Ein Assay zur Quantifizierung von anorganischem Polyphosphat in Bakterien

Anorganisches Polyphosphat (PolyP) ist ein lineares Phosphatpolymer, das an der bakteriellen Virulenz und Stressreaktion beteiligt ist und als zytoplasmatische Granula gespeichert wird.

Um PolyP zu quantifizieren, nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit steigenden Konzentrationen anorganischer Phosphatstandards.

Geben Sie gereinigten bakteriellen Poly-P-Extrakt in eine leere Vertiefung.

In jede Vertiefung wird ein Reaktionspuffer mit dem Exopolyphosphatase-Enzym gegeben und inkubiert.

Das Enzym spaltet PolyP in freies anorganisches Phosphat und wandelt es in eine quantifizierbare Form um.

Ein Nachweisreagenz mit Molybdat und Ascorbinsäure zugeben und inkubieren.

Molybdat reagiert mit Phosphat zu Phosphomolybdat-Komplexen, die durch Ascorbinsäure zu einem blau gefärbten Komplex reduziert werden.

Messen Sie die Absorption des farbigen Komplexes. Die gemessene Extinktion entspricht der blauen Farbintensität, die direkt proportional zur Phosphatkonzentration ist.

Erstellen Sie die Standardkurve und berechnen Sie den Phosphatgehalt der Probe, der den ursprünglichen PolyP-Gehalt der Bakterien widerspiegelt.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Standards, die null, fünf, 50 oder 200 mikromolares Kaliumphosphat in 50 Millimolar pH 8 Tris-Hydrochlorid enthalten.

Aliquotieren Sie 100 Mikroliter jedes Phosphatstandards und 100 Mikroliter extrahierter PolyP-Proben in separate Vertiefungen mit einer durchsichtigen 96-Well-Platte. Bereiten Sie einen Mastermix vor, der pro Probe 30 Mikroliter 5X ScPPX-Reaktionspuffer, 19 Mikroliter Wasser und einen Mikroliter gereinigtes ScPPX enthält. Geben Sie 50 Mikroliter des Mastermixes in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.

Und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie am Tag der Detektion einen frischen Arbeitsstock der Detektionslösung vor, indem Sie 9,12 Milliliter Nachweislösungsbasis mit 88 Millilitern eines molaren Ascorbinsäures mischen und vor der Verwendung auf Raumtemperatur kommen lassen. Geben Sie 50 Mikroliter Nachweislösung zu jeder Probe und jedem Standard in die 96-Well-Platte.

Um die Farbentwicklung zu ermöglichen, inkubieren Sie die Platte etwa zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, um die Absorption bei 882 Nanometern zu messen, und berechnen Sie die Phosphatkonzentration jeder Probe im Vergleich zur Kaliumphosphat-Standardkurve. Wandeln Sie dann die Phosphatkonzentrationen in Nanomol von PolyP-abgeleitetem Phosphat in jedem Zelllysat um und normalisieren Sie den zellulären PolyP-Gehalt auf das gesamte zelluläre Protein, wie im Manuskript beschrieben.