In utero Virustransduktion bei einer Maus

Man nehme eine Mischung aus Virus, die ein gewünschtes Gen für die Transduktion enthält, und einen Tracking-Farbstoff in einem Puffer.

Aspiriere das Virus-Farbstoff-Gemisch in eine Kapillare mit feiner Spitze.

Nehmen Sie eine betäubte schwangere Maus mit einer rasierten Bauchregion.

Desinfizieren Sie die Haut mit Ethanol, gefolgt von einer Betadinlösung.

Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie, um die Bauchhöhle freizulegen, und legen Sie einen Paraffinfilm darüber.

Legen Sie die Gebärmutterhörner frei und gießen Sie Puffer darüber, um Trockenheit zu vermeiden.

Notieren Sie sich die Reihenfolge und Position der Embryonen. Passen Sie die Position des Embryos im Gebärmuttersack an, um Zugang zu den Injektionsstellen zu erhalten.

Injizieren Sie das Virus-Farbstoff-Gemisch in das Rückenmark und die Hirnventrikel.

Stellen Sie eine genaue Injektion sicher, indem Sie die Farbstoffverteilung visualisieren.

Setzen Sie die Gebärmutterhörner wieder in die Bauchhöhle ein und gießen Sie etwas Puffer ein.

Vernähen Sie die Bauchhöhle, gefolgt von der Haut.

Das injizierte Virus dringt in die Wirtszelle ein, setzt das Zielgen frei und ermöglicht dessen Expression.

Beginnen Sie damit, eine maßgeschneiderte Kapillarspitze mit viermal 10 to den 11 Viruspartikeln einer Adeno-assoziierten Virus-Typ-1-Beschichtung für das gewünschte Ziel zu laden und mit Fast Green Farbstoff auf ein Aspiratorröhrchen zu markieren. Geben Sie 15 Mikroliter der markierten Adeno-assoziierten Viruspartikel in die Kapillare.

Bestätigen Sie als nächstes, dass bei einer anästhesierten embryonalen Maus am 14.5. Tag eine fehlende Reaktion auf das Einklemmen der Zehen vorliegt, und desinfizieren Sie die Haut. Verwenden Sie eine gebogene gezackte Iriszange und eine gerade Wolframkarbidschere, um einen Hautschnitt entlang der Linea mediana zu machen. Greifen Sie mit einer geraden Dumont-Pinzette die Bauchwand, fahren Sie mit einer geraden Vannas-Schere entlang der Linea alba fort und legen Sie ein Stück gefensterten Paraffinfilm über die Bauchöffnung und verwenden Sie ein löffelartiges Gerät, um die Gebärmutterhörner freizulegen, ohne die Embryonen in den Hörnern zu beschädigen.

Nachdem Sie ein paar Tropfen 37 Grad Celsius heißes PBS auf die Gebärmutterhörner aufgetragen haben, untersuchen Sie die Embryonen auf Beschädigungen oder Missbildungen im Gebärmuttersack. Drehen Sie die Embryonen vorsichtig in ihren Säcken, bis die gewünschte Position für jede Injektion erreicht ist. Wenn die Embryonen an Ort und Stelle sind, injizieren Sie ein bis zwei Mikroliter der mit Fast Green gekennzeichneten Viruspartikellösung in jeden Embryo.

Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, setzen Sie die Gebärmutterhörner wieder in die Bauchhöhle ein und geben Sie ein paar Tropfen 37 Grad Celsius heißes PBS in den Bauch. Verwenden Sie dann Nähte der Größe Polyamid 6-0, um die Peritonealwand zu schließen, und Nähte der Größe Polyamid 3-0 und die hämostatische Zange von Halsted, um die Haut zu schließen.