Lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen zur epigenetischen Regulation der Alpha-Synuclein-Expression

Tauen Sie neurale Vorläuferzellen oder NPCs auf, die mit einem Kryoprotektivum in einem Wärmeblock gelagert wurden.

Diese NPCs exprimieren vermehrt Alpha-Synuclein, ein Schlüsselfaktor bei der Parkinson-Krankheit.

Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in ein Röhrchen mit warmem Basalmedium, um das Kryoprotektivum zu verdünnen.

Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in neuronalen Medien.

Geben Sie die Zellsuspension auf eine ECM-beschichtete Multiwell-Platte und inkubieren Sie, um die Zelladhäsion und -proliferation zu ermöglichen.

Fügen Sie lentivirale Vektoren hinzu, die Guide-RNA, eine deaktivierte Cas9-DNA-Methyltransferase und ein Antibiotikaresistenzgen enthalten.

Inkubieren, um den Eintritt des Virus, die reverse Transkription der viralen RNA, die Integration in das Wirtsgenom und die Transgenexpression zu erleichtern.

Die Guide-RNA leitet dCas9 zum Alpha-Synuclein-Gen, wo die Methyltransferase-vermittelte DNA-Methylierung die Alpha-Synuclein-Expression reduziert.

Ersetzen Sie das Medium durch antibiotikahaltige neuronale Medien, um transduzierte Zellen auszuwählen, während nicht transduzierte Zellen Apoptose du