Lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen zur epigenetischen Regulation der Alpha-Synuclein-Expression

Tauen Sie neurale Vorläuferzellen oder NPCs auf, die mit einem Kryoprotektivum in einem Wärmeblock gelagert wurden.

Diese NPCs exprimieren vermehrt Alpha-Synuclein, ein Schlüsselfaktor bei der Parkinson-Krankheit.

Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in ein Röhrchen mit warmem Basalmedium, um das Kryoprotektivum zu verdünnen.

Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in neuronalen Medien.

Geben Sie die Zellsuspension auf eine ECM-beschichtete Multiwell-Platte und inkubieren Sie, um die Zelladhäsion und -proliferation zu ermöglichen.

Fügen Sie lentivirale Vektoren hinzu, die Guide-RNA, eine deaktivierte Cas9-DNA-Methyltransferase und ein Antibiotikaresistenzgen enthalten.

Inkubieren, um den Eintritt des Virus, die reverse Transkription der viralen RNA, die Integration in das Wirtsgenom und die Transgenexpression zu erleichtern.

Die Guide-RNA leitet dCas9 zum Alpha-Synuclein-Gen, wo die Methyltransferase-vermittelte DNA-Methylierung die Alpha-Synuclein-Expression reduziert.

Ersetzen Sie das Medium durch antibiotikahaltige neuronale Medien, um transduzierte Zellen auszuwählen, während nicht transduzierte Zellen Apoptose durchlaufen.

Legen Sie ein Kryofläschchen mit MD NPC für zwei Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Block und geben Sie die aufgetauten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern warmem DMEM-F12.

Bei 300 g fünf Minuten zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern vorgewärmtem vollständigem N2B2-Medium. Geben Sie zwei Milliliter N2B27 in die Zellsuspension und plattieren Sie zwei Milliliter Zellen in jede Vertiefung der zuvor vorbereiteten BMM-beschichteten Sechs-Well-Platte.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% CO_2 über Nacht. Wenn MD-NPCs eine Konfluenz von 70 % erreicht haben, transduzieren Sie sie, indem Sie zwei Mikroliter Lentivirus-Guide-RNA d-Cas9-DNMT3A-Vektoren hinzufügen und die Platte vorsichtig schwenken. Nachdem die Zellen 16 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen wie zuvor inkubiert wurden, ersetzen Sie das N2B27-Medium 48 Stunden nach der Transduktion.

Fügen Sie N2B27 mit fünf Mikrogramm Puromycin pro Milliliter hinzu