Name: In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Lernen Sie die Anästhesie und In-vivo-Imaging von Drosophila melanogaster Larven mit Desfluran zur Untersuchung synaptischer Dynamik über mehrere Tage. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung neuromuskulärer Verbindungen mit 95% Überlebensrate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Andreas Schönle, Max-Plank-Institut für biophysikalische Chemie, Deutschland und David J. Sandström, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA für die technische Beratung. Wir bedanken uns bei Frank Kötting, European Neuroscience Institute, Göttingen für den Bau der Bildgebung Kammer und die Betäubung Gerät. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Alzheimer Forschung Initiative zu TMRYZ unterstützt durch ein Stipendium des China Scholarship Council, SBH durch ein Stipendium der Graduate School for Cellular and Molecular Neuroscience, University of Tübingen unterstützt.

A) Montage der Bildgebung Kammer <ol><li> Wählen Sie eine Larve der gewählten Stufe (zB frühe 3 rd Larvenstadium verlassen eine Beobachtung im Abstand von ca. 24 Stunden bei 25 ° C bis wandernde Stufe). </li><li> Spülen Sie die Larve mit Wasser, um es von dem Kulturmedium und tupfen sie trocken zu reinigen. </li><li> Bestreichen Sie die Mitte der unteren Element der Kammer, die Region um die Larve Gesicht, mit einem dünnen Film von Halocarbonöl. </li><li> Legen Sie die Larve mit der Bauchseite mit Blick auf den Mikroskop-Objektiv in der Kammer (ermöglicht neuromuskulären Synapse (NMJ) 26 und 27 werden abgebildet) (Abbildung 1 AE). </li><li> Legen Sie die Kunststoffscheibe auf die Ölschicht mit den Luftschlitzen des Netzes nach oben zeigen (Abbildung 1 A). Bitte überprüfen Sie bei diesem Schritt: Die Höhe der Spacer ist etwa die Hälfte der Larven Durchmesser sollte die Breite des Schlitzes etwa das Doppelte des Durchmessers der Larve werden. </li><li> Legen Sie die Imaging-Kammer unter dem Mikroskop </li></ol> B) Betäubung der Larve <ol start="7"><li> Verbinden Sie die beiden Eingänge der Kammer mit einem geeigneten Gerät Betäubung / Verdampfer. Bitte überprüfen Sie up-front: Die effektive Konzentration von Desfluran in den Raum-Luft sollte nie mehr als die von Sicherheitsvorschriften angegeben! Nur ein sehr kleiner Gesamtvolumen von Desfluran ist notwendig, um Larven zu betäuben. Die Anwendung von 15% (v / v) von Desfluran 1 hat sich als guter Ausgangspunkt für die Bestimmung der idealen Konzentration, die in einem Experiment verwendet werden. Aus Sicherheitsgründen empfehlen wir, dass der Verdampfer sollte nie enthalten mehr Desfluran als für 2-4 Stunden in-vivo-Bildgebung erforderlich. </li><li> Tauchen Sie das andere Ende des Schlauches an der Kammerauslass in einem Glas Wasser, dann öffnen die Ventile steuern den Fluss des Anästhetikums in die Kammer für etwa fünf Sekunden. Bitte überprüfen Sie bei diesem Schritt: Sie Luftblasen aufsteigen in das Wasser? Wenn nicht die Kammer undicht. </li><li> Schließen Sie die Ventile für etwa drei Sekunden. </li><li> Monitor verbleibende Larven Bewegungen in das Mikroskop. Überprüfen Sie beide den Herzschlag und Muskelbewegungen. Bei Bedarf öffnen und Schließen von Ventilen, wie in Schritt 8 und 9 beschrieben, bis die Betäubung der Larve abgeschlossen ist, schließen Sie alle Ventile und starten Bildgebung. Bitte überprüfen Sie bei diesem Schritt: Residual Muskelbewegungen oder Herzschlag zeigt an, dass die Larve nicht richtig betäubt. Komplette Betäubung ist für Bilder mit hoher