreises ist 100 Mikrometer größer als der Durchmesser der Belastungspfosten.

Ein 200 Mikrometer breiter Mikrokanal verbindet diese Strukturen mit einem Anschlussbereich und dient zur Schmierung der Beladekontakte und der Kulturschicht. Um das Gerät für die 2D-Kultur umzurüsten, fertigen und binden Sie zunächst die Anschlüsse entsprechend der schriftlichen Anleitung an das Gerät. Anschließend beschichten Sie durch Schleuderbeschichtung eine 10 bis 15 Mikrometer dicke Schicht aus PDMS auf der glatten Seite einer Transparentfolie und härten diese.

Den dünnen PDMS-Film bei 80 Grad Celsius mindestens vier Stunden lang aushärten lassen. Im nächsten Schritt wird ein Vakuum an den Aktoren angelegt, um die PDMS-Schicht mit dem Gerät zu verbinden. Um dies zu erreichen.

Zunächst wird ein schwacher Vakuumdruck auf die Aktuatoren angelegt, wodurch sich die Säulenreihe absenkt. Danach das Array plasmatreaten und mit dem spin-beschichteten PDMS-Film gemäß dem schriftlichen Protokoll mit dem aktuierten Mikrogerät verbinden; die Säulen und der Kulturfilm verbleiben für kurze Zeit hydrophil. Anschließend die Schmierspritze mit dem Gerät verbinden und die Schmierkanäle mit einer 90 %igen Glycerinlösung in entionisiertem Wasser füllen.

Zusätzlich zur Schmierung bewahrt diese Formulierung die Hydrophilizität von PDMS unbegrenzt und verringert so die Reibungskoeffizienten. Stellen Sie das Gerät auf eine Heizplatte bei 40 Grad Celsius und fahren Sie fort, Schmiermittel in den Kanal einzuspritzen, wodurch ein leichter Druckanstieg verursacht wird. Nach einigen Minuten verteilen sich die Luftblasen durch das PDMS, und alle Oberflächen werden geschmiert.

Entfernen Sie im letzten Schritt den Unterdruck, indem Sie die Posts mit einem Skalpell lösen. Schneiden Sie entlang des dünnen PDMS-Films. Ziehen Sie die Transparenzfolie vorsichtig von der plasmabondierten Vorrichtung ab.

Eine manuell ausgeschnittene PDMS-Dichtung um den Kulturbereich des Geräts. Sterilisieren Sie das Gerät, indem Sie es fünf Minuten lang in 70 % Ethanol eintauchen und anschließend 45 Minuten lang einer keimabtötenden UV-Bestrahlung in einem biologischen Sicherheitswerkbank aussetzen. Plasma-behandeln Sie die Oberfläche und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kollagen.

Nach einer Übernacht-Inkubation das Gerät mit steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS waschen und Zellen mit einer Dichte von 10.000 bis 15.000 Zellen pro Quadratzentimeter ansäen. Gemäß standardmäßiger Zellkultivierungsprotokolle kann das Mikroaktor-Array modifiziert werden, um Experimente mit in dreidimensionalen, lichtmusterbasierten Hydrogel-Konstrukten kultivierten Zellen durchzuführen. Zunächst wird eine mehrschichtige, PDMS-basierte Plattform hergestellt.

Nachdem die Basisplattform mit einem Meth bedeckt wurde, wird eine verwandte Glas-Deckglas-Hydrogel-Vorläuferlösung injiziert. Anschließend wird ein lichtempfindliches, reversibel polymerisierbares Biomaterial in das Array mikropatterning-technisch strukturiert, und die übrige Vorläuferlösung wird abgespült. Das Array vertikal beweglicher Belastungsstifte kann dann verwendet werden, um kompressive mechanische Kräfte auf in dreidimensionalen Biomaterialien kultivierte Zellen auszuüben, wobei Bereiche um die Stifte herum mit Klebeband abgedeckt werden, um das Gerät in einem PDS 2010 Lab COTER Two-System mit Paraline C zu beschichten.

Dies verbessert die Polymerisationskinetik für das Biomaterialsystem. Nach dem Beschichten entfernen Sie das Gerät aus dem Beschichtungssystem und ziehen das Klebeband ab, wodurch eine konforme Schicht aus Paraline C auf den Säulen zurückbleibt. Danach methacrylieren Sie die Glasdeckenscheibe durch zweiminütiges Eintauchen in eine 2 %ige (Volumen pro Volumen) Lösung von 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat in 95 %igem Ethanol.

