In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Durchbrüche in der optischen Bildgebung und in der genetisch kodierten Grippekraft haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die biologischen Prozesse zu untersuchen, an denen sie interessiert sind, sowohl im lebenden als auch in einigen Fällen sogar im sich verhaltenden Organismus. Während viel Wert auf die Untersuchung des Säugetiergehirns in vivo gelegt wurde, verwendet unser Labor ein recht einfaches Modellsystem, die troph neuromuscular junction, und im folgenden Video erklären wir, wie man Fruchtversuchslarven anästhesiert und abbildet, um die Entwicklung einzelner Synapsen im Laufe von Stunden zu verfolgen. bis zu Tagen, während als Methode zur Untersuchung der Entwicklung von Lebensmitteln. Avi existieren, ist das vorzulegende und ein Beendigungsprotokoll zeichnet sich durch die folgenden Hauptmerkmale aus.

Zunächst einmal wird durch einen sehr hohen Analysegrad sogar der Herzschlag gestoppt, was für eine hohe Bildqualität unerlässlich ist. Zweitens durch eine Überlebensrate von 95% und durch die Fähigkeit, sehr empfindliche Bilder aufzunehmen. Das folgende Protokoll ermöglicht es uns beispielsweise, die Dynamik von Glutamatrezeptoren zu untersuchen, die mit GFP markiert sind und auf physiologischer Ebene von ihren endogenen Promotoren exprimiert werden.

Sie lernen nun, wie Sie die Larven in die Bildgebungskammer einführen, wie Sie die Früchte für Larven betäuben, wie Sie eine bestimmte Position innerhalb der Larven finden, um die Anmeldetreppe abzubilden, und dann auch, wie Sie die Larven aus der Bildgebung bergen. Vor der In-vivo-Bildgebung ist es wichtig, die Larven zu waschen. Obwohl dieser Prozess einfach ist, muss darauf geachtet werden, dass die Larven nicht beschädigt werden, und daher wird niemals eine Zange verwendet, um sie zu bewegen.

Stattdessen entscheiden wir uns für sanfte Bewegungen mit einer Bürste. Das Wasser, das zum Waschen verwendet wird, hat diese Raumtemperatur und es ist nur normales Leitungswasser, das nicht destilliert ist oder Reinigungsmittel enthält. Wir können euch sehen.

Er führt die Larven vorsichtig aus dem Futter in das frische Leitungswasser, um gute Ergebnisse zu erzielen. Es ist auch wichtig, die Larven so kurz wie möglich im Wasser zu halten. Dadurch wird verhindert, dass Wasser in die Luftröhre eindringt, was die Atmung und auch den Anästhesieprozess behindert.

Als nächstes bereiten wir die Bildgebungskammer vor. Zuerst verteilen wir eine sehr dünne Schicht Öl auf das untere Element der Kammer. Dann legen wir die Larven auf diesen Ölfilm.

Hier ist darauf zu achten, dass die Enden nicht mit dem Öl in Berührung kommen. Einmal positioniert, platzieren wir hier ein Abstandsgitter auf den Larven. Wichtig ist, dass die drei Kanäle nach oben zeigen und so Luft zu den Larven bringen können und nicht mit Öl verstopfen.

Wir legen nun einen Deckschirm auf den Abstandshalter und prüfen, ob die Larve richtig positioniert ist. Das heißt, die ventrale Seite zeigt nach unten und die tracheale dorsale Seite, wo wir die Luftröhre sehen können, zeigt nach oben. Jetzt setzen wir den adaptiven Kunststoffring sowie einen Metallring ein, um sicherzustellen, dass die Lava sanft zwischen die beiden Glasrutschen gedrückt wird.

Nun schließen wir die Bildgebungskammer und stellen sie an das konfokale Mikroskop heran, um mit der Bildgebung zu beginnen. Nun platzieren Sie die Bildgebungskammer mit den montierten Larven. Zusätzlich zu unserem konfokalen Mikroskop.

Aus der Bildgebungskammer treten drei Röhren heraus. Man wird an das Narkosemittel Dis Fluor gebunden. Eines ist ein Auslassrohr und das letzte Rohr lässt frische Luft an die Larven gelangen.

Nach dem Anschließen der Larvenkammer an das Betäubungsgerät ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Larve richtig positioniert ist. Yao lässt dann über die Pumpe Luft in das Narkosesystem gelangen. Zu diesem Zeitpunkt ist es wichtig sicherzustellen, dass der Druck in der Kammer den empfohlenen Höchstdruck nicht überschreitet.