Auflösung. Die Larve ist in der Regel nicht länger als 15-20 Minuten narkotisiert zu einem bestimmten Zeitpunkt. </li></ol> C) Imaging <ol start="11"><li> Identifizieren Sie die richtige Position und das Image der interessierenden Struktur (Abb. 2-4). </li></ol> D) Erholung von Betäubung <ol start="12"><li> Nach der Bebilderung abgeschlossen ist lassen Sie Luft in die Kammer. Bitte überprüfen Sie bei diesem Schritt: Überprüfen Sie Herzschlag und Muskelkontraktionen der Larve durch übertragen Halogenlicht. Da Muskeln Auftraggeber Start ist es sicher, die Larve aus dem Imaging-Kammer zu entfernen. </li><li> Lösen Sie die Kammer von der Betäubung Gerät und entfernen Sie sie aus dem Mikroskop. Demontieren Sie die Kammer vorsichtig und platzieren Sie die Larve in püriert fliegen Kultivierungsmedium. </li><li> Bewahren Sie die Schüssel in einem Brutschrank bei der entsprechenden Temperatur. </li></ol> E) Zeitreihe <ol start="15"><li> Wiederholen Sie die Schritte 2-14, bis genügend Zeit Punkte erhalten worden sind. Alternative-Protokoll: Wenn die Larve ist es, mehr als einmal innerhalb von 30 Minuten-Intervall abgebildet werden es sinnvoll ist, um es in der Imaging-Kammer zu verlassen, bis der nächste Betäubung Zeitpunkt. Wiederholen Sie die Schritte 7-14, bis genügend Zeit Punkte erhalten worden sind. Bitte überprüfen Sie bei diesem Schritt: Die Larve ist nicht in der Imaging-Kammer für mehr als zwei Stunden zu einer Zeit gehalten werden, noch ist es zu betäubende länger als 15-20 Minuten zu einer Zeit. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Versammlung der Bildgebung Kammer. (A) Setzen Sie die Larve und die Kunststoff-Abstandhalter auf der Ölschicht. (B) Legen Sie eine 22 x 22 mm Deckglas auf dem Abstandshalter und setzen Sie das Plexiglas Führungsring in die Kammer, in der Nähe (C) fixieren die Lage der Larve mit dem Metallring und (D) nahe der Kammer. (E) Nun wird die Kammer bereit, auf das Mikroskop angebracht werden. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Body-Wand Muskeln in Drosophila-Larven. Muskeln und NMJs wurden durch Ausdruck einer CD8-GFP-Sh Fusionsprotein 8. Die Muskeln sind dargestellt als beobachtet werden, wenn der Schwerpunkt auf der Bauchseite durch die Kutikula in die Larve. In (AC) der oberflächlichen Muskulatur, 27, wird gezeigt, in (KL) den Innenraum Muskeln, 6 und 7 dargestellt. Scale-Bar: 100 pm, ist DELTA Z zwischen den Schichten 2 um. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 Identität von Körper-Wand Muskeln in Drosophila-Larven. Die Identität der Muskeln in L3 Drosophila-Larven-, Segment-A3, wird angezeigt. Muskeln und NMJs wurden durch Ausdruck einer CD8-GFP-Sh Fusionsprotein 8. Die Muskeln werden angezeigt, wie beobachtet werden, wenn der Schwerpunkt auf der Bauchseite durch die Kutikula in die Larven. In AC die oberflächlichen Muskeln, 27, wird gezeigt, in KL den Innenraum Muskeln, 6 und 7 dargestellt. Maßstab: 100 um, DELTA Z zwischen den Schichten ist 2 um. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4 Identität des neuromuskulären Synapsen von Drosophila-Larven. (AD) NMJs wurden durch die Expression eines DGluRIIA-mRFP fusion protein 1. Die NMJs gezeigt, wie beobachtet werden, wenn der Schwerpunkt auf der Bauchseite durch die Kutikula in die Larve. In (AB) die oberflächliche NMJ, 27, wird gezeigt, in CD den Innenraum NMJs, 6 und 7, gezeigt. Maßstab: 100 um, DELTA Z zwischen den Schichten ist 5 um. (E) und (F) die Identität des oberflächlichen (E) und Innenraum (F) NMJs ist nur zur Information angegeben.