Spülen Sie die Abdeckung. Geben Sie 100 % Ethanol hinzu, gefolgt von einer Trocknung bei 100 Grad Celsius, wodurch Methacrylatgruppen auf der Oberfläche verbleiben. Gießen Sie einen 200 Mikrometer dicken PDMS-Abstandshalter.

Folie in eine Petrischale legen und in kleine Abschnitte schneiden. Vier dieser kleinen Abschnitte mit Plasmabehandlung am Rand des Meac-bezogenen Deckgläschens befestigen. Anschließend die Zwischenräume mit den PDMS-Bereichen des Geräts, die die Lene C-beschichtete Fläche bedecken, durch Plasmabehandlung verbinden.

Das Gerät abschließend durch Waschen in 70 % Ethanol sterilisieren und 45 Minuten lang einem Desinfektionsmittel oder UV-Licht in einem biologischen Sicherheitswerkbank aussetzen. Um die zellbeladenen PEG-Hydrogels lichtlithografisch in den Geräten zu strukturieren, bereiten Sie das Vorläufer- und das Photoinitiator-Lösung gemäß der schriftlichen Anleitung vor und mischen Sie sie gründlich, um eine Lösung mit einer Konzentration von 0,4 % Gewicht pro Volumen an Photoinitiator zu erhalten.

Filtrieren Sie die Mischung durch einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter, um sie zu sterilisieren und Partikel, Trypsin und Eis-Zellkulturen zu entfernen, und stellen Sie eine Zellsuspension in Kulturmedium mit der doppelten gewünschten Endzellkonzentration her. Anschließend mischen Sie die Zellsuspension und die gefilterte Hydrogel-Vorläufer-Photoinitiatorlösung im Verhältnis 1:1. Injizieren Sie die Lösung mit einer langen 25-Gauge-Nadel in das Mikrogerät.

Vermeiden Sie sorgfältig das Einschließen von Blasen im Gerät. Richten Sie eine ausgedruckte Transparenzmaske an den Ausrichtungsmarkierungen auf der Geräteoberfläche aus. Richten Sie ein UV-Beleuchtungssystem so ein, dass es an der Geräteoberfläche eine UV-Dosis mit einer Wellenlänge von 365 Nanometern und einer Intensität von 17,5 Milliwatt pro Quadratzentimeter bereitstellt.

Belichten Sie das Hydrogel durch die Maske für 195 Sekunden nach der Belichtung. Spülen Sie die nicht polymerisierte Hydrogel-Vorläuferlösung mit PBS ab und ersetzen Sie den PBS durch Kulturmedium. Aktivieren Sie die Belastungsstifte, um die Hydrogel-Konstrukte zu komprimieren. Hier ist ein fertiges Beispielgerät für die 2D-mechanostimulative Kultur dargestellt.

Rotes Farbstoff wird verwendet, um die Druckversorgungskanäle für die Aktuierung zu markieren, und Blau D dient zur Markierung der Schmierkanäle für die Dehnungscharakterisierung. Experimente können genutzt werden, um aufgebrachte Dehnungsfelder durch Verfolgung der Bewegung fluoreszierender Kügelchen auf den Substraten zu bestimmen. Rote Punkte stellen die ursprüngliche Position der Kügelchen dar, während grüne Punkte die verformten Positionen anzeigen.

Hier ist eine Beispielvorrichtung für dreidimensionale Kompressionsversuche zu sehen, bei der grüne Farbe verwendet wird, um die Druckkanäle für die Aktuierung zu markieren. Die Draufsicht auf das Mikropost-Array zeigt das Hydrogel-Konstrukt, das auf der Oberseite des Post-Arrays angeordnet ist, sowie rekonstruierte Seitenansichten fluoreszierender Kügelchen im Hydrogel-Konstrukt. Die Darstellung unter Ruhebedingungen und bei einer Aktuierungsdruck von 55 Kilopascal veranschaulicht den Dehnungscharakterisierungsprozess in einem dreidimensionalen Kultursystem.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Vorrichtungen herstellt, die zur mechanischen Stimulation von Zellen in zweidimensionalen oder dreidimensionalen Kultursystemen verwendet werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Vorrichtungen so sauber und staubfrei wie möglich zu halten und Geduld zu bewahren, insbesondere während der Ausrichtungsschritte. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.