JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 1:30 Min. • March 4th, 2025
Beginnen Sie mit Liquorproteinen, einschließlich phosphoryliertem Alpha-Synuclein, einem Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen.
Fügen Sie einen Ladepuffer hinzu, der ein Waschmittel, ein Reduktionsmittel und einen Tracking-Farbstoff enthält.
Erhitzen Sie, um die Proteine zu denaturieren, und laden Sie sie dann in ein SDS-PAGE-Gel.
Führen Sie eine Elektrophorese durch, um die Proteine nach Molekulargewicht in unterschiedliche Banden zu unterteilen.
Inkubieren Sie das Gel in einem Blotting-Puffer unter Rühren.
Dann übertragen Sie die Proteinbanden aus dem Gel auf die Membran.
Behandeln Sie die Membran mit einem Fixiermittel, um das Protein auf der Membran zu halten, und waschen Sie sie dann.
Inkubieren Sie mit einer Blockierungslösung, die Primärantikörper und Phosphatasehemmer enthält, um die Phosphorylierung von Alpha-Synuclein aufrechtzuerhalten.
Die Antikörper interagieren ausschließlich mit phosphoryliertem Alpha-Synuclein, und die blockierenden Reagenzien blockieren unspezifische Interaktionsstellen und waschen dann.
Führen Sie enzymkonjugierte Sekundärantikörper ein, die mit primären Antikörpern interagieren, und waschen Sie sie dann.
Fügen Sie ein chemilumineszierendes Substrat hinzu, das mit Enzymen interagiert und eine Chemilumineszenz erzeugt.
Eine chemilumineszierende Bande bestätigt das Vorhandensein von phosphoryliertem Alpha-Synuclein.