<ol><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li>
<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+vivo+imaging+of+long-term+changes+in+the+Drosophila+neuromuscular+system+%5B%5D%22">In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]</a>. , Georg-August-University Göttingen. (1988).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &amp, Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
</ol>

Die vorgestellte Methode wurde ursprünglich entwickelt, um glutamatergen Synapsen auf den Körper Wand Muskeln Drosophila melanogaster Larven zu studieren. Die Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ) wird durch eine stereotype Zyto-Architektur der Muskeln und Neuronen aus und ist damit ideal für den in-vivo-Bildgebung geeignet. Allerdings ist die beschriebene Betäubung Protokoll nicht zu bildgebenden die NMJ begrenzt; die Transparenz der Drosophila-Larven erleichtert die Anpassung der beschriebenen Protokoll, um die Entwicklung von Organen Studie, die Migration von Zellen, den Transport von Fracht-und axonalen sub-zellulären Reorganisation innerhalb der Zellen.

Reagenzien: <ul><li> Desfluran (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Deutschland) </li><li> Halocarbonöl (zB Voltalef H10S Öl / Atofina, Puteaux, Frankreich) </li><li> Fly Kulturmedium </li></ul> Ausstattung: <ul><li> Inverted konfokalen Mikroskop </li><li> Binokulares Mikroskop (zB Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Deutschland) </li><li> Kleine Pinsel als zur Art fliegt </li><li> Inkubator </li><li> Maßarbeit Bildgebung Kammer (Für mechanische Zeichnungen sehen Ref. 3) </li><li> Vaporizer / Betäubung Gerät (für Details siehe Lit.. 3) </li></ul>

in-vivo-imaging von intact drosophila-larven auf subzellulärer auflösung

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Die jüngsten Verbesserungen in der optischen Bildgebung, genetisch kodierte Fluorophore und genetische Werkzeuge, die eine effiziente Einrichtung von gewünschten transgenen Tier Linien aktiviert haben biologischer Prozesse im Rahmen eines lebenden studiert werden, und in einigen Fällen sogar zu verhalten, Organismus. In diesem Protokoll werden wir beschreiben, wie intakt Drosophila-Larven, mit dem volatilen Anästhetika Desfluran, um die Entwicklung und Plastizität der synaptischen Populationen subzellulärer Auflösung 1-3 folgen zu betäuben. Während andere nützliche Methoden, um Drosophila melanogaster Larven betäuben wurden bisher 4,5,6,7,8 beschrieben, zeigt das Protokoll hier vorgestellte signifikante Verbesserungen aufgrund der folgenden kombiniert die wichtigsten Funktionen: (1) Ein sehr hohes Maß an Betäubung, auch die Herzschlag wird verhaftet Berücksichtigung lateralen Auflösung von bis zu 150 nm 1, (2) eine hohe Überlebensrate von&gt; 90% pro Zyklus Betäubung, erlaubt die Aufnahme von mehr als fünf Zeitpunkten über einen Zeitraum von Stunden bis Tagen 2 und ( 3) eine hohe Empfindlichkeit ermöglicht uns in 2 Fällen zur Untersuchung der Dynamik von Proteinen in physiologischen Konzentrationen ausgedrückt. Im Einzelnen konnten wir die postsynaptische Glutamat-Rezeptor-Untereinheit GluR-IIA über den endogenen Promotor 1 in stabilen transgenen Linien und der Exon-trap line FasII-GFP 1 ausgedrückt zu visualisieren. (4) Im Gegensatz zu anderen Methoden 4,7 können die Larven nicht nur lebendig abgebildet werden, sondern auch intakte (dh nicht seziert) ermöglicht Beobachtung über mehrere Tage 1 auftreten. Das dazugehörige Video Details der Funktion der einzelnen Teile der in-vivo-Bildgebung Kammer 2,3, die korrekte Montage der Larven, die Betäubung Verfahren, wie re-identifizieren bestimmte Positionen innerhalb einer Larve und die sichere Entfernung der Larven aus der Bildgebung Kammer.

