Ein Assay zur Quantifizierung von anorganischem Polyphosphat in Bakterien

Anorganisches Polyphosphat (PolyP) ist ein lineares Phosphatpolymer, das an der bakteriellen Virulenz und Stressreaktion beteiligt ist und als zytoplasmatische Granula gespeichert wird.

Um PolyP zu quantifizieren, nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit steigenden Konzentrationen anorganischer Phosphatstandards.

Geben Sie gereinigten bakteriellen Poly-P-Extrakt in eine leere Vertiefung.

In jede Vertiefung wird ein Reaktionspuffer mit dem Exopolyphosphatase-Enzym gegeben und inkubiert.

Das Enzym spaltet PolyP in freies anorganisches Phosphat und wandelt es in eine quantifizierbare Form um.

Ein Nachweisreagenz mit Molybdat und Ascorbinsäure zugeben und inkubieren.

Molybdat reagiert mit Phosphat zu Phosphomolybdat-Komplexen, die durch Ascorbinsäure zu einem blau gefärbten Komplex reduziert werden.

Messen Sie die Absorption des farbigen Komplexes. Die gemessene Extinktion entspricht der blauen Farbintensität, die direkt proportional zur Phosphatkonzentration ist.

Erstellen Sie die Standardkurve und berechnen Sie den Phosphatgehalt der Probe, der den ursprünglichen PolyP-Gehalt der Bakterien widerspiegelt.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Standards, die null, fünf, 50 oder 200 mikromolares Kal