JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 1:22 Min. • March 4th, 2025
Beginnen Sie mit einem menschlichen Gehirngewebe in einem Lysepuffer.
Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Homogenisator, um Proteine freizusetzen, einschließlich Glutaminsäure-Decarboxylase oder GAD-Enzymisoformen, die für die Gehirnfunktion unerlässlich sind.
Inkubieren Sie das Homogenat auf Eis und zentrifugieren Sie dann, um die Rückstände zu pelletieren. Sammeln Sie den proteinhaltigen Überstand.
Fügen Sie einen Ladepuffer hinzu, der ein Detergens und ein Reduktionsmittel enthält, um die Proteine zu denaturieren.
Laden Sie diese Probe und einen molekularen Marker auf ein Gradienten-SDS-PAGE-Gel und eine Elektrophorese, um die Proteine in unterschiedliche Banden zu unterteilen.
Tupfen Sie die Proteine aus dem Gel auf eine Membranfolie.
Fügen Sie einen Blockierungsagenten hinzu, um unspezifische Bindungen zu verhindern.
Inkubieren Sie mit GAD-Isoform-spezifischen Primärantikörpern, die an ihre rezeptiven GAD-Isoformen binden.
Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Inkubieren Sie mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern.
Waschen Sie die Proteinbanden erneut und visualisieren Sie sie auf einem bildgebenden System.
Detektieren Sie die GAD-Banden durch Fluoreszenz und bestätigen Sie ihre Molekulargewichtsunterschiede mit dem Marker.