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Betäubung und Bildgebung von intakten<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larven. Wir nutzten die volatilen Anästhetika Desfluran, um für sich wiederholende Bildgebung bei sub-zellulärer Auflösung und Re-Identifizierung von Strukturen für bis zu ein paar Tagen ermöglichen<sup&gt; 1</sup&gt;.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Jüngste Fortschritte in der optischen Bildgebung, genetisch kodierte Fluorophore sowie genetische Werkzeuge, die eine effiziente Etablierung gewünschter transgener Tiere ermöglichen ...

Durchbrüche in der optischen Bildgebung und bei genetisch kodierten Fluoreszenzsonden haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die biologischen Prozesse, die sie interessieren, in lebenden Organismen und in einigen Fällen sogar in verhaltenden Organismen zu untersuchen. Während bisher großer Schwerpunkt auf der Untersuchung des Säugetiergehirns in vivo lag, verwendet unser Labor ein relativ einfaches Modellsystem, die neuromuskuläre Endplatte von Drosophila, und im folgenden Video erklären wir, wie man Fruchtfliegenlarven anästhesiert und bildlich erfasst, um die Entwicklung einzelner Synapsen über einen Zeitraum von Stunden bis hin zu Tagen zu verfolgen, als Methode zur Untersuchung der Entwicklung von Nervengewebe. Obwohl bereits Verfahren existieren, zeichnet sich das hier vorgestellte und präsentierte Protokoll zur Bildaufnahme durch die folgenden Schlüsseleigenschaften aus.Zunächst wird durch einen sehr hohen Grad der Analgese sogar der Herzschlag angehalten, was für eine hohe Bildqualität unerlässlich ist. Zweitens durch eine Überlebensrate von 95 % und die Fähigkeit, sehr empfindliche Bilder aufzuzeichnen. Das folgende Protokoll ermöglicht es uns beispielsweise, die Dynamik von mit GFP markierten Glutamatrezeptoren zu untersuchen, die durch ihre endogenen Promotoren auf physiologischem Niveau exprimiert werden.Sie lernen nun, wie man die Larven in die Bildgebungskammer einsetzt, wie man die Frucht für die Larven anästhesiert, wie man eine bestimmte Position innerhalb der Larven findet, um die Sign-up-Treppe abzubilden, und anschließend auch, wie man die Larven nach der Bildgebung wieder zurückgewinnt. Vor der In-vivo-Bildgebung ist es wichtig, die Larven zu waschen. Obwohl dieser Vorgang einfach ist, muss darauf geachtet werden, die Larven nicht zu beschädigen; daher dürfen sie niemals mit einer Pinzette bewegt werden.Stattdessen entscheiden wir uns für sanfte Bewegungen mit einem Pinsel. Das zum Waschen verwendete Wasser hat Zimmertemperatur und ist einfach normales Leitungswasser, das nicht destilliert ist und keine Reinigungsmittel enthält. Wir können Sie sehen.Er bewegt die Larven vorsichtig aus der Nahrung heraus und in frisches Leitungswasser, um gute Ergebnisse zu erzielen. Es ist außerdem entscheidend, die Larven so kurz wie möglich im Wasser zu halten. Dies verhindert, dass Wasser in ihre Tracheen eindringt, was die Atmung sowie den Betäubungsprozess beeinträchtigen würde.Dann bereiten wir die Abbildungskammer vor. Zunächst verteilen wir eine sehr dünne Ölschicht auf dem unteren Element der Kammer. Anschließend platzieren wir die Larven auf diesem Ölfilm.Es ist wichtig, darauf zu achten, dass die Ränder Ihrer Abdeckung das Öl nicht berühren. Nach der Positionierung bringen wir hier ein Abstandsgitter auf den Larven an. Es ist wichtig, dass die drei Kanäle nach oben zeigen und somit eine Belüftung der Larven ermöglichen, sodass sie nicht mit Öl verstopfen.Wir legen nun ein Deckglas auf den Abstandshalter und überprüfen, ob die Larve korrekt positioniert ist, das heißt, die ventrale Seite zeigt nach unten und die dorsale Seite mit den nach oben zeigenden Tracheenenden, sodass wir die Tracheen sehen können. Anschließend setzen wir einen plastischen Anpassungsring sowie einen Metallring auf, um sicherzustellen, dass die Larve gleichmäßig zwischen den beiden Glasobjektträgern oben festgedrückt wird.Wir schließen nun die Bildgebungskammer und bringen sie zum konfokalen Mikroskop, um mit der Aufnahme zu beginnen. Nun platziert man die Bildgebungskammer mit den montierten Larven auf dem konfokalen Mikroskop.Es gibt drei Schläuche, die aus der Bildgebungskammer herausführen. Einer ist mit dem Betäubungsmittel Disfluoran