Manipulation von Neuralplattenzellen durch In-utero-Nanoinjektion in einem embryonalen Mausmodell

Sichern Sie eine betäubte schwangere Maus mit ihrer freiliegenden Gebärmutter, die Präneurulationsembryonen enthält. In diesem Stadium ist die Neuralplatte offen und direkt dem Fruchtwasser ausgesetzt.

Positionieren Sie die ausgewählten Embryonen auf einer Petrischale mit einer elastischen Membran, um sie zu stabilisieren. Sichern Sie die Embryonen und tragen Sie Kochsalzlösung zur Flüssigkeitszufuhr auf.

Richten Sie die Ultraschallsonde über dem Embryo aus und messen Sie den Durchmesser der Fruchthöhle, um das optimale Injektionsvolumen zu berechnen.

Positionieren Sie eine Nanoinjektionsnadel mit einer lentiviralen Lösung mit hohem Titer in einem nahezu senkrechten Winkel über dem Zielembryo.

Injizieren Sie ein präzises kleines Volumen in die Fruchthöhle, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück und entfernen Sie die Ultraschallsonde.

Schieben Sie die Embryonen vorsichtig zurück in die Maus.

Das injizierte Lentivirus verschmilzt mit neuralen Plattenzellen und setzt sein genetisches Material frei, das eine reverse Transkription in die DNA durchläuft und in das Wirtsgenom integriert wird.

Dies ermöglicht eine stabile Genmanipulation in den Zellen der neuralen Platte und unterstützt potenzielle therapeutische Anwendungen.

Halten Sie mit einer Pinzette das Gewebe zwischen den Embryonen und ziehen Sie vorsichtig beide Gebärmutterhörner aus dem Bauch. Zählen und nummerieren Sie die Embryonen, entweder vom Eierstock bis zum Gebärmutterhals oder vom Gebärmutterhals bis zum Eierstock, auf beiden Seiten.

Schieben Sie dann mit einem feuchten Wattestäbchen vorsichtig alle Embryonen zurück in die Bauchhöhle, mit Ausnahme der ersten drei, die injiziert werden. Geben Sie dann einen Tropfen PBS auf eine elastische Membran, die auf die runde Mittelöffnung einer im Handel erhältlichen modifizierten Petrischale geklebt ist, und halten Sie sie unmittelbar über die Embryonen. Führen Sie eine geschlossene Pinzette in den Schnitt des Gummibandes ein, lassen Sie dann die Pinzette los, um den elastischen Schnitt zu öffnen, und tropfen Sie die Flüssigkeit auf die Embryonen.

Ziehen Sie mit einer Pinzette den den drei Embryonen entsprechenden Abschnitt der Gebärmutter durch das Gummiband und setzen Sie die Petrischale vorsichtig auf den Bauch der Maus. Befestigen Sie die Petrischale mit vier Tonfüßen über dem Bauch, um den Druck auf die Maus zu verringern und die Empfindlichkeit der Bildgebung für die Atmung und den Herzschlag der Maus zu verringern. Passen Sie anschließend mit einer Pinzette und einem feuchten Wattestäbchen die Gebärmutter und das Gummiband an, um sicherzustellen, dass das Gummiband um die Haut der Maus abgedichtet ist und ein Austreten von PBS verhindert wird.

Um die Gebärmutter zu fixieren, drücken Sie dann den Modellierzylinder rechts neben den Embryonen oder der Gebärmutter nach unten und geben Sie PBS in die Petrischale, bis die Embryonen und die Gebärmutter vollständig mit PBS bedeckt sind. Um die Aufzeichnung der Injektionen zu erleichtern, tauchen Sie die Ultraschallsonde in das PBS ein und stellen Sie die Maus oder den Operationstisch so ein, dass der erste Embryo mit der Ultraschallsonde ausgerichtet ist. Scannen Sie alle drei Embryonen und untersuchen Sie die Fruchthöhle

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Messen Sie dann mit dem Ultraschallgerät den Durchmesser der Amnionhöhle, um das entsprechende Injektionsvolumen zu bestimmen. Stellen Sie mit dem Injektionsregler die ermittelten Injektionsvolumina und die Injektionsgeschwindigkeit auf langsam ein, mit einer Injektionsrate von 23 Nanolitern pro Sekunde. Nachdem Sie die Nadel in das PBS abgesenkt haben, drücken Sie mit den Haupträdern am Schienensystem die Entleerungstaste des Nanoinjektor-Controllers, bis die Flüssigkeit die Nadelspitze erreicht.

Heben Sie dann die Nadel aus dem PBS und drücken Sie Injizieren, um zu überprüfen, ob ein Tropfen mit dem ungefähren gewünschten Volumen entladen wird. Senken Sie die Nadel wieder in das PBS ab und bewegen Sie den Nanoinjektor mit dem Y-Ebenenrad am Mikromanipulator, um die Nadel mit der Ultraschallsonde und dem Embryo auszurichten. Stellen Sie den Nadelwinkel mit dem Injektionswinkelrad ein, um einen nahezu senkrechten Injektionswinkel relativ zur Gebärmutterwand zu gewährleisten.

Führen Sie dann mit dem Einspritzrad am Mikromanipulator die Nadel in einer Bewegung in die Fruchthöhle ein. Wenn die Nadelspitze aus dem Ultraschallbild verschwindet, bewegen Sie die Sonde nach vorne oder hinten, um die Nadel wieder in den Fokus zu bringen. Injizieren Sie dann das gewünschte Volumen, indem Sie die entsprechende Anzahl von Malen drücken.

Nachdem das erforderliche Volumen injiziert wurde, warten Sie 5 bis 10 Sekunden, bevor Sie die Nadel mit einer sanften Bewegung zurückziehen.

Heben Sie anschließend die Ultraschallsonde und die Nadel mit dem Mikromanipulator aus dem PBS und drehen Sie die Nadel vom Bediener weg, um Schäden und Verletzungen zu vermeiden.

Legen Sie den ersten und zweiten Embryo mit einer Pinzette zurück in den Bauch, indem Sie sie vorsichtig durch das Gummiband schieben.

Nachdem alle Embryonen mit optimaler Fruchthöhle injiziert wurden, schieben Sie die Embryonen und die Gebärmutter vorsichtig zurück in den Bauch der Maus.