Name: Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen. Diese Methode nutzt mechanische und enzymatische Gewebedissoziation sowie Antikörper-gekoppelte magnetische Beads zur Reinigung.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch American Heart Association gewähren 0950118G.to MC-W unterstützt.

1. Vorbereitung anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierten magnetischen Beads (Dynabeads) <ol><li> Bereiten Sie 0,1% BSA in PBS durch Mischen von 50 mg BSA in 50 ml PBS mit einem Vortex bis BSA auflöst. Sterilisieren durch Filtration durch 0,22 um Spritzenfilter. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> In den TC Kapuze, Transfer 200 ul gut resuspendiert Schaf-anti-Ratte IgG Dynabeads in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und waschen Sie die Perlen: Mount Tube auf MPC und lassen Sie sich für etwa 1 min bis die Perlen in das Sediment zu ermöglichen. Saugen Sie den Überstand, entfernen Sie den Schlauch vom MPC und Resuspendieren der Beads in 1 ml steriler 0,1% BSA / PBS. Pipette auf und ab, um Perlen zu resuspendieren. </li><li> Wiederholen Sie waschen drei weitere Male, für insgesamt vier Waschgänge. </li><li> Entfernen Rohr aus MPC und Resuspendieren der Beads in 500 ul 0,1% BSA / PBS. </li><li> Fügen Sie 10 ul Ratte anti-Maus-PECAM-1 (CD-31) Antikörper gegen das Rohr. </li><li> Tumble über Nacht bei 4 ° C im Kühlraum oder 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit steriler 0,1% BSA / PBS, wie in Schritt 1.2 viermal beschrieben. </li><li> Entfernen Rohr aus MPC und Resuspendieren der Beads in 200 ul 0,1% BSA / PBS. Shop anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. </li></ol> 2. Isolating Maus pulmonalen Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen , Bevor Sie fortfahren mit dem Gewebe Aufreinigungsprotokolls ist IACUC Ausschusses Genehmigung des Verfahrens erforderlich. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden: <ul><li> 15 ml von 1 mg / ml C / D-Lösung in DMEM. Filter mit 0,22 um Spritzenfilter und warm bis 37 ° C. </li><li> 50 ml konische Röhrchen mit 15 ml DMEM, speichern auf Eis </li><li> Isolation Media (IM) mit 20% FBS und 1x Penicillin / Streptomycin in DMEM </li><li> 2% Gelatine. Mix 2 g Rinder-Gelatine mit 100 ml Wasser dd, Autoklaven 15 Minuten und lagern bei 4 ° C. Warm bis 37 ° C vor der Beschichtung TC Flaschen zu verflüssigen. </li></ul></li><li> Anesthetize drei 6-8 Tage alte Jungtiere mit einer IP-Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Prüfen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie und sezieren Tiere eins nach dem anderen, wie folgt: Pin Welpen an Bord, genießen die Haut mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Haut vor den Brustbereich mit einer sterilen Schere Dissektion. Excise den Brustkorb zu Lungen freizulegen. </li><li> Aseptisch Verbrauchsteuern einzelnen Lungenlappen, man aufpassen, nicht zu sezieren die Bronchien und sichtbare Bindegewebe in der Lunge. Kombinieren Sie alle Lunge in eiskaltem DMEM. Euthanize die Welpen. </li><li> Arbeiten in der TC Kapuze, entfernen Lungenlappen aus DMEM, in einem 100 mm TC Schüssel und saugen überschüssiges DMEM. </li><li> Mit einer sterilen Schere, Hackfleisch das Gewebe fein schneiden ~ 100 mal. Transfer zum 15 ml warmes C / D-Lösung für die enzymatische Verdauung. Inkubieren 45 Minuten bei 37 ° C auf einem Rotator. </li><li> In den TC Haube absaugen verdaute Gewebe Suspension in eine 20 ml Spritze mit 14 g Kanüle befestigt und verreiben Klumpen in einer einzigen Zellsuspension, mindestens 12 mal. </li><li> Pass das Gewebe Suspension durch ein 70 um Zellsieb und waschen Sie das Sieb mit 15 ml IM, um die Verdauung zu stoppen. </li><li> Pellet Zellsuspension durch Zentrifugation bei 400x g für 5 Minuten. </li><li> Saugen Sie den Überstand und Pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Transfer Zellsuspension 5 ml Rundboden-Röhrchen aus Polystyrol und fügen 22,5 ul anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads. Tumble bei Raumtemperatur für 12 Minuten. </li><li> Coat einer T75-Kolben mit 2 ml 2% Gelatine und saugen überschüssige Gelatine. Lassen Gelatine innerhalb der TC Haube für etwa 30 Minuten vor dem Beschichten Zellen trocknen. </li><li> Nach bead Inkubation abgeschlossen ist (Schritt 2,10), Zellsuspension in drei gleich große Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt und Halterung an der MPC. </li><li> Wenn die Perlen haben sedimentiert mit dem MPC (~ 1 min), sammeln Überstand entfernen Rohr von MPC, waschen Perlen mit ca. 1 ml 0,1% BSA / PBS und dann remount auf der MPC. </li><li> Wiederholen