verbunden. Ein weiterer ist ein Auslassschlauch, und der letzte Schlauch ermöglicht es frischer Luft, die Larven zu erreichen.Nachdem die Larvenkammer mit der Betäubungsvorrichtung verbunden wurde, ist es wichtig sicherzustellen, dass die Larve korrekt positioniert ist. Yao lässt anschließend Luft über die Pumpe in das Betäubungssystem einströmen. Zu diesem Zeitpunkt ist darauf zu achten, dass der Druck in der Kammer den maximal empfohlenen Wert nicht überschreitet.Er steckt dann das Auslassrohr ins Wasser, um sicherzustellen, dass Luftstrom vorhanden ist. Die Bläschen in der Wasserflasche zeigen den Luftstrom an. Nun öffnet er langsam das Ventil und lässt kurzzeitig Disfluor durch die Schläuche strömen.Nach der initialen Anästhesierung ist es wichtig zu überprüfen, wie die Larve reagiert. Wenn der Herzschlag noch vorhanden ist, muss, wie hier zu sehen ist, eine weitere Anästhesierung durchgeführt werden. Im nächsten Abschnitt zeigen wir Ihnen die Larve unter dem Mikroskop.Nun können wir den entscheidenden Teil des Betäubungsvorgangs durch das Mikroskop beobachten. Anfangs sind die Bewegungen der Larven erkennbar, wobei die Muskeln weiterhin kontrahieren. Sobald sich die Bewegungen verlangsamen, fährt ya entlang der Larven und beobachtet den Fortschritt der Betäubung.Die Bewegungen verlangsamen sich und stoppen schließlich. Nach der Applikation mehrerer Anästhetisierungsimpulse sehen wir, dass sich die Larve nicht mehr bewegt und die einzigen sichtbaren Bewegungen auf Änderungen am Mikroskop zurückzuführen sind. Um den Grad der Anästhetisierung zu bestimmen, ist es wichtig, den Herzschlag zu überprüfen.He yao fokussiert tief in die Lava hinein, wo hauptsächlich der fette Körper sichtbar ist. Wichtig ist, dass die Region um das Herz herum erkennbar ist und deutlich wird, dass der Herzschlag angehalten wurde, sodass die Larve bereit für die Bildaufnahme ist. Eine große Schwierigkeit bei der In-vivo-Bildgebung besteht in der Identifizierung der neuromuskulären Verbindung, die Sie untersuchen möchten.Um Ihnen dabei zu helfen, zeigen wir, wie es aussieht, wenn Sie durch die Larven scannen. Dann können Sie eine neuromuskuläre Verbindung sehen, die wir üblicherweise für die Bildgebung verwenden. Nun beginnen wir langsam, in die Larven hinein zu fokussieren.Ausgehend von der Cuticula-Oberfläche werden Sie einige Muskeln sehen, die erscheinen und wieder verschwinden. Einige dieser Muskeln sind hervorgehoben. Der Film zeigt einen künstlichen Fusionskonstrukt, der die Transmembrandomäne CD acht, GFP sowie den C-terminalen Bereich des Eisenkanal-Shaker-Proteins enthält.Dieser Konstrukt lokalisiert sich an allen Muskelmembranen und zeigt eine erhöhte Präsenz an der neuromuskulären Verbindung. Wir werden nun den Film langsamer abspielen, und mithilfe der Abbildung zwei und drei können Sie einzelne Muskeln erkennen, während sie erscheinen und verschwinden. Obwohl diese Fliegen besonders nützlich sind, um in-vivo-Bildgebung zu erlernen, verwenden wir im Allgemeinen Larven, die Marker exprimieren, die ausschließlich postsynaptische oder präsynaptische Bereiche der Synapse markieren.Da diese nicht die gesamte Muskelfläche markieren, ist es bei Larven viel schwieriger, dieselbe Position zu identifizieren. In diesem Film zeigen wir RFP-markierte Glutamatrezeptoren. Der Film zeigt, wie wir in das Präparat hineinfokussieren, und wir haben einzelne neuromuskuläre Verbindungen hervorgehoben.Wir zeigen den Film erneut langsamer, und Sie können die einzelnen neuromuskulären Junctionen mithilfe von Abbildung vier identifizieren. Nun haben wir die Theorie. Wir werden ein praktisches Beispiel demonstrieren.Wir konzentrieren uns nun auf die neuromuskuläre Verbindung 27 in unseren MHC CD acht GFP Shaker exprimierenden Larven. Nachdem wir die digitale Vergrößerung erhöht haben, positionieren wir die neuromuskuläre Verbindung neu und bewegen uns dann in C-Richtung in den zentralen Bereich, um sicherzustellen, dass die Larve korrekt positioniert ist und keine über- oder unterbelichteten Pixel vorliegen. Sie können die überbelichteten Pixel in Rot erkennen, während unterbelichtete Pixel vergleichsweise in Blau dargestellt werden.Wir reduzieren die Laserleistung und scannen erneut. Nun haben wir eine geeignete Verstärkung und Laserintensität, sodass keine überbelichteten