JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 1:22 Min. • March 4th, 2025
Nehmen Sie Gewebehomogenat aus einem Säugetiergehirn, das sowohl normale Prionenproteine als auch fehlgefaltete Prionenaggregate enthält, die für neurodegenerative Erkrankungen verantwortlich sind.
Inkubieren Sie mit einem proteolytischen Enzym, um die normalen Prionen zu verdauen, wobei die resistenten Aggregate intakt bleiben.
Behandeln Sie die Aggregate mit einem denaturierenden Puffer bei hoher Temperatur, um die Proteine zu linearisieren und eine gleichmäßige negative Ladung zu erzeugen.
Laden Sie die Probe auf ein Elektrophorese-Gel und trennen Sie die Proteine in Banden, was das Vorhandensein von Aggregaten bestätigt.
Übertragen Sie die getrennten Proteine mit Hilfe eines elektrischen Feldes auf eine Membran.
Inkubieren Sie die Membran in einer Blockierungslösung, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren.
Inkubieren Sie mit Peroxidase-Enzym-markierten Antikörpern, die spezifisch an die Prionenaggregate binden.
Waschen Sie die Membran, um ungebundene Antikörper zu entfernen und unspezifische Signale zu minimieren.
Fügen Sie ein chemilumineszierendes Substrat und ein Oxidationsmittel hinzu, damit die Peroxidase das Substrat oxidieren und Licht erzeugen kann.
Messen Sie die Lichtintensität, um fehlgefaltete Prionen im Homogenat zu quantifizieren.