Sie waschen viermal (insgesamt 5 Wäschen) </li><li> Resuspendieren Perlen in 1 ml VascuLife mit ENGS-Mv Leben Factors Kit und 1x Penicillin / Streptomycin (VL) pro Röhrchen gut mischen. </li><li> Platte auf einem vorbeschichteten T75 Kolben und bringen Gesamtvolumen in jedem Kolben bis 10 ml mit VL. </li><li> Ändern Medien am folgenden Tag, lassen Sie 1 Tag voller Wachstum und ändern Sie dann die Hälfte der Medien jeden zweiten Tag. Wenn die Zellen&gt; 70-80% konfluent oder mehr (in der Regel nach 3-4 Tagen der Kultur) sind, können sie mit anti-ICAM-2 Dynabeads sortiert werden. </li></ol> 3. Vorbereitung anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads <ol><li> Anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads werden verwendet, um weiter zu reinigen Zellen, die mit anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads und kultiviert, bis konfluenten ausgewählt wurden. Dieses Verfahren wird durchgeführt, wie für anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads (1, oben) beschrieben, außer dass anti-Maus-ICAM-2 (CD-102)-Antikörper anstelle von anti-PECAM-1-Antikörper verwendet. </li><li> Anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads können bei 4 ° C gelagert werden biszu 1 Monat. </li></ol> 4. Sortieren Mauslunge Endothelzellen mit anti-ICAM-2 Dynabeads <ol><li> Coat T75 Zellkulturflasche mit 2% Gelatine. </li><li> Saugen Sie das Medium aus dem konfluenten T75 Kolben mit Zellen und wäscht mit 8 ml PBS. </li><li> Absaugen PBS, 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA und lassen Zellen lösen (ca. 5 Minuten). Tippen Sie auf Flaschen leicht zu Hilfe Abnehmen. </li><li> Wenn die Zellen abgelöst haben, fügen Sie 2 ml IM zu Trypsin und kratzen Zellen zu hemmen, um alle verbleibenden adhärenten Zellen zu lösen. Transfer Zellsuspension auf eine 15 ml Tube und Spin-Down für 5 min bei 400x g </li><li> Saugen Sie die Medien und resuspendieren Zellpellet in 2 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Transfer in ein 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen und fügt 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads. Tumble für 12 Minuten bei RT. </li><li> Split Zellsuspension in zwei 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und montieren auf MPC. </li><li> Saugen Sie den Überstand nach Perlen für 1 Minute haben eingehalten werden. Entfernen Rohre von MPC und resuspendieren jedes Röhrchen in 1 ml 0,1% BSA / PBS. Montieren Sie auf MPC. </li><li> Wiederholen Sie waschen viermal (insgesamt 5 Wäschen). </li><li> Resuspendieren jedes Röhrchen mit 1 ml VL und führen Sie eine Zellzahl. </li><li> Platte Zellen bei 250-350K-Zellen pro T25 Kolben und / oder 750K-1 Millionen Zellen pro T75 Kolben. </li><li> Bringt Volumen 5 ml VL in T25 Flaschen und 10 ml in T75 Flaschen. </li><li> Ändern Medien jeden zweiten Tag. Die Zellen können für Experimente verwendet werden, wenn Kultur erreicht etwa 80% Konfluenz, in der Regel in 2-3 Tagen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse In der Regel nach 6-7 Tagen ab dem ersten Vorbereitung der Zellen, sind wir in der Lage, etwa 1,2 zu erhalten - 1,5 x 10 6 pulmonalen Endothelzellen aus drei 6-8 Tage alte Jungtiere. Zellen zeigen typische "Kopfsteinpflaster" Morphologie unter Lichtmikroskopie und zeigen, VE-Cadherin (CD144)-Färbung bei Zell-Zell-Verbindungen, die charakteristisch für Endothelzellen (Abbildung 1) ist. Mehrheit der MLECs ausdrückliche VE-Cadherin und VEGFR2 wie durch FACS-Analyse (Abbildung 2) gezeigt. Normalerweise benutzen wir sie für Experimente innerhalb von zwei Wochen nach der ersten MLEC Isolation. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Mikroskopische Analyse von konfluenten MLEC Monoschicht. (A) Lichtmikroskopische Bild zeigt Kopfsteinpflaster Morphologie der kultivierten Zellen typisch für Endothelzellen. Uniform runde Gebilde in den perinukleären Bereich von vielen Zellen befindet sich die magnetischen Beads für MLEC Isolierung verwendet. (B) Endothelial-spezifische VE-Cadherin an der Zell-Zell-Verbindungen wie gezeigt mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie lokalisiert. Bar ist repräsentativ für 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 FACS-Analyse von kultivierten MLECs mit Antikörpern, die spezifisch für Endothel-spezifischen Markern versehen:. VE-Cadherin (CD144) oder VEGFR2, wie angeklagt, von Phycoerythrin-konjugierten sekundären Antikörper folgte, bestätigt endothelial Identität der isolierten MLECs. Rote Linie zeigt Isotyp-spezifische Steuerung, zeigt grüne Linie anti-VE-Cadherin-oder Anti-VEGFR2 - spezifischen IgG-.

