JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 1:30 Min. • March 4th, 2025
Beginnen Sie mit einer vorfixierten, deparaffinisierten und rehydrierten koronalen Hirnschnitte, die Neuronen enthält, die Apoptose durchlaufen und durch Zelltod und DNA-Fragmentierung gekennzeichnet sind.
Um den apoptotischen Zelltod mit dem TUNEL-Assay nachzuweisen, behandeln Sie die Hirnscheibe mit dem Enzym Proteinase-K.
Proteinase-K dringt in die Neuronen ein und inaktiviert DNasen, wodurch der DNA-Abbau verhindert wird.
Spülen Sie die Scheibe ab, um alle Enzymreste zu entfernen.
Fügen Sie einen Puffer hinzu, der fluoreszierende Farbstoff-markierte Desoxyuridintriphosphate oder dUTPs und das terminale Desoxynukleotidyltransferase oder TdT-Enzym enthält, und inkubieren Sie dann.
In apoptotischen Neuronen mit reichlich DNA-Fragmenten bindet das TdT-Enzym diese fluoreszierenden dUTPs an die freien 3'-Hydroxylgruppen der DNA-Fragmente.
Im Gegensatz dazu bleibt die DNA gesunder Neuronen unmarkiert.
Färben Sie das Gewebe mit DAPI, einem Kernfarbstoff, der sowohl in gesunden als auch in apoptotischen Neuronen an die DNA bindet und ihre Zellkerne blau färbt.
Bei der Visualisierung bestätigen Neuronen, die sowohl blaue als auch grüne Fluoreszenz enthalten, den apoptotischen Zelltod im Hirngewebe.