Gentransfer in Schwann-Zellen des Ischiasnervs der Nagetiere mittels Elektroporation

Beginnen Sie mit einer betäubten neugeborenen Ratte, die auf ein Heizkissen mit freiliegendem Ischiasnerv gelegt wird.

Heben Sie die distale Stelle des Nervs an und injizieren Sie eine Plasmid-DNA-Lösung, die mit einem Farbstoff gemischt ist. Der Farbstoff hilft, die Plasmidabgabe zu verfolgen.

Platzieren Sie eine Pinzettenelektrode um den Nerv und halten Sie dabei einen kleinen Abstand zwischen den Elektrodenarmen aufrecht.

Führen Sie Kochsalzlösung in diesen Spalt ein, um die Stromleitung zu fördern.

Wenden Sie einen elektrischen Impuls an, der die Nervenfasern umgibt und transiente Membranporen in den Schwann-Zellen erzeugt. Kehren Sie dann die Elektrodenpositionen um und legen Sie einen zweiten elektrischen Impuls an. Dadurch wird der Eintritt der Plasmid-DNA durch die Poren verbessert.

Nach der Elektroporation versiegelt sich die Zellmembran wieder und fängt das Plasmid ein.

Reinigen Sie die Stelle, versiegeln Sie den Hautschnitt, desinfizieren Sie ihn und lassen Sie die Ratte sich erholen.

Später wird die Plasmid-DNA in den Zellkern transloziert und in die DNA der Schwann-Zellen integriert, was einen erfolgreichen Gentransfer ermöglicht.

Ziehen Sie vorsichtig mit einer Nadel an der distalen Seite des Nervs, um den freiliegenden Nerv anzuheben. Führen Sie die Mikropipette aus Glas in die distale Stelle des Nervs ein und injizieren Sie die DNA-Lösung, indem Sie leichten positiven Druck ausüben, bis der Nerv grün erscheint. Platzieren Sie als Nächstes eine Pinzetten-Platinelektrode etwa ein bis zwei Millimeter vom Nerv entfernt.

Füllen Sie den Spalt zwischen Elektrode und Nerv mit 0,9%iger Natriumchloridlösung. Wenden Sie mit einem Elektroporator elektrische Impulse an die Injektionsstelle an. Nach dem ersten Impulssatz drehen Sie die Elektrode um und legen einen weiteren Impulssatz an.

Reinigen Sie anschließend die Elektroporationsstelle mit 0,9%iger Natriumchloridlösung. Nach der Elektroporation den Schnitt mit Cyanacrylatkleber verschließen. Reinigen Sie dann die Wunde mit Povidon-Jod.

Nehmen Sie die Gesichtsmaske vom Tier und lassen Sie sie mindestens eine Stunde lang auf dem elektrischen Wärmer, damit sie sich vollständig von der Narkose erholen kann