<ol><li>Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+endothelial+cell+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk.+Anat%22%5BJournal%5D)">The human endothelial cell in tissue culture.</a> Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).</li>
<li>Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circ Res. 100, 158-173 (2007).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).</li>
<li>Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).</li>
<li>Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+brain%2C+lung%2C+and+kidney%3A+expression+of+the+multidrug+resistance+P-glycoprotein+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).</li>
<li>Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+murine+inguinal+and+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues.</a> J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).</li>
<li>Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+vascular+endothelial+cadherin+%287B4%2Fcadherin-5%29%2C+an+endothelium-specific+cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).</li>
<li>Zachary, I., Gliki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+transduction+mechanisms+mediating+biological+actions+of+the+vascular+endothelial+growth+factor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family.</a> Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).</li>
<li>Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+heart-derived+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures%3A+isolation%2C+cloning+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization.</a> Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).</li>
<li>Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+angiogenesis%2C+endothelial+migration%2C+proliferation%2C+and+MAPK+signaling+in+Rap1b-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice.</a> Blood. 111, 2647-2656 (2008).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch Medical College of Wisconsin IACUC Ausschuss unter-Protokoll AUA # 00001206 eingestellt durchgeführt.

Mikrovaskulären ECs haben sich als nützliches Modell in vielen Bereichen der vaskulären Biologie und sind vermutlich mehrere physiologisch relevanten Studie (zB Angiogenese) als weitgehend untersucht HUVECs 3. Zuvor wurde berichtet, dass mikrovaskuläre Endothelzellen aus Niere, Herz, Haut, Netzhaut, Gehirn, Gliome, Fettgewebe und auch Lunge 2, 4-7, 10, 11 erzielt werden kann. Allerdings ist eine konsistente und zuverlässige Methode zur Isolierung von mikrovaskulären ECs weiterhin erforderlich. Das hier vorgestellte Verfahren ist eine Modifikation eines bereits veröffentlichten Protokoll 2, es unterscheidet sich von den meisten veröffentlichten Verfahren durch die Nutzung der Welpen anstelle von erwachsenen Tieren. Dies ist entscheidend für die Isolierung Erfolg als Zellen von jungen Tieren eine höhere Verbreitung Potential haben und Kulturen aus ihren Geweben stammen in der Regel höhere Anzahl der Zellen zu erhalten. Eine Woche alten Tiere scheinen optimal zu sein, aber jüngere Mäuse (4 Tage alten) können ebenfalls verwendet werden. Auch können höhere oder niedrigere Anzahl von Jungtieren bei Bedarf verwendet werden, wie wir schon bei der Isolierung MLECs von einem Welpen haben erfolgreich. Doch während die Skalierung nach oben oder unten die Isolierung Prozess muss Zelle Plattierungsdichte bleiben unverändert, wie dies auch von entscheidender Bedeutung für die Zellproliferation. Die 2-Schritt-Reinigungsverfahren MLECs mit magnetischen Beads konjugiert erste anti-PECAM-1 und als anti-ICAM-2-Antikörper ist viel effizienter bei der Gewinnung von reinem EG Kulturen als die zuvor beschriebenen einstufigen Reinigungsverfahren. Dieses Protokoll entfällt die Notwendigkeit, sehr aufwändige manuelle Techniken, Gradientenzentrifugation und weniger effizient FACS-Sortierung für das Verwerfen kontaminierenden Zellen wie Fibroblasten, Blutzellen und Zellen der glatten Muskulatur zu verwenden. Die daraus resultierende MLEC Bevölkerung kann für die in vitro Analyse der angiogenen Reaktion, Gefäßpermeabilität und Leukozyten-Transmigration, Wundheilung sowie biochemische Untersuchung von Signalwegen verwendet werden. Falls erforderlich, kann MLECs auf verschiedenen Oberflächen wie Fibronektin oder Gelatine-beschichtete Deckgläser für Immunfluoreszenz oder Elektroden-Arrays für die trans-endothelialen Widerstand (TER) Messungen beschichtet werden. Die erhaltenen Ergebnisse können direkt an die Phänotypen in vivo, was besonders wichtig ist im Zusammenhang mit der wachsenden Zahl von Knockout und transgene Mauslinien beobachtet verglichen werden. Die erfolgreiche Umsetzung dieses Verfahrens zur in vitro Analyse von zellulären Mechanismen, die Mängel in vivo zu beobachten, wurde bereits 12 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Scheren für Federschnitt</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Kanüle 14G</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 20 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads gegen Ratten-IgG</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>Magnetpartikelkonzentrator (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen murines PECAM-1 (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen murines ICAM-2 (CD-102)</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>Eine Stammlösung mit 100 mg/ml kann hergestellt und bei -20&amp;#x00B0;C gelagert werden</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Rinderskin-Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vasculife EnGS-Mv komplettes Kit (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 0,05 %</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 70 &amp;mu;m Nylon</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturgefäß 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kultivierung von pulmonaler endothelzellen aus neugeborenen mäusen