Bereiche mehr vorhanden sind. Es ist nun wichtig, die Position der neuromuskulären Junction in Richtung C zu markieren.Zunächst markieren wir die untere Scan-Position und anschließend die obere Scan-Position, um die exakte Aufnahme des gesamten CST-Stapels zu ermöglichen. Üblicherweise verwenden wir eine Pixelgröße von 100 Nanometern mal 100 Nanometern und einen Abstand in C von 500 Nanometern. Falls wir nach der Bildaufnahme keine Entfaltung zur Bildverarbeitung durchführen möchten, werden die Verstärkungen auf ein geeignetes Niveau eingestellt, um Rauschen zu vermeiden, gleichzeitig aber eine schwächere Laserintensität nutzen zu können, um die Bleiche minimieren, sobald der CST-Stapel abgeschlossen ist.Die neuromuskuläre Endplatte, die den M-H-C-C-D-H-Shaker-GFP-Konstrukt exprimiert, wird korrekt aufgezeichnet. Im folgenden Abschnitt führen wir einen ähnlichen Prozess durch, der sich nun auf die Glutamatrezeptoren konzentriert. Um die mit einem RFP-Marker versehenen Glutamatrezeptoren aufzuzeichnen, fokussieren wir erneut durch das Cuticula und betrachten nun die einzelnen neuromuskulären Endplatten im Segment A drei.Nachdem wir die richtige neuromuskuläre Verbindung vergrößert haben, positionieren wir sie erneut in die Mitte des Sichtfeldes. Wie zuvor müssen wir sicherstellen, dass keine über- oder unterbelichteten Pixel vorhanden sind. Erneut zeigt sich, dass einige der Pixel überbelichtet sind, weshalb wir die Einstellungen anpassen und einen weiteren Testscan durchführen.Die Verstärkungen der Laserleistung sind nun korrekt eingestellt. Als Nächstes ist es wichtig, die CST-Stapelgrenzen festzulegen, indem zunächst die obere Position identifiziert und überprüft wird, gefolgt von der unteren Position. Nun können wir mit dem Scannen der einzelnen Ebenen der neuromuskulären Verbindung beginnen.Es ist wichtig, einige Leerscans von Bereichen direkt unterhalb und oberhalb der neuromuskulären Junction durchzuführen, um sicherzustellen, dass keine dort lokalisierten Synapsen übersehen werden. Nachdem die Konfokalmikroskope das Scannen abgeschlossen haben, projizieren wir die neuromuskuläre Junction, um ein typisches Ergebnis der In-vivo-Bildgebung zu betrachten. Dieses Bild sollte zur späteren Gegenüberstellung mit Scans zu nachfolgenden Zeitpunkten aufbewahrt werden, damit die neuromuskuläre Junction erneut identifiziert und Veränderungen wie neue Synapsen oder synaptische Batons erkannt werden können.Nach der erfolgreichen Bildgebung ist es wichtig, das Lavamaterial schnell zu reaktivieren und rasch aus der Bildgebungskammer zu entfernen. Yao führt dies nun durch, während er das Lavamaterial kontinuierlich überwacht, und stellt die Anästhesievorrichtung so ein, dass frische Luft statt nur Fluor durch das System zirkuliert.Er bringt nun den Auslass der Kammer ins Wasser, und die Luftblasen zeigen, dass Luft durch das System strömt. Er überwacht die Larven kontinuierlich, um sicherzustellen, dass der Herzschlag wieder einsetzt und die Larve aufwacht. Ähnlich wie beim Betäubungsvorgang ist es am besten, den Larven mehrere Luftstöße zuzuführen, um ein erfolgreiches Aufwachen zu gewährleisten.Wir können nun durch das Mikroskop beobachten, was ya tut. Wir sehen, wie er Luft an das System anlegt. Im Kammerinneren entstehen Druckänderungen, die künstliche Bewegungen in den Larven hervorrufen.Schließlich beginnt die Larve, sich selbstständig zu bewegen, was sich am besten an der Einleitung von Herzbewegungen zeigen lässt. Daher fokussieren wir uns auf die Larve, um diese Bewegungen klarer erkennen zu können. Die rhythmischen Schläge sind sichtbar und zeigen ein erfolgreiches Aufwachen der Larve an. Nachdem die Larve erfolgreich aufgewacht ist, ist es wichtig, sie aus der Abbildungskammer zu entnehmen.Die Larve befindet sich im unteren Bereich der Kammer, daher wird die obere Abdeckung zur Seite gestellt. Yara entfernt das Metallgewicht und die Kunststoffabdeckung. Anschließend wird die Deckglasplatte entfernt und danach der Kunststoffabstandshalter mit der Larve.Er entfernt die Larven vorsichtig mit dem Pinsel vom Kunststoffabstandshalter. Anschließend taucht er diesen kurz in Wasser und trocknet ihn ab, um überschüssiges Öl zu entfernen. Die Larve wird nun in etwas vorgewalztes Futter gelegt und dort belassen, bis sie erneut benötigt wird.