Dann steckt er den Auslassschlauch ins Wasser, um sicherzustellen, dass der Luftstrom vorhanden ist. Die Blasen in der Wasserflasche zeigen den Luftstrom. Er öffnet nun langsam das Ventil und lässt das Fluor kurz durch die Schläuche strömen.

Nach der Erstnarkose ist es wichtig zu überprüfen, wie die Lava reagiert. Wenn das Herz noch schlägt, ist es notwendig, eine stärkere Anästhesie durchzuführen, wie man sehen kann. Hier im nächsten Abschnitt zeigen wir Ihnen die Lava unter dem Mikroskop.

Jetzt können wir den kritischen Teil des Anästhesieprozesses vom Mikroskop aus sehen. Anfangs sind die Bewegungen der Larven zu sehen, wobei sich die Muskeln weiter zusammenziehen. Sobald sich die Bewegungen zu verlangsamen beginnen, scannt ya die Larven auf und ab und beobachtet die Betäubung.

Die Bewegungen verlangsamen sich und hören schließlich auf. Nach der Anwendung mehrerer Anästhesieimpulse können wir sehen, dass die Lava aufgehört hat, sich zu bewegen, und die einzige Bewegung, die man sieht, ist auf Veränderungen am Mikroskop zurückzuführen. Um das Ausmaß der Anästhesie zu bestimmen, ist es wichtig, den Herzschlag zu überprüfen.

He yao konzentriert sich tief in die Lava, wo vor allem der fette Körper zu sehen ist. Wichtig ist, dass die Region, die das Herz umgibt, zu sehen ist und es offensichtlich ist, dass der Herzschlag gestoppt wurde und die Larven somit für die Bildgebung bereit sind. Eine große Schwierigkeit bei der In-vivo-Bildgebung ist die Identifizierung der neuromuskulären Verbindung, an der Sie interessiert sind.

Um Ihnen dabei zu helfen, zeigen wir Ihnen, wie es aussieht, wenn Sie die Larven durchscannen. Dann sehen Sie eine neuromuskuläre Verbindung, die wir in der Regel für die Bildgebung verwenden. Nun fangen wir an, uns langsam auf die Larven zu konzentrieren.

Beginnend an der Hautoberfläche sehen Sie, wie einige Muskeln auftauchen und verschwinden. Einige davon sind hervorgehoben. Der Film zeigt ein künstliches Fusionskonstrukt, das die CD-8-Transmembrandomäne GFP und die C-terminale Region des Eisenkanal-Shaker-Proteins enthält.

Dieses Konstrukt ist an allen Muskelmembranen lokalisiert und zeigt eine erhöhte Präsenz an der neuromuskulären Verbindung. Wir spielen den Film jetzt langsamer ab und mit Hilfe von Abbildung zwei und drei können Sie einzelne Muskeln identifizieren, wie sie auftauchen und verschwinden. Während diese Fliegen besonders nützlich sind, um die In-vivo-Bildgebung zu lernen, verwenden wir im Allgemeinen Larven, die Marker exprimieren und nur postsynaptische oder präsynaptische Regionen der Synapse markieren.

Da diese nicht die gesamte Muskeloberfläche markieren, ist es bei Larven viel schwieriger, die gleiche Position zu identifizieren. In diesem Film zeigen wir RFP-Tag-Glutamatrezeptoren. Der Film zeigt uns, wie wir uns auf das Gitter konzentrieren und einzelne neuromuskuläre Verbindungen hervorheben.

Wir zeigen den Film noch einmal langsamer und Sie können die einzelnen neuromuskulären Verbindungen anhand von Abbildung vier identifizieren, um Ihnen zu helfen. Jetzt haben wir die Theorie. Wir zeigen Ihnen ein Beispiel aus der Praxis.

Wir konzentrieren uns nun auf die neuromuskuläre Verbindung 27 in unserem MHC CD 8 GFP-Shaker, der Larven exprimiert. Nachdem wir den Digitalzoom erhöht haben, positionieren wir die neuromuskuläre Verbindung neu und bewegen uns dann in C-Richtung in den zentralen Bereich, um sicherzustellen, dass die Larven richtig positioniert sind und wir keine über- oder ungesättigten Pixel haben. Sie können die übersättigten Pixel in Rot sehen und im Vergleich dazu werden alle ungesättigten Pixel in Blau angezeigt.

Wir reduzieren die Laserleistung und scannen erneut. Wir haben jetzt eine entsprechende Verstärkung und Laserstärke und somit keine übersättigten Bereiche mehr. Nun ist es wichtig, die Position des neuromuskulären Übergangs in C-Richtung zu markieren.