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelzellen stellen einen nützlichen Forschung Modell in vielen Bereichen der vaskulären Biologie. Seit der ersten Isolierung 1, haben menschliche Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) gezeigt werden, bequem, leicht zu beschaffen und Kultur, und damit sind die am häufigsten untersuchten Endothelzellen. Doch für die Forschung an Prozessen wie Angiogenese, Permeabilität oder viele andere konzentriert, sind mikrovaskuläre Endothelzellen (ECs) eine viel physiologisch relevante Modell-2-Studie. Darüber hinaus ECs isoliert von Knockout-Mäusen ein nützliches Werkzeug für die Analyse von Protein-Funktion ex vivo. Verschiedene Ansätze zu isolieren und Kultur mikrovaskulären ECs unterschiedlicher Herkunft sind bisher 3-7 berichtet worden, aber konsequente Isolierung und Kultivierung von reinem ECs immer noch ein großes technisches Problem in vielen Laboratorien. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll auf eine zuverlässige und relativ einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung Mauslunge Endothelzellen (MLECs). Bei diesem Ansatz Lungengewebe von 6 erhalten - bis 8-Tage alte Jungtiere zunächst in Stücke geschnitten wird, verdaut mit Kollagenase / Dispase (C / D)-Lösung und verteilt mechanisch in den Single-Zellsuspension. MLECS aus Zellsuspension unter Verwendung einer positiven Selektion mit anti-PECAM-1-Antikörper, konjugiert mit Dynabeads mit Hilfe eines Magnetic Particle Concentrator (MPC). Solche gereinigten Zellen auf Gelatine-beschichteten Gewebekultur (TC) Schalen kultiviert, bis sie konfluent geworden. Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen weiter gereinigt mit Dynabeads gekoppelt anti-ICAM-2 Antikörpers. MLECs mit diesem Protokoll erhaltenen weisen einen Pflasterstein Phänotyp, wie visualisiert Phasenkontrast-Lichtmikroskopie und ihre endothelialen Phänotyp bestätigt wurde mittels FACS-Analyse mit anti-VE-Cadherin-8 und anti-VEGFR2 9 Antikörper und Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin. In unseren Händen, das Zwei-Schritt-Isolierung Verfahren konsistent und zuverlässig liefert eine reine Population von MLECs, die weiter kultiviert werden können. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die Vorteile der wachsenden Zahl von Knockout-und transgenen Mäusen direkt in vivo Studien korrelieren mit den Ergebnissen von in vitro Experimenten an isolierten MLECs durchgeführt zu nehmen und so dazu beitragen, die molekularen Mechanismen der vaskulären Phänotypen in vivo beobachtet zu offenbaren.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelzellen stellen in vielen Bereichen der Gefäßbiologie ein nützliches Forschungsmodell dar. Seit ihrer ersten Isolierung 1 sind Endothelzellen aus der menschlichen Nabelschnurvene ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, pulmonale endotheliale Zellen aus neugeborenen Mäusen zu isolieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine homogene Zellsuspension aus frisch gewonnenen Lungen hergestellt wird. Anschließend wird das Gewebe fein zerkleinert und einer enzymatischen Verdauung unterzogen, gefolgt von einer Anreicherung endothelialer Zellen mithilfe magnetischer Kügelchen, die mit einem anti P chem one Antikörper konjugiert sind.Mithilfe der CETA-Kultur wird die Endothelzellpopulation gereinigt. Anschließend werden die Zellen mittels anti-I-chem-2-Antikörper-gekoppelter magnetischer Kügelchen isoliert und in einer mit Gelatine beschichteten Flasche amplifiziert. Die resultierenden primären pulmonalen Endothelzellen stammen überwiegend aus dem Mikrogefäßsystem und exprimieren spezifische Endothelzellmarker wie TERRIN und VEGF-R2.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der irna-Gen-Silenzierung besteht darin, dass sie die Nutzung transgener Mäuse zur Gewinnung genetisch veränderter endothelialer Zellen ermöglicht. Darüber hinaus stammen die mit dieser Technik gewonnenen endothelialen Zellen überwiegend aus dem Mikrogefässsystem und sind daher für bestimmte Bereiche der Gefäßforschung möglicherweise relevanter. Mit dieser Methode gewonnene endotheliale Zellen können helfen, zentrale Fragen der Gefäßbiologie zu beantworten, beispielsweise solche bezüglich der molekularen Mechanismen der Angiogenese und der vaskulären Permeabilität.Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die Schritte zur Gewinnung und Verdauung des Gewebes sowie zum Waschen der an die Kügelchen gebundenen Zellen schwer zu erlernen sind. Eine unsachgemäße Durchführung dieser Technik kann zu einer Kontamination mit nicht-endothelialen Zellen sowie zu einer geringen Zellausbeute und schlechtem Zellwachstum führen. Für dieses Dyna-Kügelchen-Protokoll bereiten Sie 50 Milliliter einer 0,1-%-BSA-Lösung in PBS vor und mischen diese durch Vortexen, bis die BSA vollständig gelöst ist; anschließend sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch eine 0,22-Mikron-Spritze filtrieren.Filtern Sie unter sterilen Bedingungen im Zellkulturwerk die Suspension mit Schafs-, anti-Ratte-IgG-Dyna-Perlen und geben Sie 200 µL in ein 1,5-mL-Einhorntestgefäß. Um die Perlen zu waschen, setzen Sie das Gefäß auf den magnetischen Partikelkonzentrator (MPC) und lassen Sie die Perlen eine Minute lang sedimentieren; saugen Sie anschließend den Überstand ab. Entfernen Sie das Gefäß vom MPC und resuspendieren Sie die Perlen in 1 mL steriler 0,1 %iger BSA in PBS.Wiederholen Sie diesen Waschschritt nach dem vierten Waschgang noch dreimal. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem MPC und Resus. Suspendieren Sie die Kügelchen in 500 Mikrolitern 0,1 % B-S-A-P-B-S.Fügen Sie 10 Mikroliter Ratten-Anti-Maus-pcam-1-Antikörper dem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln, wie zuvor gezeigt. Waschen Sie die Kügelchen viermal mit steriler 0,1 % BSA-PBS. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem MPC und resuspendieren Sie es.Die Perlen in 200 Mikrolitern von 0,1 % B-S-A-P-B-S-Lager. Diese Aufbereitung von anti P chem eins Antikörper-konjugierten Dyna-Perlen bei vier Grad Celsius. Um primäre Zellen zu erhalten, drei sechs bis acht Tage alte Welpen anästhesieren.Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie, indem Sie mit einer Pinzette in die Schwänze kneifen. Dissezieren Sie die Tiere nacheinander. Befestigen Sie zunächst das Jungtier an einem Brett und entfernen Sie die Haut aus dem Brustbereich.Entfernen Sie mit einer Schere den Rippenkorb, um die Lungen freizulegen. Entfernen Sie nun aseptisch die einzelnen Lungenlappen. Achten Sie darauf, die Bronchien oder das sichtbare Bindegewebe um die Lungen nicht zu verletzen.Vereinigen Sie alle Lungen in kaltem DMEM und euthanasieren Sie die Welpen endgültig. Gehen Sie nun zur Gewebekulturhaube. Entfernen Sie die Lungenlappen aus DMEM und geben Sie sie in eine 100 Millimeter große Gewebekulturschale. Überschüssiges DMEM mit sterilen Scheren abpipettieren und das Gewebe fein hacken. Schließlich das Gewebe durch etwa hundert Schnitte für die enzymatische Verdauung vorbereiten. Die Gewebeprobe in 15 Milliliter warmer Kollagenase-Disc-Raum-Lösung überführen und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator inkubieren. Klumpen des verdauten Gewebes mit einer 20-Milliliter-Spritze, die an eine Kanüle mit 14 Gauge angeschlossen ist, zu einer Einzelzell-Suspension dispergieren.Nun leiten Sie die Zellsuspension durch einen 70-Mikrometer-Zellsieb und spülen Sie den Sieb mit 15 Milliliter Im, um die Verdauungsreaktion zu stoppen. Zum Gewinnen der Lungenzellen bei 400 ×g für fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand abpipettieren. Anschließend das Zellpellet in drei Milliliter 0,1 % BSA-PBS resuspendieren und in ein fünf-Milliliter-Rundbodenzentrifugenrohr aus Polystyrol überführen.Um die Endothelzellen zu isolieren, 22,5 µL Anti-P-Chem-1-Antikörper-gekoppelter Dyna-Beads hinzufügen und 12 Minuten bei Raumtemperatur schwenken. In der Zwischenzeit einen T-75-Flasche mit zwei Millilitern 2 %iger Gelatin beschichten. Die überschüssige Gelatinlösung absaugen und etwa eine halbe Stunde lang in der Zellkulturbank trocknen lassen. Sobald die Inkubation der Beads abgeschlossen ist, die Zellsuspension gleichmäßig auf drei Fendor-Röhrchen aufteilen und am MPC befestigen.Spülen Sie die Dyna-Perlen mit dem MPC-System fünfmal mit jeweils etwa einem Milliliter 0,1 % BSA-PBS. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Perlen in einem Milliliter VAs Life pro Röhrchen. Mischen Sie gründlich, indem Sie alle Röhrchen vereinigen. Impfen Sie die Dyna-Perlen-Zellpräparation in den vorkodierten T-75-Flaschen aus und stellen Sie das Gesamtvolumen im Kolben mit VAs Life auf 10 Milliliter ein.Stellen Sie die Kolben nun in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie am folgenden Tag das Medium, lassen Sie einen vollständigen Wachstumstag verstreichen und tauschen Sie danach jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums aus, bis die Zellen zu mehr als 70 bis 80 % konfluent sind. Zur weiteren Reinigung der primären Zellkultur bereiten Sie wie zuvor gezeigt Antikörper-konjugierte Dyna-Beads vor, verwenden diesmal jedoch den CD102- und den Muse I Chem Two-Antikörper.Beschichten Sie außerdem einen T-75-Zellkulturgefäß mit 2 % Gelatine, wie zuvor gezeigt. Entnehmen Sie nun den T-75-Flasken mit den Zellen dem Inkubator. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die primären Zellen mit acht Millilitern PBS, anschließend aspirieren.Das PBS, zwei Milliliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und etwa fünf Minuten warten, bis sich die Zellen lösen. Das Gefäß leicht antippen, um die Zellablösung zu unterstützen. Zwei Milliliter IM hinzufügen, um die Trypsinwirkung zu hemmen, und verbleibende anhaftende Zellen abkratzen.Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten bei 400 ×g, aspirieren Sie das Medium ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Milliliter 0,1 % BSA in PBS. Übertragen Sie die Suspension in ein fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenröhrchen und geben Sie 10 Mikroliter Anti-ICAM-2-Dynabeads hinzu. Inkubieren Sie 12 Minuten bei Raumtemperatur, verteilen Sie die Zellsuspension anschließend auf zwei 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen und setzen Sie diese in das MPC-System ein.Wie zuvor waschen Sie die Kügelchen insgesamt fünfmal mit einem Milliliter 0,1 % BSA-PBS. Suspendieren Sie nun jede Probe in einem Milliliter VAs life und führen Sie eine Zellzählung durch. Schließlich impfen Sie die Zellen mit 800 bis 1000 K Zellen pro T-75-Flasche in 10 Milliliter VAs life aus. Stellen Sie die Flaschen in einen Zellkultur-Inkubator.Erneuern Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag, bis die Zellkulturen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen. Die gereinigten endothelialen Lungenzellen der Maus sind nun bereit, in Experimenten verwendet zu werden. Typischerweise ergibt eine Zellpräparation aus drei sechs bis acht Tage alten Würfen 1,2 bis 1,5 × 10⁶ pulmonale endotheliale Zellen nach einer Woche in Kultur.Wie erwartet zeigen diese primären endothelialen Zellen unter dem Lichtmikroskop eine kieselsteinartige Morphologie und weisen außerdem eine zusammenhängende VE-Färbung an den Zell-Zell-Kontakten auf. Mit diesem Protokoll exprimieren die Mehrheit der endothelialen Zellen aus der Mauslunge VE-kohärent und VEGF-R2, wie durch FACS-Analyse gezeigt wurde. Die rote Linie zeigt die isotypspezifische Kontrolle an, die grüne Linie zeigt das anti-VE- oder anti-VEGF-R2-spezifische IgG an.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, nur das Zielgewebe zu gewinnen, eine Überverdauung der Zellen zu vermeiden und die an die Beads gebundenen Zellen gründlich zu waschen. So erhält man endotheliale Zellen. Mithilfe dieses Verfahrens können funktionelle Assays im Bereich der vaskulären Biologie durchgeführt werden, um Reaktionen zu analysieren, die für die Angiogenese und die vaskuläre Permeabilität relevant sind.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre murine endotheliale Zellen mithilfe eines Chem-eins-Antikörpers und eines Chem-zwei-Antikörpers, die an Dyna-Beads gebunden sind, isoliert werden können, und wie reine endotheliale Zellkulturen gewonnen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Wir haben eine neue und reproduzierbare Technik zur primären Kulturen der Lungenarterie glatten Muskelzellen (PASMC) von Mäusen, so jung wie P7 isolieren entwickelt, wodurch eine bessere Erforschung der Signalwege in neonatalen glatten Muskelzellen Kontraktion und Relaxation beteiligt.