in-vivo-imaging-of-intact-drosophila-larvae-at-sub-cellular-resolution

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie arbeitet darüber hinaus das Eindringen Grenzen der Gewebe-Schnitte Fluoreszenzmikroskopie. Die Technik basiert auf Multi-Projektion Beleuchtung und ein Photon Transport Beschreibung basiert. Wir zeigen in-vivo Ganzkörper-3D-Visualisierung der Morphogenese von GFP-exprimierenden Flügel Imaginalscheiben...

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie ermöglicht.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Hier wird ein Protokoll zur Mikroinjektion und gleichzeitigen Abbildung mehrerer Drosophila-Embryonen während der embryonalen Entwicklung mit einem plattenbasierten, hochinhaltigen Imager vorgestellt.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Implementierung der Expansionsmikroskopie in frühen Drosophila-Embryonen vorgestellt, um eine hochauflösende Bildgebung mit einem konventionellen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop zu erreichen.

Verwendung von Expansionsmikroskopie zur physikalischen Vergrößerung ganzer Drosophila-Embryonen für hochauflösende Bildgebung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Live-Bildgebung der asymmetrischen Teilung von Keimbahnstammzellen (GSCs) in der ovariellen Nische von Drosophila durchzuführen. Wir verwenden eine transgene Linie, die ubiquitär eine grün fluoreszierende Protein (GFP)-Fusion des Spektrosomproteins Par-1 exprimiert.

Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen

Lernen Sie die Anästhesie und In-vivo-Imaging von Drosophila melanogaster Larven mit Desfluran zur Untersuchung synaptischer Dynamik über mehrere Tage. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung neuromuskulärer Verbindungen mit 95% Überlebensrate.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Weitere Videos entdecken