Zuerst markieren wir die untere Scanposition und dann die obere Scanposition, um eine genaue Aufzeichnung des gesamten CST-Stacks zu ermöglichen. Wir verwenden in der Regel eine Pixelgröße von 100 Nanometern mal 100 Nanometern und der Abstand in C beträgt 500 Nanometer. Wenn wir nicht vorhaben, die Dekonvolution nach der Bildgebung abzuschließen, um unsere Bilder zu verarbeiten, werden die Verstärkungen auf ein angemessenes Niveau eingestellt, um Rauschen zu vermeiden, aber auch die Verwendung einer schwächeren Laserstärke zu ermöglichen, um das Ausbleichen zu minimieren, sobald der CST-Stack fertig ist.

Die neuromuskuläre Verbindung, die das M-H-C-C-D-H-Shaker-GFP-Konstrukt exprimiert, ist korrekt aufgezeichnet. Im folgenden Abschnitt schließen wir einen ähnlichen Prozess ab, der sich auf die Glutamatrezeptoren konzentriert. Um die RFP-Tag-Glutamatrezeptoren zu erfassen, fokussieren wir erneut durch die Kutikula und sehen nun die einzelnen neuromuskulären Verbindungen in Segment A drei.

Nachdem wir die rechte neuromuskuläre Verbindung vergrößert haben, positionieren wir sie wieder in die Mitte des Sichtfeldes. Wie bisher müssen wir sicherstellen, dass wir keine über- oder ungesättigten Pixel haben. Auch hier zeigt sich, dass einige der Pixel übersättigt sind und so passen wir die Einstellungen an und führen einen weiteren Testscan durch.

Die Verstärkungen in der Laserleistung werden nun korrekt angepasst. Es ist jetzt wichtig, die CST-Stack-Limits festzulegen, indem Sie die obere Position identifizieren und überprüfen, und dann die untere Position. Wir können nun damit beginnen, die einzelnen Ebenen der neuromuskulären Verbindung zu scannen.

Es ist wichtig, einige leere Scans von Abschnitten direkt unter und über der neuromuskulären Verbindung zu machen, um zu verhindern, dass einige dort positionierte Synapsen übersehen werden. Nachdem die Konfokale den Scanvorgang abgeschlossen haben, projizieren wir die neuromuskuläre Verbindung, um ein typisches Ergebnis zu sehen, das in der In-vivo-Bildgebung erzielt wird. Es ist wichtig, dieses Bild für den Vergleich mit Scans aufzubewahren, die zu späteren Zeitpunkten durchgeführt wurden, um die neuromuskuläre Verbindung wieder zu identifizieren und Veränderungen wie neue Synapsen oder synaptische Stäbe zu identifizieren.

Nach erfolgreicher Bildgebung. Es ist wichtig, die Lava schnell zu wecken und schnell aus der Bildgebungskammer zu entfernen. Yao ist gerade dabei, dies zu vollenden, während er die Lava ständig überwacht, er stellt das Betäubungsgerät so ein, dass frische Luft und nicht nur Fluor durch das System zirkuliert.

Er platziert nun den Auslass der Kammer ins Wasser und die Luftblasen zeigen, dass Luft durch das System strömt. Er überwacht die Larven kontinuierlich, um sicherzustellen, dass der Herzschlag wieder beginnt zu schlagen und die Larven aufwachen. Ähnlich wie bei der Betäubung ist es am besten, die Larven mit mehreren Luftimpulsen zu versorgen, um ein erfolgreiches Aufwachen zu gewährleisten.

Wir können jetzt durch das Mikroskop sehen, was du tut. Wir können sehen, wie er Luft auf das System aufbringt. In der Kammer werden Druckänderungen erzeugt, die bei den Larven künstliche Bewegungen auslösen.

Schließlich beginnen sich die Larven von selbst zu bewegen, und dies zeigt sich am besten in der Initiierung von Herzbewegungen, und so konzentrieren wir uns auf die Lava, damit wir diese Bewegungen klarer sehen können. Die rhythmischen Schläge sind zu sehen, die ein erfolgreiches Aufwachen der Larven zeigen. Nach dem erfolgreichen Aufwecken der Larven ist es wichtig, sie aus der Bildgebungskammer zu bergen.

Die Larven befinden sich im unteren Teil der Kammer, so dass die Oberseite zur Seite gelegt wird. Yara entfernt das Metallgewicht und die Kunststoffabdeckung. Dann wird der Abdeckschieber entfernt und anschließend der Kunststoffabstandshalter mit den Larven.

Vorsichtig löst er mit der Bürste die Larven aus dem Kunststoff-Abstandshalter. Dann taucht er es kurz in Wasser und trocknet es, um überschüssiges Öl zu entfernen. Die Lava wird nun in etwas vorzerkleinertes Futter gelegt und dort belassen, bis sie wieder benötigt wird.