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns sind durch spezifische Verbindungsproteine miteinander verbunden, die eine hochregulierte Barriere zwischen Blut und dem Zentralnervensystem (ZNS) bilden, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen des murinen Gehirns, wie in diesem Protokoll beschrieben, ermöglicht detaillierte in vitro-Studien der BHS.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

Die vaskulären Endothelzellen spielen eine bedeutende Rolle bei vielen wichtigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus zu isolieren und zu erweitern, ohne spezielle Geräte zu verwenden. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung von Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

Dieses Protokoll wurde erstellt, um unsere Methode zur Isolierung von koronaren Endothelzellen von Mäusen zum Zwecke der Bildgebung oder zur Durchführung molekularbiologischer Experimente zu teilen.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.

Mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellisolierung und -reinigung aus Lungenproben

Dieses Protokoll stellt eine auf Flusszytometrie basierende Methode vor, um lebensfähige alveoläre Typ-II-Epithelzellen (AECII) aus neonatalen, juvenilen oder adulten Mauslungen (infiziert oder nicht infiziert) zu isolieren. Dieser Ansatz ermöglicht nachgelagerte molekulare und/oder funktionelle Studien von AECII, um deren Rolle während der Lungenentzündung und -infektion zu identifizieren.

Isolierung von alveolären Typ-II-Epithelzellen aus neonatalen, juvenilen und adulten Mauslungen, anpassungsfähig für infektiöse experimentelle Umgebungen

Ein Protokoll wird für die Isolierung und Primärkultur von mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC) aus neonatalem Maus-Hirngewebe vorgestellt, um ein robustes In-vitro-Modell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schrankfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erstellen.

Isolierung und Kultur mikrovaskulärer Endothelzellen im Maushirn

Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen. Diese Methode nutzt mechanische und enzymatische Gewebedissoziation sowie Antikörper-gekoppelte magnetische Beads zur Reinigung.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

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